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Bien que plus de 40 millions d'individus aient été infectés depuis la description du virus en 1983, aucun vaccin efficace n'a encore été développé contre l'agent étiologique du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). Les échecs encourus lors des essais cliniques antérieurs résultent, entre autres, de la présence de réservoirs viraux, de la grande diversité du virus de l'immunodéficience de type 1 (VIH-1) et de sa capacité à s'évader de la réponse immunitaire. Mon projet de recherche vise à analyser la capacité d'une nouvelle préparation vaccinale à générer une réponse humorale anti-VIH. Cette stratégie est basée sur l'utilisation de pseudoparticules virales (VLPs, Virus-like particles) du VIH-1 constituées des polyprotéines virales Gag et Pol, de la protéine d'enveloppe virale, la gpl20 et de la protéine d'origine humaine CD40 ligand (CD40L). Le concept de cette nouvelle stratégie vaccinale est fondé sur des études antérieures démontrant l'efficacité de la molécule CD40L, lorsqu'additionnée au virus de l'immunodéficience simienne, à stimuler la production d'anticorps neutralisants et la sécrétion d'interleukine-12 (IL-12) laquelle induit l'activation des cellules dendritiques. L'hypothèse principale de ce projet est que l'incorporation de la molécule CD40L à la surface des VLPs du VIH-1 induit une réponse immunitaire spécifique plus forte contre le virus que les préparations vaccinales utilisant des pseudoparticules virales classiques. Les objectifs sont de produire efficacement des VLPs de VIH-1 ayant incorporées, ou non, le CD40L et d'analyser la capacité de ces différents types de pseudoparticules virales à stimuler les lymphocytes B. Malgré que la théorie sur laquelle est basé le projet supporte l'idée que les VLPs porteuses de CD40L stimulent efficacement la voie humorale de l'immunité en activant les lymphocytes B, les résultats obtenus n'ont pas permis de supporter cette hypothèse. En effet, les VLPs produites par transfection calcium-phosphate en cellules 293T n'ont pas incorporé de façon optimale la molécule CD40L à leur surface vu un assemblage intracellulaire déficient probable et n'ont subséquemment pas permis une stimulation efficace des lymphocytes B.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 provoque une infection définitive de l’organisme. Il entraine une déroute du système immunitaire depuis la primo-infection occasionnant ainsi, une déplétion massive des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Le DCIR (Dendritic Cell Immuno Receptor) qui constitue le socle de notre travail, est une lectine de type C. Il est exprimé sur les cellules myéloïdes comme les cellules dendritiques mais aussi sur les cellules B, les LTCD4 infectés par le VIH-1 et apoptotiques ainsi que sur les LTCD4 polarisés en Th17. Il constitue un facteur d’attachement et d’internalisation du virus dans la cellule dendritique. Il permet son transfert aux LTCD4 dans les organes lymphoïdes secondaires, jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse associée au VIH-1. En plus, le DCIR assure la régulation négative de la réponse cellulaire, favorisant ainsi la propagation et la réplication du virus au détriment de la réponse immunitaire contre le VIH-1. Le rôle que joue le DCIR est dépendant du sentier de signalisation induit à la suite de la phosphorylation des résidus tyrosine de son motif ITIM. Le blocage de DCIR par des inhibiteurs spécifiques pourrait empêcher cette phosphorylation et réduire l’attachement, l’internalisation et le transfert du virus. Nous avons montré que la stimulation des cellules dendritiques et des LTCD4 polarisés en Th17 avec un anticorps anti-DCIR générait un patron de phosphorylation des résidus tyrosine des protéines. De plus, les inhibiteurs de la portion extracellulaire du DCIR inhibent cette activation. Afin de développer une mesure plus directe de l’interaction de DCIR avec ces inhibiteurs, nous avons purifié le DCIR à partir des cellules Raji-CD4-DCIR. En conclusion, ce projet de maitrise montre que l’activation directe de DCIR peut être renversée par des inhibiteurs montrant ainsi leurs spécificités. De plus, le profil d’activation de DCIR est spécifique pour chaque type cellulaire. A long terme, l’inactivation de DCIR par des inhibiteurs efficaces pourrait être une stratégie thérapeutique capable d’inhiber l’infection et de préserver une réponse immunitaire efficace.

Plusieurs études ont démontré que le virus d'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) possède la propriété d’incorporer diverses protéines de la cellule-hôte. Certaines observations indiquent que ce processus d'incorporation est sélectif. Cependant, les mécanismes expliquant la sélectivité des protéines incorporées demeurent largement inconnus. Les travaux présentés ciblent l'identification du facteur responsable de l'incorporation sélective de la protéine cellulaire ICAM-1 par le VIH-1. Parallèlement, nous avons évalué la sensibilité des virus porteurs de l’ICAM-1 à l’action de l’inhibiteur de fusion, T-20. Un système de transfection et d'expression transitoire a été utilisé afin de produire des particules virales isogéniques avec ou sans l’ICAM-1, et de certains de ses variants. Ce système nous a permis de démontrer que le VIH-1 s’approprie la molécule d’adhésion ICAM-1 par un processus indépendant de l’enveloppe virale (Env), mais dépendant de la portion intracytoplasmique de l’ICAM-1. Cette incorporation serait dirigée par une interaction directe ou indirecte entre la molécule d’adhésion et le précurseur immature Gag du VIH-1. Par ailleurs, la présence de l’’ICAM 1 sur le VIH-1 augmente la résistance des virions à l’action du T-20 en accélérant la cinétique de fusion du virion. La présence de l’ICAM-1 à la surface des virions et son rôle dans le cycle réplicatif du VIH 1 sont très importants dans la pathogenèse du VIH-1. / INTRODUCTION Previous works have indicated that incorporation of surface glycoprotein into retroviruses such as the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is not a highly specific process since several cellular glycoproteins can be inserted within the mature viral particle. The mechanism(s) that govern the acquisition of such host constituents have remained so far elusive. OBJECTIVES We have examined the molecular basis, associate to ICAM-1 localization and structural viral proteins responsible for the selective incorporation of the adhesion molecule ICAM-1 within HIV-1. We also investigated whether sensitivity to the newly developed fusion inhibitor T-20 is affected by incorporation of the adhesion molecule ICAM-1 in HIV 1. METHODS We have first investigated the role played by the viral envelope (Env) of HIV-1 in the acquisition of host ICAM-1. The incorporation process of ICAM-1 was also investigated by using different ICAM-1 constructs in which both transmembranes and intracytoplasmic tails were modified. These investigations were performed in combination with virus capture and immunoprecipitation studies, Western blot, confocal microscopy analyses, and infectivity assays. We finally used laboratory isolates of HIV-1 (X4- and R5-tropic) either lacking or bearing ICAM-1 as well as clinical variants into infectivity tests to both evaluate their respective IC50 for the fusion inhibitor and to understand the mechanism of resistance bring by the presence of this host molecule. RESULTS Mutation in the matrix (MA) domain or on Env-deficient viruses produced either in immortalized or primary human cell lines does not affect the incorporation of ICAM-1 by HIV-1. However, the incorporation seems to be conducted by the cytosolic tail of ICAM-1. Further experiments suggested that there is an association – direct or indirect – between ICAM-1 and virus-encoded Pr55Gag. We also demonstrate that ICAM-1-bearing virions are more resistant to T-20 than isogenic HIV-1 particles lacking this host adhesion molecule probably based on a reduction of the kinetic window during which the viral envelope is sensitive to T-20. CONCLUSION This study represents the first demonstration that structural Gag polyproteins mediate the uptake of a host-derived cell surface constituent (ICAM-1) by interacting directly with its cytoplasmic domain or by interacting with a partner into the cytosol. This observation describes a new strategy by which HIV-1 can modulate its replicative cycle considering that insertion of ICAM-1 within nascent virions has been shown to affect virus life cycle and also the sensitivity to the newly develop class of inhibitor including T-20.

Chez les individus infectés par le VIH-1, nous retrouvons des particules virales dans le système nerveux central dès la phase aiguë de l'infection. De ce fait, plusieurs complications neurologiques peuvent émerger chez ces individus tels que des troubles neurocognitifs modérés, certaines déficiences neurocognitives asymptomatiques et même de la démence. De nombreuses recherches démontrent que la neuropathogénèse du VIH-1 est surtout reliée à la neuroinflammation plutôt qu'à la charge virale dans le système nerveux central. Plusieurs molécules proinflammatoires sont produites par les cellules neurologiques lorsqu'il y a infection par le VIH-1. Parmi celles-ci, nous retrouvons les eicosanoides tels que les leucotriènes (LTs) qui sont souvent présents dans le liquide cérébrospinal d'individus infectés. À ce jour, le rôle que peut jouer ces médiateurs lipidiques inflammatoires dans la pathogénèse du VIH-1 est méconnu. Nous nous sommes donc intéressés à mieux comprendre comment les LTs peuvent affecter l'infection du système nerveux central par le VIH-1. Dans une première étude, nous avons tenté de caractériser les interactions entre les LTs, les cellules microgliales et le VIH-1. Nous montrons que les LTs inhibent non seulement l'entrée virale, mais aussi les étapes précoces de l'infection qui suivent la fusion membranaire du VIH-1 dans les microglies. En effet, lorsque ces cellules sont traitées aux LTs, on observe une diminution significative du niveau d'ADN proviral dans les cellules microgliales résultant d'un blocage d'étapes de la replication virale après l'importation nucléaire de façon protéine kinase C (PKC)-dépendante. Dans le cadre d'un deuxième projet, nous avons étudié l'effet des LTs sur les astrocytes. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence la capacité des astrocytes stimulés par le leucotriène C₄(LTC₄) à induire la transmigration de lymphocytes T CD4+ infectées par le VIH-1 au travers d'un modèlew vitro de barrière hémato-encéphalique. De plus, nos résultats démontrent l'implication de la CX3CL1 à cet effet. Ainsi, cette étude décrit comment les LTs produits dans le système nerveux central peuvent contribuer à la neuroinvasion et l'infection du VIH-1 dans ce compartiment. Globalement, nos travaux permettent une mise en perspective du rôle des LTs dans la neuropathogénèse du VIH-1 et ouvre la voie vers de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Depuis sa découverte, le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) a causé la mort de 33 millions de personnes, et 36,7 millions sont actuellement infectées. Malgré l’existence des thérapies antirétrovirales, celles-ci ne conduisent pas à d’éradiquer le virus. En outre, il n’existe pas de vaccin. Les lymphocytes B, dont la fonction est de produire les anticorps sont dysfonctionnels au cours du VIH-1. Or la majorité des stratégies vaccinales se basent sur la production d’anticorps dépendante des cellules T CD4. Ainsi, la première partie de mon doctorat a été consacré à la compréhension de l’impact du VIH-1 sur les cellules T CD4 folliculaires auxiliaires (Tfh) essentielles à l’activation des lymphocytes B et à la production d’anticorps spécifiques, dans la rate l’organe majeur de la réponse des lymphocytes B. Dans la deuxième partie, j’ai analysé les cellules T CD4 mémoires, Tfh et les lymphocytes B dans les ganglions mésentériques: un site inducteur de la réponse immunitaire intestinale, qui alimente la lamina propria (site effecteur) de la muqueuse intestinale en cellules mémoires. Étant donné l’impossibilité d’étudier ces organes profonds en particulier en phase aiguë chez l’homme, j’ai utilisé le modèle du macaque rhésus infecté par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS). Les résultats de ces études montrent que l’évolution vers le SIDA est associée à une déplétion précoce des cellules Tfh et T CD4 mémoires dans la rate et les ganglions mésentériques. Concomitant à cela, je rapporte une déplétion des lymphocytes B mémoires dans la rate et un faible titre d’IgG anti-VIS dans le sérum. En plus, les cellules Tfh commutent leur phénotype d'effecteur mémoire vers celui de centrale mémoire associé à l’expriment de CD127 (récepteur de l’IL-7) et de T-bet (marqueur de cellules Th1). De plus, je montre que la déstructuration des organes lymphoïdes secondaires, ainsi que les cytokines environnementales comme l’IL-7 ou l’IL-27 peuvent contribuer au dysfonctionnement des cellules Tfh puisque ces dernières induisant les facteurs de transcription inhibiteurs des cellules Tfh tels que T-bet, Foxo1, Stat5 et KLF2. En conclusion, mes résultats permettent de mieux comprendre que le dysfonctionnement des lymphocytes B et l’immunodéficience dans la muqueuse intestinale sont associés à la déplétion soudaine des lymphocytes T CD4 mémoires et Tfh dans la rate et les ganglions mésentériques. Par conséquent, prévenir la perte de ces cellules pourrait être une approche thérapeutique et vaccinale prometteuse pour la neutralisation du virus et pour une meilleure immunité intestinale, afin d’empêcher la translocation bactérienne. / Since its discovery, HIV-1 has caused the death of 35 million people, and 36.9 million are living infected. Although researches have led to the development of antiretroviral therapies, which not only improve life expectation but also life quality of infected individuals, these therapies are not capable of eradicating the virus, and unfortunately there is no vaccine. The pathogenesis of HIV-1 is linked to a dysfunction of CD4 T cells that favors progression to AIDS. Therefore, given that most vaccines are based on T cell-dependent antibody production, the first part of my PhD research is devoted to understanding the impact of HIV-1 on CD4 T Follicular helper (Tfh) cells, which are essential for B cell activation and the production of specific antibodies. These cells are particularly crucial in the spleen, which is the major organ for B cell response. In the second part, I have analyzed the dynamics of memory CD4 T, Tfh and of B cells in mesenteric lymph nodes: an inductive site of the immune response that provides memory cells to the lamina propria (effector site) of the intestinal mucosa. Given the difficulties to study these deep organs, particularly during the acute phase in humans, I have used rhesus macaques infected with the simian immunodeficiency virus (SIV) to study the dynamics of Tfh cells. My results show an early depletion of splenic Tfh cells during the acute phase; a depletion that persists during the chronic phase within macaques in which the infection rapidly progresses to AIDS. Concomitantly, we report a depletion of memory B cells and low titers of anti-SIV IgG titers in these macaques. Furthermore, I observed a massive depletion of memory CD4 T, Tfh and B cells in mesenteric lymph nodes, as well as a phenotypic change of Tfh cells that become central memory cells associated with the upregulation of the expression of CD127 (IL-7 receptor). My results also show that environmental cytokines such as IL-7 and IL-27 contribute to their dysfunction as support the expression of transcription factors that inhibit Tfh cells such as T-bet, Foxo1 and Stat5. In conclusion, my results provide a better understanding of B cell dysfunction related to the early loss of the Tfh cells during HIV/SIV infection. Moreover, I hypothesize that the loss of immunity in the intestinal mucosa is due to the sudden depletion of memory CD4 T, Tfh and B cells in the mesenteric lymph nodes. Therefore, maintaining Tfh and memory CD4 T cells during the early phase of infection could be a promising therapeutic and vaccine approach for neutralizing HIV/SIV, as well as preventing bacterial translocation.

La molécule HLA-DR du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II) est fortement incorporée dans l'enveloppe virale du virus d'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). L'expression à la membrane cytoplasmique de cette même molécule est modulée à la baisse par la protéine virale Nef. D'autre part, Nef augmente l'expression de la chaîne invariante CD74, une autre protéine du CMH-II associée avec HLA-DR dans un complexe protéique immature. D'autres protéines accessoires virales, telles Vpu, interagissent avec le CMH-II. Vpu diminue l'expression de HLA-DR et interagit avec la portion intracellulaire de CD74. Cette étude a pour but de vérifier si les complexes immatures de CMH-II sont incorporés dans l'enveloppe virale du VIH-1. Elle veut aussi vérifier l'impact de la présence de Nef et de Vpu sur l'incorporation du CMH-II. La modulation à la baisse de HLA-DR et l'augmentation d'expression de CD74 induite par Nef ont été confirmées à la surface de lymphocytes T CD4+. La molécule CD74 représentant un complexe de CMH-II immature ne semble pas être incorporée dans l'enveloppe virale, peu importe la présence ou l'absence de Nef et de Vpu lors de l'infection. La présence de Nef ne semble pas influencer l'incorporation de HLA-DR qui demeure toujours fortement incorporée. Vpu semble important pour l'incorporation du HLA-DR, puisqu'un virus sans Vpu incorpore nettement moins de HLA-DR. Un mutant déficient en phosphorylation sur deux serines de Vpu, pour sa part, semble permettre une incorporation partielle de cette même molécule. Ces résultats semblent indiquer que HLA-DR est incorporée selon son stade de maturation et que Vpu est essentielle à l'incorporation de HLA-DR.