Com o avanço da tecnologia e a conseqüente produção de equipamentos mais sofisticados, a microcirurgia vem ganhando cada vez mais espaço no campo da investigação experimental referente a recuperação de nervos periféricos. É sabido que no caso de uma simples secção do nervo, sem perda tecidual, a neurorrafia término-terminal é a técnica mais aconselhável. Porém, em uma situação onde ocorre perda de tecido nervoso ou, quando não se têm mais o coto distal do nervo, outras técnicas devem ser empregadas, mesmo porque, não se pode de forma alguma tracionar o nervo numa tentativa de coaptá-lo novamente. Assim várias técnicas de tubulização utilizando-se de materiais biológicos (vasos, nervos, músculos, pericárdio, veia e músculo combinado, moléculas de adesão, etc) ou não biológicos (tubos de polietileno, silicone, etc) estão sendo testados com resultados ainda insatisfatórios, principalmente sob o ponto de vista funcional. É sabido que em um trauma sem perda tecidual, numa neuropraxia, por exemplo, o nervo recupera espontaneamente de forma satisfatória. É sabido também que em um feixe vásculo-nervoso, o nervo periférico encontra-se em íntimo contato com a adventícia de artérias e veias. A adventícia dos vasos é constituída por tecido conjuntivo frouxo, rico em adipócitos. Assim, em um trauma, os neuritos oriundos do coto proximal do nervo lesado, ficam diretamente em contato com esses adipócitos. Seguindo este raciocínio, e com base em trabalhos anteriores onde foi usada veia preenchida com músculo esquelético a fresco como enxerto, decidimos testar a possibilidade de crescimento axonal por meio de enxerto venoso preenchido por tecido adiposo autólogo. Para tanto foi utilizada a veia jugular externa do rato preenchido com tecido adiposo in natura retirado das adjacências da referida veia, na tentativa de se recuperar o nervo ciático e um de seus ramos, o nervo fibular comum. A certificação do sucesso da recuperação do nervo foi feita por meio da análise dos nervos (Ciático e Fibular Comum), e dos músculos Extensor Longo dos Dedos (EDL) e Tibial Cranial (TC), sempre comparando com os respectivos grupos controles. Técnicas de microcirurgia, microscopia, morfometria, e análise fisiológica (foot print), além da utilização do Laser de Baixa Potência (LBP), foram empregadas nesta investigação. / With technology advance and the resultant production of more sophisticated equipment, microsurgery has been obtaining more attention in the experimental investigation field referred to peripheral nerves repair. It is know that in case of simple nerve section, without tissue loss, the end-to-side-neurorraphy is the most recommended technique. However, in each situation where nerve tissue loss occurs or, when there is no nerve distal stump anymore, other techniques should be used, precisely because the nerve cannot be put on traction to try nerve coaptation. Thus, many tubulization techniques which use biological materials (veins, nerves, muscles, pericardium, veins and muscles combined, adherence molecule) or non-biological materials (polyethylene tubes, silicon, among others) are being tested and the results has been unsatisfactory yet, especially concerning functional point of view. It is known that in trauma without tissue loss, like neuropraxy, for example, the nerve recovers spontaneously in a satisfactory way. It is also known that in a vascular-nervous bundle, the peripheral nerve is very closed to arteries and veins adventitious layer. The vein adventitious is built by weak conjunctive tissue, which is rich in fat cells. Thus, in a trauma, the neurites, derived from proximal stump of injured nerve, have direct contact with the fat cells. Following this argumentation and based on previous works that used vein fulfilled with fresh skeleton muscle as graft, we have decided to test the possibility of axon growth through vein graft fulfilled with autologous fat tissue. To achieve this, it was used rats external jugular vein fulfilled with in natura fat tissue removed from the adjacencies of the referred vein, in a trial to recover the sciatic nerve and one of its branches, the common peroneal nerve. The certification of successful nerve recovering was done through the analysis of nerves (Sciatic and Common Peroneal Nerve) and muscles (Extensor Digitorium Longus - EDL and Tibial Cranial Muscle TC), always comparing them with the respective control groups. Techniques of microsurgery, microscopy, morphometry and physiological analysis (foot print) were employed, besides the use of Low-Power Laser (LPL).

Com o avanço da tecnologia e a conseqüente produção de equipamentos mais sofisticados, a microcirurgia vem ganhando cada vez mais espaço no campo da investigação experimental referente a recuperação de nervos periféricos. É sabido que no caso de uma simples secção do nervo, sem perda tecidual, a neurorrafia término-terminal é a técnica mais aconselhável. Porém, em uma situação onde ocorre perda de tecido nervoso ou, quando não se têm mais o coto distal do nervo, outras técnicas devem ser empregadas, mesmo porque, não se pode de forma alguma tracionar o nervo numa tentativa de coaptá-lo novamente. Assim várias técnicas de tubulização utilizando-se de materiais biológicos (vasos, nervos, músculos, pericárdio, veia e músculo combinado, moléculas de adesão, etc) ou não biológicos (tubos de polietileno, silicone, etc) estão sendo testados com resultados ainda insatisfatórios, principalmente sob o ponto de vista funcional. É sabido que em um trauma sem perda tecidual, numa neuropraxia, por exemplo, o nervo recupera espontaneamente de forma satisfatória. É sabido também que em um feixe vásculo-nervoso, o nervo periférico encontra-se em íntimo contato com a adventícia de artérias e veias. A adventícia dos vasos é constituída por tecido conjuntivo frouxo, rico em adipócitos. Assim, em um trauma, os neuritos oriundos do coto proximal do nervo lesado, ficam diretamente em contato com esses adipócitos. Seguindo este raciocínio, e com base em trabalhos anteriores onde foi usada veia preenchida com músculo esquelético a fresco como enxerto, decidimos testar a possibilidade de crescimento axonal por meio de enxerto venoso preenchido por tecido adiposo autólogo. Para tanto foi utilizada a veia jugular externa do rato preenchido com tecido adiposo in natura retirado das adjacências da referida veia, na tentativa de se recuperar o nervo ciático e um de seus ramos, o nervo fibular comum. A certificação do sucesso da recuperação do nervo foi feita por meio da análise dos nervos (Ciático e Fibular Comum), e dos músculos Extensor Longo dos Dedos (EDL) e Tibial Cranial (TC), sempre comparando com os respectivos grupos controles. Técnicas de microcirurgia, microscopia, morfometria, e análise fisiológica (foot print), além da utilização do Laser de Baixa Potência (LBP), foram empregadas nesta investigação. / With technology advance and the resultant production of more sophisticated equipment, microsurgery has been obtaining more attention in the experimental investigation field referred to peripheral nerves repair. It is know that in case of simple nerve section, without tissue loss, the end-to-side-neurorraphy is the most recommended technique. However, in each situation where nerve tissue loss occurs or, when there is no nerve distal stump anymore, other techniques should be used, precisely because the nerve cannot be put on traction to try nerve coaptation. Thus, many tubulization techniques which use biological materials (veins, nerves, muscles, pericardium, veins and muscles combined, adherence molecule) or non-biological materials (polyethylene tubes, silicon, among others) are being tested and the results has been unsatisfactory yet, especially concerning functional point of view. It is known that in trauma without tissue loss, like neuropraxy, for example, the nerve recovers spontaneously in a satisfactory way. It is also known that in a vascular-nervous bundle, the peripheral nerve is very closed to arteries and veins adventitious layer. The vein adventitious is built by weak conjunctive tissue, which is rich in fat cells. Thus, in a trauma, the neurites, derived from proximal stump of injured nerve, have direct contact with the fat cells. Following this argumentation and based on previous works that used vein fulfilled with fresh skeleton muscle as graft, we have decided to test the possibility of axon growth through vein graft fulfilled with autologous fat tissue. To achieve this, it was used rats external jugular vein fulfilled with in natura fat tissue removed from the adjacencies of the referred vein, in a trial to recover the sciatic nerve and one of its branches, the common peroneal nerve. The certification of successful nerve recovering was done through the analysis of nerves (Sciatic and Common Peroneal Nerve) and muscles (Extensor Digitorium Longus - EDL and Tibial Cranial Muscle TC), always comparing them with the respective control groups. Techniques of microsurgery, microscopy, morphometry and physiological analysis (foot print) were employed, besides the use of Low-Power Laser (LPL).

Apesar do desenvolvimento da tecnologia envolvendo o campo da regeneração em nervos periféricos, ainda não existe uma técnica para recuperação do tecido nervoso que apresente resultados totalmente satisfatórios, fato que desperta o interesse de vários pesquisadores em todo mundo e representa um desafio para os cirurgiões que realizam procedimentos reconstrutivos e estéticos. Embora o enxerto autólogo de nervo seja a melhor alternativa para a recuperação de nervos periféricos lesados, as técnicas que envolvem o reparo tubular têm alcançado excelentes resultados através da utilização de materiais sintéticos e biológicos, sob a forma de tubos, no reparo de extensos segmentos nervosos. Hoje, através dos avanços da engenharia tecidual, novos materiais estão em desenvolvimento, com o objetivo de aliar características microscópicas às técnicas cirúrgicas existentes. O colágeno, que é sabidamente um elemento promotor da proliferação celular e do reparo tecidual, tem sido amplamente utilizado em estudos de regeneração nervosa. Da mesma maneira, o ácido poli-láctico-poli-glicólico (PLGA), um copolímero sintético, tem apresentado algumas características favoráveis ao processo de regeneração, como biocompatibilidade e propriedades mecânicas adequadas. Com o propósito de facilitar a regeneração nervosa quando ocorre perda tecidual, uma técnica já difundida pode ser destacada: o enxerto de veia invertida, em que a veia jugular externa é utilizada ao avesso, funcionando como um tubo, criando um microambiente para a regeneração nervosa, através da exposição de elementos fundamentais da camada mais externa do vaso (túnica adventícia). Neste trabalho, agregamos como diferencial a utilização de dois tipos de membranas, especialmente desenvolvidas para fins odontológicos, que visam neoformação óssea, em um estudo que visa à regeneração de um nervo periférico misto, o nervo isquiático. As membranas de colágeno e PLGA foram colocadas na região do enxerto, sob a forma de tubo, com o objetivo de recuperar um segmento de 10 mm do nervo referido. E, por fim, aliamos a utilização de um segmento de 5 mm da veia jugular externa como tecido de preenchimento dos tubos feitos com as membranas, na tentativa de verificar a eficácia das moléculas biológicas presentes neste vaso, porém agora sendo utilizadas diretamente dentro do enxerto. Após um período de 6 semanas, o grupo que apresentou o melhor resultado foi aquele em que foi utilizada a membrana de colágeno, na forma de tubo, preenchida com a veia jugular externa. Nesse grupo, o diâmetro médio das fibras mielínicas apresentou um valor médio de 5,8 µm e espessura média da bainha de mielina de 1,65 µm. Para o período de 12 semanas, entre os grupos analisados, o maior valor médio encontrado para o diâmetro foi de 5,64 µm e 1,31 µm para a espessura, sendo que este resultado foi apresentado pelo grupo em que se utilizou a membrana de PLGA sem preenchimento com a veia jugular. Embora os valores não sejam muito inferiores, nos dois períodos, ficaram abaixo dos valores encontrados nos grupos controle normais. Em suma, acreditamos que as membranas de colágeno e PLGA, associadas à técnica de tubulização, apresentam grande potencial para serem utilizadas na regeneração de nervos periféricos. / Despite the development of technology involved in peripheral nerve regeneration, there is no technique that presents a recovery of the nervous tissue with completely satisfactory results. This fact arouses interest of several researchers around the word. Although the autologous nerve grafting is the current gold standard for the repair of large nerve gaps, over the past decades the development of artificial nerve conduits has therefore been of great interest due to the excellent results achieved. Through the advances in tissue engineering, new materials, synthetic and biological, have been used for construct nerve guides. The collagen is one of the oldest natural polymers used as a biomaterial, and it is known as a promoter of cell proliferation and of tissue repair. In the same way, the synthetic copolymer, poly lactic-co-glycolic acid (PLGA), have been used for nerve regeneration, and it have shown some favorable characteristics to nerve repair such as stability, biocompatibility, and mechanical properties. With the purpose of facilitating the regeneration in large nerve gaps, the inside-out vein graft is a widespread technique, where the vein works as a conduit, and it provides a good microenvironment for axon regeneration through the exposition of some primordial elements of its adventitial layer. In this work, we join as a differential the use of two materials, specially developed for dental purposes, which are normally used to facilitate the osteogenesis, in a nerve regeneration study. We performed the surgical procedures in the sciatic nerve, with two types of membranes (PLGA and collagen), which were used as tubes, in order to promote the regeneration of this nerve. The collagen and PLGA membranes were used with the objective of a recovery in a 10-mm sciatic nerve gap model. These tubular implants were filled with a 5 mm segment of the jugular vein in order to verify the effectiveness of some biological molecules of the adventitia layer in the nerve regeneration. After 6 and 12 weeks the graft and the distal stump were observed under light microscopy. In each studied period, the diameters of the myelin fibers, and the thickness of the myelin sheaths of the regenerated axons were measured. After 6 weeks, the group which presented the best result was the group with the collagen membrane tube filled with the external jugular vein. In this group the diameter of the myelin fibers presented an average value of 5.8 µm and an average value of the thickness of the myelin sheaths of 1.65 µm. After 12 weeks, between all the groups, the best results were found in the group where the PLGA membrane unfilled with the external jugular vein was used as a nerve guide, which presented the average diameter of 5.64 µm, and the average thickness of 1.31 µm. Although the average values werent much lower than the values found in the controls, they were beneath than the normal groups. These results proved that the collagen and the PLGA membranes have a great potential to be used as artificial nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.

Apesar do desenvolvimento da tecnologia envolvendo o campo da regeneração em nervos periféricos, ainda não existe uma técnica para recuperação do tecido nervoso que apresente resultados totalmente satisfatórios, fato que desperta o interesse de vários pesquisadores em todo mundo e representa um desafio para os cirurgiões que realizam procedimentos reconstrutivos e estéticos. Embora o enxerto autólogo de nervo seja a melhor alternativa para a recuperação de nervos periféricos lesados, as técnicas que envolvem o reparo tubular têm alcançado excelentes resultados através da utilização de materiais sintéticos e biológicos, sob a forma de tubos, no reparo de extensos segmentos nervosos. Hoje, através dos avanços da engenharia tecidual, novos materiais estão em desenvolvimento, com o objetivo de aliar características microscópicas às técnicas cirúrgicas existentes. O colágeno, que é sabidamente um elemento promotor da proliferação celular e do reparo tecidual, tem sido amplamente utilizado em estudos de regeneração nervosa. Da mesma maneira, o ácido poli-láctico-poli-glicólico (PLGA), um copolímero sintético, tem apresentado algumas características favoráveis ao processo de regeneração, como biocompatibilidade e propriedades mecânicas adequadas. Com o propósito de facilitar a regeneração nervosa quando ocorre perda tecidual, uma técnica já difundida pode ser destacada: o enxerto de veia invertida, em que a veia jugular externa é utilizada ao avesso, funcionando como um tubo, criando um microambiente para a regeneração nervosa, através da exposição de elementos fundamentais da camada mais externa do vaso (túnica adventícia). Neste trabalho, agregamos como diferencial a utilização de dois tipos de membranas, especialmente desenvolvidas para fins odontológicos, que visam neoformação óssea, em um estudo que visa à regeneração de um nervo periférico misto, o nervo isquiático. As membranas de colágeno e PLGA foram colocadas na região do enxerto, sob a forma de tubo, com o objetivo de recuperar um segmento de 10 mm do nervo referido. E, por fim, aliamos a utilização de um segmento de 5 mm da veia jugular externa como tecido de preenchimento dos tubos feitos com as membranas, na tentativa de verificar a eficácia das moléculas biológicas presentes neste vaso, porém agora sendo utilizadas diretamente dentro do enxerto. Após um período de 6 semanas, o grupo que apresentou o melhor resultado foi aquele em que foi utilizada a membrana de colágeno, na forma de tubo, preenchida com a veia jugular externa. Nesse grupo, o diâmetro médio das fibras mielínicas apresentou um valor médio de 5,8 µm e espessura média da bainha de mielina de 1,65 µm. Para o período de 12 semanas, entre os grupos analisados, o maior valor médio encontrado para o diâmetro foi de 5,64 µm e 1,31 µm para a espessura, sendo que este resultado foi apresentado pelo grupo em que se utilizou a membrana de PLGA sem preenchimento com a veia jugular. Embora os valores não sejam muito inferiores, nos dois períodos, ficaram abaixo dos valores encontrados nos grupos controle normais. Em suma, acreditamos que as membranas de colágeno e PLGA, associadas à técnica de tubulização, apresentam grande potencial para serem utilizadas na regeneração de nervos periféricos. / Despite the development of technology involved in peripheral nerve regeneration, there is no technique that presents a recovery of the nervous tissue with completely satisfactory results. This fact arouses interest of several researchers around the word. Although the autologous nerve grafting is the current gold standard for the repair of large nerve gaps, over the past decades the development of artificial nerve conduits has therefore been of great interest due to the excellent results achieved. Through the advances in tissue engineering, new materials, synthetic and biological, have been used for construct nerve guides. The collagen is one of the oldest natural polymers used as a biomaterial, and it is known as a promoter of cell proliferation and of tissue repair. In the same way, the synthetic copolymer, poly lactic-co-glycolic acid (PLGA), have been used for nerve regeneration, and it have shown some favorable characteristics to nerve repair such as stability, biocompatibility, and mechanical properties. With the purpose of facilitating the regeneration in large nerve gaps, the inside-out vein graft is a widespread technique, where the vein works as a conduit, and it provides a good microenvironment for axon regeneration through the exposition of some primordial elements of its adventitial layer. In this work, we join as a differential the use of two materials, specially developed for dental purposes, which are normally used to facilitate the osteogenesis, in a nerve regeneration study. We performed the surgical procedures in the sciatic nerve, with two types of membranes (PLGA and collagen), which were used as tubes, in order to promote the regeneration of this nerve. The collagen and PLGA membranes were used with the objective of a recovery in a 10-mm sciatic nerve gap model. These tubular implants were filled with a 5 mm segment of the jugular vein in order to verify the effectiveness of some biological molecules of the adventitia layer in the nerve regeneration. After 6 and 12 weeks the graft and the distal stump were observed under light microscopy. In each studied period, the diameters of the myelin fibers, and the thickness of the myelin sheaths of the regenerated axons were measured. After 6 weeks, the group which presented the best result was the group with the collagen membrane tube filled with the external jugular vein. In this group the diameter of the myelin fibers presented an average value of 5.8 µm and an average value of the thickness of the myelin sheaths of 1.65 µm. After 12 weeks, between all the groups, the best results were found in the group where the PLGA membrane unfilled with the external jugular vein was used as a nerve guide, which presented the average diameter of 5.64 µm, and the average thickness of 1.31 µm. Although the average values werent much lower than the values found in the controls, they were beneath than the normal groups. These results proved that the collagen and the PLGA membranes have a great potential to be used as artificial nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration.

A tubulização tem sido considerada uma alternativa eficaz no reparo de lesões de nervos por permitir a aplicação local de fatores neurotróficos e facilitar estudos experimentais. A compreensão do mecanismo de ação no processo regenerativo é intrinsecamente dependente da identificação dos componentes moleculares ao longo dos processos degenerativo e regenerativo. A presente tese visa o estudo sequencial da identificação do perfil molecular da resposta imune no processo de regeneração de nervo entre duas técnicas microcirúrgicas: a tubulização látero-terminal (TLT) e a tubulização término-terminal (TTT). Ratas Wistar adultas foram submetidas à transecção bilateral do nervo fibular comum. Na técnica TLT: o nervo fibular foi seccionado e retirado 5mm de sua extensão, o coto proximal foi suturado na musculatura e um tubo de silicone vazio (6mm) foi interposto entre a lateral do nervo tibial (doador) e o coto distal do fibular. Na técnica TTT: o nervo fibular foi seccionado e retirado 5mm de sua extensão, e ambos os cotos foram suturados às extremidades do tubo de silicone vazio. Foram realizados os grupos experimentais: TLT convencional (TLT padrão), TLT com tubo fechado suturado a porção proximal (TLT F-P), TLT com tubo fechado suturado na porção distal (TLT FD), TTT convencional (TTT padrão), TTT com tubo fechado suturado ao coto proximal (TTT F-P), TTT com tubo fechado suturado ao coto distal (TTT F-D). O controle normal (grupo GN) foi o segmento de nervo retirado para a interposição do tubo. As análises foram realizadas em três tempos pós-cirurgia: 24 horas, 96 horas e 8 dias. As amostras foram processadas em teste comercial para identificação de anticorpos com intuito de determinar a intensidade de expressão de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento presentes no cone de crescimento dos diferentes grupos. Em 24h a expressão de citocinas foi similar entre os grupos, entretanto, o TLT apresentou maior número de quimiocinas expressas em relação ao TTT. O tempo de 96h foi o período com maior número de elementos que apresentaram aumento da expressão em ambos os grupos TLT e TTT, sendo o grupo TLT a apresentar número maior de quimiocinas e fatores de crescimento expressos. Em 8 dias, houve redução dos níveis de expressão de todos os elementos estudados em ambos os grupos, com exceção do CNTF que apresentou aumento de sua expressão no grupo TTT. Os grupos fechados proximais (TLT F-P e TTT F-P) apresentaram perfis de expressão distintos no tempo de 24h, não houve mudanças dos níveis de expressão de nenhum dos elementos do grupo TLT, sendo que, inversamente, o grupo TTT apresentou aumento da expressão de grande parte das proteínas estudadas. Em ambos os grupos TLT F-P e TTT F-P, os elementos investigados retornaram aos níveis basais de expressão em 96h e 8 dias. Os grupos fechados distais (TLT F-D e TTT F-D) apresentaram expressão mínima ou nenhuma dos elementos estudados. O presente estudo demonstrou que há diferenças quanto ao perfil molecular da resposta imune induzida por lesão de nervo entre as técnicas TLT e TTT. / Nerve tubulization has been considered an effective alternative to repair nerve damages due to allow the local application of growth factors and to facilitate experimental studies. The action mechanisms comprehension in nerve regeneration is intrinsically dependente of the molecular components identification over the degenerative and regenerative processes. The aim of this study was the sequencial analysis of the molecular identification of the imune response in nerve regeneration process between two microsurgical repair techniques: the end-to-side tubulization (EST) and the end-to-end tubulization (ETE). Bilateral transection of the common fibular nerve was done in adults female Wistar rats. EST model: the fibular nerve was sectioned and 5mm from his extension was removed, the proximal stump was sutured in the musculature and an empty silicone tube (6mm) was interposed between the lateral portion of the intact tibial donor nerve and the fibular nerve distal stump. ETE model: the fibular nerve was sectioned and 5mm from his extension was removed, both stumps were sutured to the silicone tube extremities. The experimentals groups done: EST conventional (EST standard), EST with closed tube sutured on the proximal portion (EST C-P), EST with closed tube sutured on the distal portion (EST C-D), ETE conventional (ETE standard), ETE with closed tube sutured on the proximal stump (ETE C-P), ETE with closed tube sutured on the distal stump (ETE C-D). The normal control (NG group) was the nerve extension removed to the tube interposition. The analyzes were performed in three times: 24 hours, 96 hours and 8 days. The samples were precessed on an antibody arrays to determine the expression intensity of cytokines, chemokines ans growth factors in the growth cone of the diferente groups. On 24h the cytokine expression was similar between groups, however, the ETE group presented a higher number of the expressed chemokines than ETS. The time 96h was the period with higher number of elements that presented increased expression in both groups EST and ETE, being the group ETS to presents higher number of the chemokines and growth factors expressed. In 8 days there was expression levels reduced of the all studied elements in both groups, with the exception of CNTF that presented increased expression on ETE group. The proximals closed groups (ETS C-P and ETE CP) presented different expression profiles on the time of 24h, there were no changes in the expression levels of any of the elements of the ETS group, whereas, conversely, the ETE group showed increased expression of a large part of the proteins studied. In both groups ETS C-P and ETE C-P, the investigated elements returned to baseline levels of expression at the 96h and 8 days dates. The distal closed groups (ETS C-D and ETE CD) presented minimal expression or no expression of the studied elements. This study demonstrates that there are differences referring to the molecular profile of the immune response induced by nerve damage between the ETS and ETE models.

A tubulização tem sido considerada uma alternativa eficaz no reparo de lesões de nervos por permitir a aplicação local de fatores neurotróficos e facilitar estudos experimentais. A compreensão do mecanismo de ação no processo regenerativo é intrinsecamente dependente da identificação dos componentes moleculares ao longo dos processos degenerativo e regenerativo. A presente tese visa o estudo sequencial da identificação do perfil molecular da resposta imune no processo de regeneração de nervo entre duas técnicas microcirúrgicas: a tubulização látero-terminal (TLT) e a tubulização término-terminal (TTT). Ratas Wistar adultas foram submetidas à transecção bilateral do nervo fibular comum. Na técnica TLT: o nervo fibular foi seccionado e retirado 5mm de sua extensão, o coto proximal foi suturado na musculatura e um tubo de silicone vazio (6mm) foi interposto entre a lateral do nervo tibial (doador) e o coto distal do fibular. Na técnica TTT: o nervo fibular foi seccionado e retirado 5mm de sua extensão, e ambos os cotos foram suturados às extremidades do tubo de silicone vazio. Foram realizados os grupos experimentais: TLT convencional (TLT padrão), TLT com tubo fechado suturado a porção proximal (TLT F-P), TLT com tubo fechado suturado na porção distal (TLT FD), TTT convencional (TTT padrão), TTT com tubo fechado suturado ao coto proximal (TTT F-P), TTT com tubo fechado suturado ao coto distal (TTT F-D). O controle normal (grupo GN) foi o segmento de nervo retirado para a interposição do tubo. As análises foram realizadas em três tempos pós-cirurgia: 24 horas, 96 horas e 8 dias. As amostras foram processadas em teste comercial para identificação de anticorpos com intuito de determinar a intensidade de expressão de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento presentes no cone de crescimento dos diferentes grupos. Em 24h a expressão de citocinas foi similar entre os grupos, entretanto, o TLT apresentou maior número de quimiocinas expressas em relação ao TTT. O tempo de 96h foi o período com maior número de elementos que apresentaram aumento da expressão em ambos os grupos TLT e TTT, sendo o grupo TLT a apresentar número maior de quimiocinas e fatores de crescimento expressos. Em 8 dias, houve redução dos níveis de expressão de todos os elementos estudados em ambos os grupos, com exceção do CNTF que apresentou aumento de sua expressão no grupo TTT. Os grupos fechados proximais (TLT F-P e TTT F-P) apresentaram perfis de expressão distintos no tempo de 24h, não houve mudanças dos níveis de expressão de nenhum dos elementos do grupo TLT, sendo que, inversamente, o grupo TTT apresentou aumento da expressão de grande parte das proteínas estudadas. Em ambos os grupos TLT F-P e TTT F-P, os elementos investigados retornaram aos níveis basais de expressão em 96h e 8 dias. Os grupos fechados distais (TLT F-D e TTT F-D) apresentaram expressão mínima ou nenhuma dos elementos estudados. O presente estudo demonstrou que há diferenças quanto ao perfil molecular da resposta imune induzida por lesão de nervo entre as técnicas TLT e TTT. / Nerve tubulization has been considered an effective alternative to repair nerve damages due to allow the local application of growth factors and to facilitate experimental studies. The action mechanisms comprehension in nerve regeneration is intrinsically dependente of the molecular components identification over the degenerative and regenerative processes. The aim of this study was the sequencial analysis of the molecular identification of the imune response in nerve regeneration process between two microsurgical repair techniques: the end-to-side tubulization (EST) and the end-to-end tubulization (ETE). Bilateral transection of the common fibular nerve was done in adults female Wistar rats. EST model: the fibular nerve was sectioned and 5mm from his extension was removed, the proximal stump was sutured in the musculature and an empty silicone tube (6mm) was interposed between the lateral portion of the intact tibial donor nerve and the fibular nerve distal stump. ETE model: the fibular nerve was sectioned and 5mm from his extension was removed, both stumps were sutured to the silicone tube extremities. The experimentals groups done: EST conventional (EST standard), EST with closed tube sutured on the proximal portion (EST C-P), EST with closed tube sutured on the distal portion (EST C-D), ETE conventional (ETE standard), ETE with closed tube sutured on the proximal stump (ETE C-P), ETE with closed tube sutured on the distal stump (ETE C-D). The normal control (NG group) was the nerve extension removed to the tube interposition. The analyzes were performed in three times: 24 hours, 96 hours and 8 days. The samples were precessed on an antibody arrays to determine the expression intensity of cytokines, chemokines ans growth factors in the growth cone of the diferente groups. On 24h the cytokine expression was similar between groups, however, the ETE group presented a higher number of the expressed chemokines than ETS. The time 96h was the period with higher number of elements that presented increased expression in both groups EST and ETE, being the group ETS to presents higher number of the chemokines and growth factors expressed. In 8 days there was expression levels reduced of the all studied elements in both groups, with the exception of CNTF that presented increased expression on ETE group. The proximals closed groups (ETS C-P and ETE CP) presented different expression profiles on the time of 24h, there were no changes in the expression levels of any of the elements of the ETS group, whereas, conversely, the ETE group showed increased expression of a large part of the proteins studied. In both groups ETS C-P and ETE C-P, the investigated elements returned to baseline levels of expression at the 96h and 8 days dates. The distal closed groups (ETS C-D and ETE CD) presented minimal expression or no expression of the studied elements. This study demonstrates that there are differences referring to the molecular profile of the immune response induced by nerve damage between the ETS and ETE models.

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:33:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maturana_LuizGabriel_M.pdf: 2526914 bytes, checksum: 3d865f49f9fe14bd6f32ac9c00fc5846 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A axotomia periférica é uma lesão que resulta na perda de continuidade do nervo lesado. No sentido de repará-la, foram desenvolvidas diversas técnicas, entre elas o autoenxerto e a tubulização com próteses de polietileno e biorreabsorvíveis. Esta última tem a vantagem de ser confeccionada com a dimensão e forma desejada, sustentar o processo regenerativo, orientando o brotamento axonal e sofrer degradação de acordo com tempo de implantação. Apesar da grande capacidade regenerativa do sistema nervoso periférico, há a dependência da expressão correta de fatores de crescimento e rearranjo dos componentes da matriz extracelular pelas células de Schwann. Um dos componentes presentes na matriz extracelular, o colágeno, pode ser produzido com organização supramolecular e ser utilizado no preenchimento de próteses biorreabsorvíveis. Devido às características positivas das próteses reabsorvíveis, a importância das células de Schwann e do colágeno, o objetivo do presente estudo foi investigar in vitro e in vivo a influência do colágeno com organização supramolecular em relação à regeneração nervosa periférica fazendo uso das técnicas de cultura purificada de células de Schwann e tubulização do nervo isquiático. No estudo in vitro foram cultivadas células de Schwann sobre o colágeno com organização supramolecular, sendo estas avaliadas através da imunocitoquímica e microscopia eletrônica de varredura. Os resultados revelaram uma cultura celular com alto grau de pureza, observados pela intensa marcação com o anticorpo anti-S-100. Além disso, observou-se que a concentração de células de Schwann foi menor no grupo com o colágeno com organização supramolecular, apesar das células de Schwann terem mantido a expressão de componentes da lâmina basal, bem como alterado sua morfologia para se ajustar na superfície do substrato. Para o estudo in vivo, foram utilizados ratos da linhagem Sprague Dawley, fêmeas e adultas divididas em 4 grupos: 1) TP - animais em que foi utilizada a prótese tubular de polietileno vazia (n=7); 2) TPCL - animais em que foi utilizada a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) vazia (n=5); 3) TPCLF - animais em que foi utilizada a prótese tubular constituída de policaprolactona (PCL) preenchida com um implante de colágeno com organização supramolecular (n=7); 4) AE - animais que receberam autoenxerto de nervo periférico (n=5). Os resultados in vivo foram estudados através da quantificação das fibras regeneradas, morfometria dos nervos regenerados e microscopia eletrônica de transmissão 60 dias pós-cirúrgico. Além disso, o estudo in vivo incluiu análises de imunoistoquímica e microscopia de polarização 60 dias pós-cirúrgicos onde, os espécimes utilizados foram divididos em 3 grupos: 1) normal - foram utilizados nervos isquiáticos normais (n=3); 2) TPCL - animais no qual foram utilizados a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) vazia (n=3); 3) TPCLF - animais no qual foram utilizados a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) preenchida com um implante de colágeno com organização supramolecular (n=3). Observaram-se, na quantificação dos axônios, valores significativamente maiores para o grupo AE em relação aos outros grupos. Também se destacam valores superiores observados nos grupos TPCL e TPCLF comparados ao grupo TP. Quanto à morfometria, merecem ênfase os valores obtidos na espessura da bainha de mielina que exibiu diferenças estatisticamente significativas, demonstrando melhor comportamento das células de Schwann na regeneração nervosa periférica para o grupo TPCLF. Os dados de microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de polarização nos permitem considerar que a organização geral do nervo e do microambiente apresentou um padrão com analogia voltado ao nervo isquiático ileso. Ainda, os resultados referentes à imunoistoquímica, utilizando como marcador o anticorpo anti-p75NTR, demonstraram que as células de Schwann estavam mais reativas durante o processo regenerativo no grupo TPCLF comparado aos grupos TPCL e nervo isquiático ileso. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicaram que o implante de colágeno com organização supramolecular influenciou/estimulou significativamente o comportamento das células de Schwann tanto in vitro como in vivo. / Abstract: The present study investigated in vitro and in vivo the influence of naturally supraorganized collagen on the peripheral nerve regeneration. In the in vitro study, Schwann cells (SCs) were seeded on naturally supraorganized collagen membranes and evaluated with immunocytochemistry and scanning electron microscopy. The results revealed that SCs kept the expression of basal lamina components and adjusted their morphology to populate the membrane surface. For the in vivo study, adult female Sprague Dawley rats were divided into 4 groups: 1) TP - animals that received an empty polyethylene tube (n=7); 2) TPCL - animals that received an empty polycaprolactone (PCL) tube (n=5); 3) TPCLF - animals in which a polycaprolactone (PCL) tube filled with a naturally supraorganized collagen fragment was used (n=7); 4) AE - animals in which the nerve repair was carried out with an autologous nerve graft (n=5). The in vivo results were examined by counting of myelinated axons, morphometrical analysis of regenerated fibers and transmission electron microscopy, 60 days after surgery. Moreover, the in vivo study included immunohistochemical analysis and polarization microscopy. In this case, the specimens were obtained from one of 3 groups: 1) normal - normal sciatic nerves (n=3); 2) TPCL - animals that received an empty polycaprolactone (PCL) tube (n=3); 3) TPCLF - animals in which the nerve repair was carried out with a polycaprolactone (PCL) tube filled with a naturally supraorganized collagen fragment (n=3). The counting of myelinated axons provided significantly higher values in the AE group as compared to the other groups. Also, TPCL and TPCLF groups displayed higher values when compared to TP group. Regarding the morphometrical analysis, myelin thickness was greater in TPCLF group, indicating a better SC response during the regeneration process. The data regarding transmission electron microscopy and polarization microscopy indicates that TPCLF group achieved a better reorganization of the regenerated nerve microenvironment, resembling the normal nerve morphology. The immunohistochemical results were reinforced by the anti-p75NTR labeling, that demonstrated more active SC in the TPCLF group. The present results indicate that the use of naturally supraorganized collagen positively influenced/stimulated peripheral nerve regeneration possibly by increasing the activity of SC inside the prosthesis. / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

This study presents an experimental model of an acute defect in a peripheral nerve to evaluate neural regeneration using a tubulization technique associated with the inoculation of autologous stem cells from bone marrow. A total of 12 New Zealand white rabbits underwent a bilateral dissection of the tibial nerve followed by repair with silicone tubulization. On the left tibial nerve of all animals, the tube was filled with autologous bone marrow-derived stem cells collected from the humerus. For control, using the same repair technique, tubes were filled with a NaCl solution in the right tibial nerve. After 30 days of observation, the animals were euthanized and a histological evaluation of the collected nerve segments was performed by staining with hematoxylin-eosin, luxol fast blue, and toluidine blue. From the results it is possible to conclude that the transplanted autologous stem cells associated with the tubulization technique present an advantage in the peripheral nerve regeneration process / Este estudo apresenta um modelo experimental de defeito agudo em nervo periférico para avaliação da regeneração nervosa mediante técnica de tubulização associada à inoculação de células tronco autólogas de medula óssea. No trabalho foram utilizados 12 coelhos Nova Zelândia albinos, submetidos à secção bilateral do nervo tibial e posterior reparo mediante utilização de câmara de silicone. Internamente à prótese de tubulização do nervo tibial esquerdo em todos os animais, foram inoculadas as células tronco autólogas de medula óssea, coletadas a partir do úmero. Como grupo controle (nervo tibial direito), mediante aplicação de mesma técnica de reparo, solução de NaCl foi administrada internamente à prótese. Após 30 dias de observação os animais foram eutanasiados e procedeu-se a avaliação histológica dos segmentos nervosos através das colorações de hematoxilina-eosina, luxol fast blue e azul de toluidina. Com os resultados, foi possível concluir que o transplante de células tronco autólogas associada à técnica de tubulização apresenta vantagens no processo de regeneração nervosa periférica

Problemas relacionados a lesões de nervos periféricos com consequentes perdas sensitivas e motoras tornaram-se frequentes no dia a dia da prática clínica e hospitalar, em consequência do aumento da violência urbana, dos acidentes de trânsito, acidentes profissionais e domésticos. Por esta razão, a busca por estratégias e técnicas que possam reparar a lesão nervosa e restabelecer a função do tecido lesado é importante e de grande valia no âmbito da saúde. Para reparar lesões nervosas com perda de tecido nervoso, várias técnicas cirúrgicas têm sido utilizadas, uma das técnicas mais comum é o uso do enxerto autógeno, mas técnicas alternativas têm sido propostas a fim de evitar as complicações ao local doador e acelerar o processo de regeneração nervosa como, por exemplo, a da tubulização. O uso desta técnica tem sido mais utilizado para o preenchimento dos tubos com substâncias que acelerem ou induzam o crescimento axonal. Baseado no exposto anteriormente pensou-se na realização desta pesquisa com o objetivo de verificar se uso de tubo de polietileno poroso preenchido ou não com tecido adiposo na técnica de tubulização alteraria a recuperação dos músculos sóleo (de contração lenta) e Extensor longo dos dedos (de contração rápida). Para isso foram utilizados 45 ratos (Rattus norvegicus),Wistar, machos, que foram divididos em cinco grupos, sendo, três controles, e dois experimentais. Nos grupos experimentais foram realizados a tubulização de polietilieno poroso preenchido ou não com tecido adiposo (GECP e GESP, respectivamente). Os tubos foram testados para avaliar a eficácia em reduzir a lacuna crítica de 10 mm do nervo isquiático. Os animais dos grupos experimentais foram sacrificados 150 dias após a cirurgia. Dos três grupos controles, dois não sofreram intervenção cirúrgica, e receberam o nome de inicial (GCI) e final (GCF) e foram sacrificados com 80 e 230 dias de vida respectivamente. E no outro grupo controle, denominado desnervado (GCD) os animais foram submetidos à secção do nervo isquiático. Antes do sacrifício os animais foram submetidos à análise funcional da marcha. Durante o sacrifício foram retiradas amostras dos músculos sóleo e Extensor longo dos dedos, que foram submetidas à coloração de Hematoxilina e Eosina, Tricrômico de Masson, e também a reações de m-ATPase e NADH-Tr. Imunomarcações foi utilizada para a expressão de Myod e miogenina. Os dados foram submetidos ao tratamento estatístico. Os resultados mostraram que nos animais dos grupos experimentais tiveram melhor recuperação muscular do que os dos animais desnervados e foi inferior quando comparado com o grupo controle final (GCF). Baseado nestes dados pode-se concluir que o uso do tubo de polietileno poroso com preenchimento de tecido adiposo interferiu positivamente na recuperação tanto do músculo sóleo quanto o extensor longo dos dedos. / Problems related to injuries of peripheral nerves with consequent sensory and motor losses are seen more frequently in daily clinical and hospital practice due to an increase in urban violence, traffic accidents, domestic and labour accidents. For this reason, the search for strategies and techniques that can repair nerve damage and restore function of damaged tissue is important and of great value in health care. To repair nerve damage with loss of nerve tissue, several surgical techniques have been used, one of the common techniques is the use of the autograft, but alternative techniques have been proposed to avoid complications to the donor site and accelerate the process of nerve regeneration, such as tubulization. The use of this technique has been further utilized by filling the tubes with substances that speed up or induce axonal growth. Based on the previous work, in this research we wanted to see whether tubilization with the help of porous polyethylene tube filled with and without adipose tissue alter the recovery of the soleus (slow twitch) and extensor digitorum longus (fast twitch) muscles. For this we used 45 male Wistar rats (Rattus norvegicus), who were divided into five groups, three control and two experimental. In the experimental groups, tubulization was performed using porous polyethylene filled with (GECP) and without adipose tissue (GESP). The conduits were tested for efficacy in bridging the critical gap length of 10 mm in sciatic nerves.The animals of experimental groups were sacrificed 150 days after surgery. Of the three control groups, two did not undergo surgery, and were named as (GCI) for Initial and (GCF) for final group in which the animals were sacrificed at 80 and 230 days old respectively. And another control group, called denervated (GCD), the animals were subjected to sciatic nerve section. Prior to sacrifice the animals were subjected to functional analysis of gait. During the sacrifice, samples were taken from soleus and extensor digitorum longus muscles, which were stained with Hematoxylin and Eosin, Masson\'s trichrome and were also subjected to reactions of m-ATPase and NADH Tr. Immunostaining was also utilised for the expression of MyoD and myogenin. The data were analyzed statistically. The results showed that animals of experimental groups have better muscle recovery than those of denervated animals however the recovery was inferior when compared with the final control group (GCF).Based on these data we can conclude that the use of porous polyethylene tube filled with adipose tissue had a positive influence on the recovery of both the soleus and extensor digitorum longus.

Avaliou-se o efeito do N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP) na regeneração de neurônios periféricos em animais adultos. O nervo ciático esquerdo de oito camundongos machos adultos da linhagem C57BL/6J foi seccionado e o coto proximal e distal foram ancorados no interior de um tubo de polietileno (TP) com diâmetro interno de 0,76 mm, mantendo-se uma distância de quatro mm entre os mesmos. Os animais foram divididos aleatória e eqüitativamente em dois grupos e receberam 2&micro;l de solução purificada de colágeno (Vitrogen&reg;2,4 mg/ml) (COL) ou colágeno e MDP na proporção de 1:1 obtendo-se uma concentração de 1 mM (COL/MDP). Outros quatro animais não operados serviram como controle de normalidade (NOR). Após quatro semanas, os TP com os cabos de regeneração (CR) no seu interior, foram coletados para determinação do número de axônios mielínicos e da média do diâmetro das fibras mielínicas regeneradas. Os resultados revelaram diferença significativa no número de axônios entre os grupos NOR (4355 ± 32), COL (1869 ± 289) e COL/MDP (2430 ± 223). Houve redução significativa no diâmetro das fibras mielínicas nos grupos que receberam as próteses tubulares (COL= 3,38 &micro;m ± 1,16 e COL/MDP= 3,54 &micro;m ± 1,16) quando comparados ao grupo NOR (6,19 &micro;m± 2,45). O gânglio da raiz dorsal L5 também foi removido e seccionado em série para a contagem e mensuração dos neurônios sensitivos. O número de neurônios não diferiu entre os grupos experimentais (COL = 564 ± 51 e COL/MDP = 514 ± 56), os quais apresentaram menor número de neurônios sensitivos em relação ao grupo não operado (NOR = 1097 ± 142). Os resultados indicam que a aplicação local do MDP estimula a regeneração de nervos em camundongos. / N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (MDP) was evaluated for its effect on the regenerating peripheral neurons in adult animals. The left sciatic nerve of nine male adult mice C57BL/6J was cut, the proximal and distal nerve stumps were inserted into a polyethylene tube (PT) with 0,76 mm inner diameter, leaving a four mm distance gap. Animals were randomly distributed into two groups and received 2&micro;l of purified preparation of collagen (Vitrogen&reg; 2,4 mg/ml) (COL) or collagen and MDP made up in 1:1 volume ratio, obtaining a 1 mM (COL/MDP) concentration. Other four non-operated animals served as controls (NOR). After four weeks, PT with the regenerated nerve cables (RC), were processed for total myelinated axon counts and myelinated fiber diameter. The results revealed significant difference (p<0.05) in the axons count among the groups NOR (4355 ± 32), COL (1869 ± 289) and COL/MDP (2430 ± 223). There was a significant reduction in the diameter of myelinated fibers in the operated groups (COL = 3,38 &micro;m ± 1,16 and COL/MDP = 3,54 &micro;m ± 1,16) when compared to non-operated animals (6,19 &micro;m ± 2,45). The L5 dorsal root ganglion (DRG) was also removed form the same mice and serially sectioned for sensory neurons count and measurement. No difference was found in the number of DRG neurons among the experimental groups (COL = 564 ± 51 and COL/MDP = 514 ± 56), which presented fewer sensory neurons compared to non-operated group (NOR = 1097 ± 142). The results indicate that the locally applied MDP stimulates peripheral nerve regeneration in mice.