No description available.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden mittels molekular-zytogenetischer Methoden die chromosomalen Aberrationen in c-myc aktivierten ARFnull- und INK4a/ARFnull-Mauslymphomen untersucht. Die zytogenetischen Ergebnisse wurden mit dem Therapieverlauf der Mäuse nach Cyclophosphamid-Behandlung verglichen. In den ARFnull-Lymphomen erkannten wir den Gewinn des Chromosoms 14 als einen Marker für gute und den Gewinn des Chromosoms 6 als Marker für schlechte Behandlungserfolge. Auf den Chromosomen 6 und 14 der Maus liegen demnach bisher unbekannte Gene, welche für die Wahl der Behandlungsmethode ARF-defizienter Tumore von entscheidender Bedeutung sind. Der zweite Teil der Arbeit befaßt sich mit Common Fragile Sites (CFS), die als "hot spots" für chromosomale Brüche und Umbauten in Tumorgenese und Karyotypevolution diskutiert werden. CFSs treten als seltene Lücken im Chromatin oder als partiell deletierte bzw. rearrangierte Chromosomen auf. Ihre Zahl wird durch Zugabe von Replikations-hemmenden Chemikalen, wie Aphidicolin (APC), erheblich gesteigert. Wir untersuchten die CFS-Expression in Lymphozytenkulturen der Mausstämme BALB/c und C57BL/6. Die APC-induzierten CFS-Häufigkeiten der Chromosomenbanden wiesen im Vergleich zwischen beiden Mausstämmen eine signifikante Korrelation und damit eine starke Konservierung auf. Ebenfalls wurde zwischen Maus / Mensch-syntenischen Bereichen eine Konservierung der CFS-Häufigkeiten detektiert. Die Tendenz zur CFS-Bildung ist also ein spezifisches Merkmal jedes chromosomalen Abschnitts, das evolutionär konserviert ist. Weiterhin wurden einzelne CFSs mit molekular-zytogenetischen Methoden genauer kartiert. Auf diese Weise beschrieben wir erstmals eines der zehn häufigsten CFSs menschlicher Lymphozyten, FRA7K, und erweiterten somit die Anzahl molekular charakterisierter humaner CFSs auf insgesamt 13. Für fünf dieser CFSs analysierten wir mittels FISH-Analyse die homologen Bereiche im Mausgenom hinsichtlich ihrer CFS-Expression. Die beobachteten Läsionen traten jeweils in exakt den entsprechenden Sequenzen auf. Vereint man diese fünf Beispiele (FRA2G/Fra2D, FRA7G/Fra6A3.1, FRA7H/Fra6B1, FRA7K/Fra12C1 und FRA9E/Fra4C2) mit bekannten Homologen aus der Literatur, so wurde für insgesamt acht CFSs eine Konservierung zwischen Mensch und Maus auf molekularer Ebene gefunden. Trotz zahlreicher Untersuchungen ist der zelluläre Mechanismus, der die Ausbildung von CFSs an spezifischen Stellen des Genoms bewirkt, bis heute weitgehend unklar. Bekannt ist, daß CFSs durch Replikationsinhibition induziert werden und in Metaphase-Zellen sichtbar werden, welche DNA-Replikations-Checkpoints unterlaufen haben.Sämtliche jüngeren Studien beschrieben Inseln erhöhter DNA-Helix-Flexibilität (Schwankungen im Biegungswinkel des Moleküls) in den Bereichen von CFSs. Wir berechneten die DNA-Helix-Flexibilität entlang der Sequenz für alle molekular kartierten humanen und Maus-CFSs sowie für stabile Kontrollregionen. Anders als in der Literatur beschrieben, fanden wir für Mensch und Maus, daß sich CFSs und Kontroll-DNAAbschnitte in ihrer Dichte an Inseln mit erhöhter DNA-Helix-Flexibilität nicht unterschieden. Nahezu alle Regionen der häufigen molekular charakterisierten CFSs umfassen große Gene, deren Exons mehr als 650 kb genomische Sequenz überspannen. Im Gegensatz dazu traten große Gene in den stabilen Kontrollregionen deutlich seltener auf. Öffentlich zugängliche RNA-Expressionsdaten dieser Gene zeigten, daß CFSs bevorzugt in Bereichen mit transkriptionell aktiven, großen Genen entstehen. Darauf und auf dem Wissen aus der Literatur begründen wir die Hypothese, daß eine Blockierung der DNAReplikationsgabel, vor allem in Bereichen großer transkriptionell aktiver Gene - eventuell begründet durch deren offenere Chromatinstruktur - und das anschließende Unterlaufen von Zellzyklus-Checkpoints an der Bildung von CFSs und damit in einem Anstieg von Doppelstrangbrüchen beteiligt sind.

Einleitung: Der seit über 30 Jahren ausgiebig erforschte Transkriptionsfaktor p53 besitzt offenbar Funktionen, die über seine bekannte und gut untersuchte Aktivität als Tumorsuppressor hinausgehen. So scheint er auch an der Regulation der menschlichen Lebenserwartung - über die Vermittlung einer allgemeinen physischen Robustheit - sowie der weiblichen Fertilität beteiligt zu sein. Insbesondere Primaten zeichnen sich durch eine vergleichsweise lange Lebenserwartung und eine lange reproduktive Phase aus. Ob p53 hier eine Rolle spielen könnte, ist unbekannt. Unsere Arbeitsgruppe entdeckte vor einigen Jahren das humane endogene Retrovirus-K (HERV-K) Protein Np9, dessen Gen sich in mehreren Kopien nur bei Menschen, Schimpansen und Gorillas findet. Weitere Untersuchungen wiesen außerdem darauf hin, dass Np9 an den Tumorsuppressor p53 zu binden vermag. Ziele der Untersuchungen: Es stellte sich also die Frage, ob die Funktion von p53 durch die Bindung an Np9 moduliert werden kann. Eine derartige Modulation des multifunktionellen Transkriptionsfaktors wäre natürlich auf Hominiden beschränkt. In der vorliegenden Arbeit sollten einige Teilaspekte der Interaktion von p53 und Np9 näher untersucht werden. Material und Methoden: Für die Bindungskartierung von p53 und Np9 wurden GST-Pulldown-Analysen durchgeführt. Die GST-Protein-Plasmide wurden in E.coli BL21 transformiert und nach Induktion mit IPTG exprimiert. Sie dienten als „Fängerproteine“ und waren dank ihres Glutathion-S-Transferase-tags in der Lage an GST-Sepharose-Kügelchen zu binden. Der putative Interaktionspartner als „Beuteprotein“ wurde in vitro translatiert und in diesem Zuge auch mit 35S radioaktiv markiert. Dann wurde er mit den an die Beads gebundenen GST-Proteinen inkubiert und anschließend die Proben auf ein SDS-Gel aufgetragen und aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend auf eine Membran übertragen und der Blot auf einen Radioaktivfilm aufgelegt, woraufhin die Protein-Protein-Bindungen anhand des radioaktiven Beuteproteins als Banden erkennbar waren. Abschließend wurde der Blot mit GST-Antikörper inkubiert, dann am Folgetag mit Anti-Mouse-Antikörper. Mittels ECL Substrat konnte nun die Bindung der GST-getaggten Proteine an die Sepharosebeads nachgewiesen werden. Für den Electrophoretic Mobility Shift Assay wurden verschiedene Versuchsansätze pipettiert, welchen nach einer Inkubationszeit das zuvor mit 32P radioaktiv markierte Oligonukleotid zugegeben wurde. Nach erneuter Inkubation wurden die Proben auf das nicht-denaturiende EMSA-Gel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Dabei wurden die Protein-Oligonukleotid-Verbindungen gemäß ihrer Ladung, Größe und Konformation getrennt. Die Gele wurden im Geltrockner getrocknet und direkt mit einer Verstärkerfolie auf den Radioaktivfilm in einer Radioaktivkassette aufgelegt. Ergebnisse: Zunächst war es notwendig, die Bindung der beiden Partner biochemisch zu kartieren. Dies geschah mittels der GST-Pulldown-Analyse, in der Fragmente der Proteine exprimiert, miteinander inkubiert und schließlich kopräzipitiert wurden. Es stellte sich heraus, dass p53 mit seinem C-Terminus an Np9 bindet. Np9 hingegen band mit seinen Aminosäureresten (aa) 1-64 (ohne den C-terminus mit den aa 65-74) an p53. Das Np9-Fragment 36-74 zeigte nur eine schwache Bindung an p53. Interessanterweise band das Np9-Fragment 36-64 stärker an p53 als Volllängen-Np9 (1-74), was auf eine die Interaktion hemmende Domäne im C-Terminus von Np9 hinweisen könnte. Um zu untersuchen, ob die Bindung von Np9 an den C-Terminus von p53 die p53-DNA-Interaktion beeinflusst, wurden Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass Np9-zumindest in vitro-durch Bindung an die regulatorische Domäne von p53 und in Anwesenheit des p53-aktivierenden Antikörpers PAb421 in der Lage war, die spezifische Bindungsfähigkeit von p53 an DNA zu erhöhen und somit seine Funktion als Transkriptionsfaktor zu unterstützen. Schlussfolgerungen: Die Resultate weisen also erstmals darauf hin, dass das nukleäre HERV-K Protein Np9 spezifisch in Hominiden eine p53-abhängige Tumorsuppressoreigenschaft aufweisen könnte. Weitere Untersuchungen-insbesondere in vivo-sind nun notwendig. Dies könnte auch als Forschungsgrundlage zu endogenen Retrovirusproteinen beim Pferd dienen.:1 Einleitung und Zielsetzung der Arbeit 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Der Tumorsuppressor p53 2 2.2 Das Kernprotein Np9 7 2.2.1 Retroviren 7 2.2.2 Endogene Retroviren 8 2.2.3 Humane endogene Retroviren 8 2.2.4 HERV-K 10 2.2.5 Das nukleäre Protein Np9 10 3 Material und Methoden 15 3.1 Material 15 3.1.1 Chemikalien 15 3.1.2 Puffer und Lösungen 17 3.1.3 Antikörper 21 3.1.4 Enzyme 22 3.1.5 Reaktionskits 22 3.1.6 Bakterienstämme 23 3.1.7 Kulturmedien 23 3.1.8 Oligonukleotide für EMSA 23 3.1.9 Größenstandards 24 3.1.10 Plasmide 26 3.2 Methoden 28 3.2.1 Nukleinsäuretechniken 28 3.2.2 Protein-Methoden 31 3.2.3 Prokaryonten 40 4 Ergebnisse 42 4.1 Interaktion zwischen Np9 und dem Tumorsuppressorprotein p53 42 4.2 GST-Pulldown 43 4.2.1 Klonierung für die GST-Pulldown-Analysen 43 4.2.2 Induktion der Proteinexpression 48 4.2.3 GST-Pulldown-Experimente 53 4.3 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) 57 4.3.1 Radioaktive Markierung der Sonden 58 4.3.2 EMSA-Experimente 58 5 Diskussion 63 6 Zusammenfassung 68 7 Summary 70 8 Literaturverzeichnis 72 Danksagung 86 Abbildungsverzeichnis 87 Tabellenverzeichnis 88 / Introduction: The transcription factor p53, extensively investigated for over 30 years, apparently has functions which exceeds his known and well examined activity as a tumor suppressor. It seems to be involved in the regulation of the human life expectancy – by providing a general physical robustness - as well as of the female fecundity. Primates too are characterized by a comparatively long life expectancy and long reproductive phases, yet the possible influence of p53 is unknown. Our research group has discovered some years ago the Np9 protein of human endogenous retrovirus K (HERV K), which is found in several copies only with humans, chimpanzees and gorillas. Other investigations by our group suggested that Np9 might be able to interact with the tumor suppressor p53. Objective of the investigations: To study whether the function of p53 can be modulated by the interaction with Np9. Such a modulation of the multifunctional transcription factor would of course be limited to hominids. In the present work some aspects of the interaction between p53 and Np9 were analysed. Materials and methods: For the mapping of the interaction of p53 and Np9, GST pulldown assays were carried out. The GST protein plasmids were transformed in E. coli BL21 and expressed after IPTG induction. They served as bait proteins and bound to GST sepharose beads because of their Glutathione S-transferase-tags. The putative interaction partner as a prey protein was translated in vitro and radioactively marked with 35S. After being incubated with the GST-proteins bound to the beads, the samples were transferred on a SDS gel and separated. The gel was transferred to a membrane and the blot was exposed to an X-ray film. Thus, the radioactively labelled prey protein forms bands that identify the protein-protein interaction. Finally the blot was incubated with GST antibody, then on the following day with anti-mouse antibody. Using ECL-substrate it was now possible to demonstrate that the GST-tagged proteins bound to the sepharose beads. For the Electrophoretic Mobility Shift Assay different samples were prepared and, after an incubation time, the oligonucleotide radioactively marked with 32P was added. After additional incubation it was transferred on non-denaturating EMSA gel and separated by electrophoresis. Thus the protein oligonucleotide conjugates were separated according to charge, size and conformation. The gels were dried in the gel dryer, transferred to a membrane and placed against an X-ray film in a cassette. Results: Initially a biochemical mapping of the binding of the two partners had to be carried out. This was done by means of the GST pulldown assay, in which fragments of the proteins were extruded, incubated together and finally co-precipitated. It turned out that the C-terminus of p53 bound to Np9. However, Np9 bound to p53 with his amino acid residues (aa) 1-64 (lacking the C-terminal aa 65-74). The Np9 fragment 36-74 showed only a weak binding to p53. Interestingly the Np9 fragment 36-64 was binding stronger to p53 than a full length Np9 (1-74), which could point to a C-terminal domain in Np 9 inhibiting the interaction. In order to examine whether the binding of Np9 to the C-terminal of p53 affects the interaction of p53 with DNA, Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSAs) were carried out. It could be shown that Np9 was able to raise the specific binding ability of p53 with DNA and to support therefore its function as a transcription factor, by binding to the regulatory domain of p53 in presence of the activating p53 antibody PAB421. Conclusions: The results show for the first time that, specifically in hominids, the nuclear HERV-K protein Np9 could have a tumor suppressing quality that is dependent on p53. Further investigations, in particular in vivo, are necessary. This could be the starting point for research on equine endogenous retrovirusproteins in horses.:1 Einleitung und Zielsetzung der Arbeit 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Der Tumorsuppressor p53 2 2.2 Das Kernprotein Np9 7 2.2.1 Retroviren 7 2.2.2 Endogene Retroviren 8 2.2.3 Humane endogene Retroviren 8 2.2.4 HERV-K 10 2.2.5 Das nukleäre Protein Np9 10 3 Material und Methoden 15 3.1 Material 15 3.1.1 Chemikalien 15 3.1.2 Puffer und Lösungen 17 3.1.3 Antikörper 21 3.1.4 Enzyme 22 3.1.5 Reaktionskits 22 3.1.6 Bakterienstämme 23 3.1.7 Kulturmedien 23 3.1.8 Oligonukleotide für EMSA 23 3.1.9 Größenstandards 24 3.1.10 Plasmide 26 3.2 Methoden 28 3.2.1 Nukleinsäuretechniken 28 3.2.2 Protein-Methoden 31 3.2.3 Prokaryonten 40 4 Ergebnisse 42 4.1 Interaktion zwischen Np9 und dem Tumorsuppressorprotein p53 42 4.2 GST-Pulldown 43 4.2.1 Klonierung für die GST-Pulldown-Analysen 43 4.2.2 Induktion der Proteinexpression 48 4.2.3 GST-Pulldown-Experimente 53 4.3 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) 57 4.3.1 Radioaktive Markierung der Sonden 58 4.3.2 EMSA-Experimente 58 5 Diskussion 63 6 Zusammenfassung 68 7 Summary 70 8 Literaturverzeichnis 72 Danksagung 86 Abbildungsverzeichnis 87 Tabellenverzeichnis 88

H-REV107-1 wird in normalen Geweben ubiquitär exprimiert, während die Expression in humanen Mamma-, Ovarial-, und Lungentumoren unterdrückt ist. H-REV107-1 hemmt das Tumorwachstum in vitro und in vivo. Die Expression und Regulation des H-REV107-1 Gens wurde in verschiedenen, humanen Zelllinien untersucht. In Tumor Zelllinien wird die H-REV107-1 Expression durch IFNgamma induziert Eine Korrelation der H-REV107-1 und der IRF1 Expression nach Induktion mit IFNgamma wurde gezeigt. H-rev107-1 konnte nach konditionaler IRF1 Expression, Proteinsynthese-unabhängig, nachgewiesen werden und ist ein direktes Zielgen von IRF1. Die H-rev107-1 Expression ließ sich durch Unterdrückung des MEK/ERK Signalwegs mit dem MEK1 Inhibitor PD98059 aktivieren. Dies bedeutet, dass H-REV107-1 durch mindestens zwei verschiedene Signalwege, IFNgamma und MEK/ERK, reguliert wird. Der in vitro amplifizierte H-REV107-1 Promoter enthält keine TATA-Box, sondern ein Initiator Element sowie, in dem für eine TATA-Box definierten Abstand, eine ATF2 Bindungsstelle. Die Inkubation von transient transfizierten Zellen mit TNF alpha, cAMP und IFN gamma steigerte die Luciferase Aktivität. Mit Hilfe von Deletions- und Mutationskonstrukten wurden die regulatorischen Bereiche des Promoters bestimmt. Eine Mutation der cRel-Bindungsstelle, potentiell über NFkappaB reguliert, resultierte in einer Luciferase Aktivität von nur 9% des Wildtyp Promoters. Die Mutation der CREB/ATF2 Bindungsstelle reduzierte die Luciferase Aktivität auf 37%. Die Ko-Transfektion eines NFkappaB Suppressor reduzierte die Luciferase Aktivität um 53%. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NFkappaB und ATF2 die H-REV107-1 Expression positiv regulieren. In einem EMSA wurde die Bindung von ATF2 an die CREB/ATF-2 Bindungsstelle gezeigt. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass H-REV107-1 durch eine IFNgamma induzierte, möglicherweise PKR vermittelte, Signalkette von den Faktoren IRF1 und ATF2 direkt, sowie von NFkappaB indirekt, reguliert wird. / The H-REV107-1 class II tumor suppressor gene is ubiquitously expressed in normal tissues and down regulated in human breast, ovarian and lung tumors. H-REV107-1 has the capacity to suppress growth of tumor cells in vitro and in vivo. H-REV107-1 is up regulated after treatment with IFN gamma. A NIH3T3 cell line harboring an estrogen inducible IRF.1/hER fusion protein showed a protein synthesis independent up regulation of H-rev107-1 expression after induction of IRF-1. H-rev107-1 is a direct target of IRF-1. Inhibition of the MEK/ERK pathway, using the MEK1 inhibitor PD 98059, leads to a restored expression of H-rev107-1. Therefore, H-REV107-1 can be a target of the MEK/ERK-pathway. Thus, H-REV107-1 is regulated by at least two different pathways. To understand the regulatory mechanisms of the expression of the H-REV107-1 gene, the putative promoter region was analyzed in silico. The sequence was amplified and cloned. Induction of the promoter constructs with TNF alpha, cAMP and IFN gamma increased the luciferase activity. Several deletions constructs and constructs with putative transcription factor binding sites mutated were used to narrow down the important regulatory elements of the promoter. The mutations of a cRel binding site and a CREB/ATF-2 binding site decreased the luciferase activity by 91% and 63%, respectively. Co transfection of the full length promoter construct with a repressor of NFkappaB activation, reduced the luciferase activity to 47%. As a result of the investigation H-REV107-1 is directly regulated by IRF-1 and probably indirectly regulated by NFkappaB and the MEK/ERK signaling pathway. In an Electro Mobility Shift Assay (EMSA), the binding of ATF-2 to the CREB oligonucleotid was demonstrated by the use of a specific antibody. The ATF.2 binding site in the posititon –30 bp - 23 bp of the human, TATA-less H-REV107-1 promoter replaces the TATA-like element, which can be found in the H-rev107-1 promoter of rat and mouse.