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Dengue e imunologia inataestudo dos fatores antivirais e citotóxicos em células dendríticas plasmacitoides e células NK durante a infecção pelo vírus DengueGandini, Mariana January 2014 (has links)
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Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus dengue é um flavivírus causador de síndrome febril hemorrágica, sendo alguns casos graves evidenciados pelo acúmulo de plasma nas cavidades. Sugerese que a intensa replicação viral na fase aguda resultaria na intensa produção de mediadores inflamatórios, levando ao extravasamento plasmático. A imunidade inata é uma importante barreira na limitação da dispersão viral. As células dendríticas plasmacitoides (PDCs) e as células NK são fundamentais durante a fase inicial das infecções por suas características antivirais e citotóxicas contra células infectadas. O fenótipo \201CKiller\201D das PDCs (IKPDCs) resultaria da ativação viral e é caracterizado pela expressão membranar do ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral (TRAIL) e pela produção de interferons do tipo I. As células NK podem ser diretamente ativadas reconhecendo as células alvo ou, indiretamente ativadas pelas citocinas (como os interferons) tornando-se citotóxica, expressando TRAIL membranar. Apesar do papel antiviral, pouco se sabe sobre os mecanismos de ação dessas populações celulares durante a febre do dengue (FD). Nosso objetivo foi estudar o envolvimento das PDCs e células NK ativadas na imunopatologia da FD. Analisando as células de pacientes ex vivo, observamos maior frequência de IKPDCs nos casos brandos de FD, assim como de células NK TRAIL+. Outros marcadores de ativação como o marcador de degranulação CD107a e o receptor de reconhecimento padrão TLR3 foram expressos em maiores níveis nos pacientes comparando aos controles saudáveis
As citocinas relacionadas a ativação celular - IFN\03B1, TRAIL solúvel e IL12 - foram correlacionadas com os quadros brandos. Em modelos in vitro, o DENV induziu a transformação das PDCs em IKPDCs, em via dependente dos endossomos e da dose viral. Além disso, as IKPDCs reduziram a detecção de antígenos virais em modelos de cocultura com monócitos humanos infectados, em mecanismo dependente da via dos interferons do tipo I e independente de TRAIL. As células NK foram capazes de expressar TRAIL durante estimulação in vitro tanto estimuladas pelo DENV2 quanto pelo IFN\03B1, sugerindo mecanismos de ativação indireta da população. Assim, observamos que o DENV pode ativar ambas as populações. A relação entre a maior ativação das PDCs e células NK promoveria maior limitação da dispersão viral, contribuindo para diminuir a intensidade da resposta inflamatória. Sugerimos então que a ativação do eixo antiviral PDCs-Células NK contribuiria para proteção dos quadros graves durante a dengue / Dengue virus is a flavivirus that can cause a hemorrhagic febrile syndrome, in which
some severe cases are characterized by plasma accumulation in cavities. It is
suggested that a high viral burden in the acute phase would lead to an enhanced
production of inflammatory mediators, leading to plasma leakage. Innate immunity is
an important barrier limiting viral spread. Plasmacytoid dendritic cells (PDCs) and NK
cells are main actors in the beginning of infection because of their antiviral and
cytotoxic features against infected cells. PDC killer phenotype (IKPDCs) is induced
by viral activation and main profile is membrane expression of TNF-related
apoptosis-inducer ligand (TRAIL) and type I interferon production. NK cells can be
activated directly, by target recognition, or indirectly, by cytokines (like interferons)
and become cytotoxic, expressing membrane TRAIL. Despite its antiviral role, the
function of those cell populations during dengue fever (DF) is not largely known. Our
aim was to study activated PDCs and NK cells involvement in DF immunopathology.
DF patients’ cells analysis ex vivo presented higher frequency of IKPDCs and also
higher frequency of TRAIL+NK cells in mild DF cases. NK activation markers such as
CD107a degranulation marker and pattern recognition receptor TLR3 were
upregulated in patients’ cells compared to healthy donors. Cytokines – IFNα, soluble
TRAIL, IL12 – related to cell activation were upregulated in mild DF cases. In vitro
models show DENV induced transformation of PDCs into IKPDCs, in endosome and
viral-dependent pathways. Besides, IKPDCs could reduce viral antigen detection on
co-culture models with human infected monocytes, in a type I interferon-dependent,
TRAIL-independent mechanism. DENV-stimulated and IFNα-stimulated NK cells
were able to express TRAIL in vitro, suggesting an indirect activation of cells.
Therefore, we observed DENV-induced activation of both populations studied. A
higher activation of PDCs and NK cells would promote limited viral spread, resulting
in dimished inflammatory response. Then, we suggest that activation of antiviral axis
PDCs-NK cells would promote protection against severity during dengue
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Mapeamento da resposta imune protetora induzida por uma vacina de DNA contendo o gene NS1 de dengue 2Gonçalves, Antônio José da Silva January 2013 (has links)
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Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da dengue compreende quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV1-4) e até o momento não existe nenhuma vacina disponível comercialmente contra este patógeno. Alguns autores apontam a proteína NS1 de DENV como um antígeno protetor. Entretanto, ainda não se sabe ao certo o seu papel na replicação viral, bem como na indução de proteção ou patogênese. Nosso grupo vem trabalhando com as vacinas de DNA contra a dengue, testando-os em modelos murinos. Camundongos imunizados com uma vacina de DNA (pcTPANS1), que contém o gene NS1 de dengue 2 (DENV2), mostraram altos níveis de anticorpos anti-NS1 e quase 100 % de proteção quando desafiados com DENV2 (4 LD50). Este projeto tem por objetivo o mapeamento da resposta imune protetora gerada pela vacina pcTPANS1. Os resultados revelaram que 50 % dos animais que receberam o soro de outros camundongos, previamente imunizados com o plasmídeo pcTPANS1, sobreviveram à infecção após o desafio com DENV2 (4 LD50). Entretanto quando utilizamos um segundo estoque viral com 40 LD50, todos os animais apresentaram altas taxas de mortalidade e fortes sinais clínicos da infecção, com exceção do grupo de camundongos imunizados com a vacina pcTPANS1. Posteriormente analisamos o papel da resposta imune celular na proteção. O ensaio de depleção in vivo mostrou que todos os animais vacinados e depletados de células CD4+ morreram após o desafio com DENV2, enquanto que 60 % dos animais depletados de CD8+ sobreviveram à infecção. Os ensaios de transferência adotiva de células T mostraram proteção somente no grupo de camundongos que receberam concomitantemente soro e linfócitos TCD4+ provenientes de animais imunizados com a vacina pcTPANS1
As células obtidas do baço de animais vacinados com o plasmídeo pcTPANS1 foram capazes de secretar IFN-\F067 após estímulo com o peptídeo 265AGPWHLGKL273, contido na proteína NS1 de DENV2 e descrito na literatura como específico para células TCD8+\F02E\F020Também avaliamos in vivo uma possível atividade citotóxica específica para este peptídeo. Nossos resultados mostraram que os camundongos imunizados com a vacina pcTPANS1 promoveram a lise das células alvo pulsadas anteriormente com o peptídeo. Além disso, quando células alvos foram administradas 72 horas após o desafio com DENV2, houve um aumento significativo do percentual de lise. Em outro ensaio para avaliação de citotoxicidade in vivo, os animais foram imunizados com pcTPANS1 e submetidos ao tratamento para depleção de células CD4+ ou CD8+ Nossos resultados demonstraram que a atividade citotóxica específica para o peptídeo 265AGPWHLGKL273 é atribuída principalmente à população de células TCD8+, pois quando analisamos os resultados obtidos com animais imunizados e depletados de células TCD8- o percentual de lise foi reduzido para 37,9 %, corroborando os dados da literatura que descreve este peptídeo como específico para células TCD8+. Além disso, avaliamos a indução de possíveis danos gerados com a vacina pcTPANS1, tanto por análises histopatológicas do fígado quanto por dosagens dos níveis séricos de enzimas hepáticas, sem a detecção de qualquer alteração nos animais imunizados. De um modo geral, o conjunto de resultados obtidos nesse trabalho sugere que a proteção mediada pela vacina pcTPANS1 no nosso modelo experimental está relacionada principalmente com a resposta de células TCD4+ em associação com anticorpos anti-NS1, embora a vacina ative também uma resposta de células TCD8+ citotóxica / Dengue virus comprises four antigenically distinct serotypes (DENV1
-
4)
.
Nowada
ys,
there is no commercially available vaccine against this pathogen.
Some authors point
out the NS1 protein fr
om DENV as a protective antigen, h
owever, its role in viral
replication, as well as in the induction of protection or pathogenesis, remains still
unclear. Our group has been working with DNA vaccines a
gainst dengue
testing them
in murine models.
Mice immunized with one DNA vaccine (pcTPANS1), which contains
the NS1 gene from dengue 2 (DENV2), showed high levels of anti
-
NS1 antibodies and
almost 100
% protection when challenged with DENV2 (4 LD
50
). This project aims to
map the protective immune response generated by the pcTPANS1. Results showed
that 50
% of animals that received serum from other mice, previously immunized with
the pcTPANS1, survived
infection after challenge with DENV2 (4 LD
50
). However when
we used a second viral stock with 40 LD
50
, all animals showed high mortality rates and
strong clinical signs of infection, except the mouse group immunized with the
pcTPANS1 vaccine. Subsequently,
we analyzed the role of the cellular immune
response in protection. The
in vivo
depletion assay showed that all vaccinated and
depleted from CD4
+
cells died after challenge with DENV2, whereas 60
% of CD8
+
depleted animals survived infection. The assays o
f T cell adoptive transfer showed
protection only in the mouse group receiving concomitantly serum and CD4
+
T
lymphocytes recovered from animals immunized with the pcTPANS1 vaccine
.
Splenocytes obtained from pcTPANS1 vaccinated animals were able to secrete
IFN
after stimulation with the peptide
265
AGPWHLGKL
273
, present in NS1 protein
from DENV2 and described as specific for CD8 + T cells
We also analyzed
in vivo
a
possible cytotoxic activity specific for this peptide. Our results showed that mice
immuniz
ed with the pcTPANS1 vaccine promoted the lysis of target cells previously
pulsed with the peptide. Besides, when target cells were given 72 hours after challenge
with DENV2, there was a significant increase in the lysis percentage. In another assay
for th
e assessment of
in vivo
cytotoxicity, animals were immunized with pcTPANS1 and
subjected to treatment for depletion of CD4
+
or CD8
+
cells. Our results showed that
the cytotoxic activity specific for the peptide
265
AGPWHLGKL
273
is attributed mainly to
the
population of CD8
+
T cells, because when we analyzed results obtained from
animals immunized and depleted of CD8 Tcells, the lysis percentage was reduced to
37.9
%, corroborating data from literature which describes this peptide as specific for
CD8
+
T c
ells. Moreover, we evaluated the induction of possible damages generated by
the pcTPANS1 vaccine, either by histopathological analysis in the liver or by
quantification of serum levels of hepatic enzymes, without detection of any alteration in
immunized an
imals. In general, results obtained in this work suggest that protection
mediated by the pcTPANS1 vaccine in our experimental model is related mainly to the
CD4
+
T cells response in association with anti
-
NS1 antibodies, although the vaccine
also activate
s a CD8
+
T cells cytotoxic response.
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Investigação de mutações adaptativas no vírus da dengue em diferentes sistemas de cultivo / Investigation of adaptive changes in dengue virus in different culture systemsFelipe Scassi Salvador 09 August 2016 (has links)
Dengue é uma doença viral que atinge vários países, infectando milhares de pessoas anualmente. Sua transmissão ocorre pelo repasto sanguíneo feito pelas fêmeas dos mosquitos Aedes sp. infectadas e seus sintomas tem um amplo espectro de variação, que vão desde quadros assintomáticos até quadros graves com hipovolemia, podendo levar a óbito. A necessidade de adaptação do vírus a sistemas tão distintos (inseto e mamífero) restringe o espectro de variabilidade que o mesmo pode adquirir, permitindo que o vírus se adapte a ambos os hospedeiros com eficiência replicativa semelhante. Estudos com outros flavivírus já mostraram que a aquisição de variabilidade ocorre de maneiras distintas no hospedeiro mamífero e no inseto vetor, permitindo ao vírus máxima adaptação nas células infectadas. Levando em consideração estes estudos, este trabalho investigou a adaptação de duas cepas do vírus da dengue, a ACS-46, não neurovirulenta para camundongos adultos e a cepa JHA, neurovirulenta para camundongos adultos. O estudo foi feito utilizando cultura de células de mosquito (C6/36), cultura de células de mamífero (HepG2) e infecção em cérebro de camundongos neonatos. Utilizando sequenciamento de nova geração, foi possível verificar as mutações adquiridas ao longo de passagens em cada sistema de cultura. Foram realizadas 20 passagens seriadas em célula C6/36 e seis passagens alternadas entre C6/36 e HepG2. Os vírus obtidos na décima sexta e vigésima passagens do modelo seriado e na quarta e sexta passagens do modelo alternado foram completamente sequenciados utilizando a plataforma de sequenciamento em larga escala Ion Torrent. A análise das sequências revelou duas populações virais claramente distintas, já observadas a partir de décima sexta passagem, identificadas através da deleção de dois códons no sítio de glicosilação do domínio I da proteína de Envelope. Essa deleção induziu aumento na fusão do vírus à célula de mosquito, visto que a partir dessa passagem houve aumento no efeito citopático do vírus e na carga viral produzida durante infecções em células de mosquito. Contudo, essa mutação teve um perfil deletério em células humanas, fato deduzido pelo total desaparecimento da população com a deleção durante as passagens alternadas. Além desta deleção, foram detectadas sete mutações não sinônimas em região de proteínas não estruturais com porcentagens muito próximas, sugerindo que as mesmas fazem parte de uma mesma população. A cepa JHA teve seu caráter neurovirulento perdido após 29 passagens em C6/36, porém rapidamente recuperado após uma única passagem em cérebro de camundongo neonato. O sequenciamento dos vírus dessas passagens mostrou certa variabilidade em sítios distintos entre as variantes do vírus parental, vírus não neurovirulento e vírus neurovirulento passado em camundongo. Esse resultado indicou que aparentemente, não há sítios específicos determinantes de neurovirulência em DENV2, ao menos no nosso modelo, mas sim, um conjunto de mutações podem levar ao fenótipo neurovirulento, a depender das condições as quais o vírus é exposto. / Dengue is a viral disease that affects several countries, infecting thousands of people annually. It is transmitted by blood meal of the female Aedes sp mosquitoes infected. Symptoms have a wide range of variation, ranging from asymptomatic to severe symptoms, including hypovolemia and death. The need for adaptation in such distinct systems (insect and mammalian) restricts the variability that the viruses can acquire, allowing them to adapt to both hosts with similar replicative efficiency. Studies performed with other flaviviruses have shown that acquisition of variability occurs differently between the mammalian host and the insect vector, allowing the virus to adaptat in both systems. Therefore, this study investigated the adaptation of two strains of dengue virus, the ACS-46, not neurovirulent for adult mice and JHA strain, which is neurovirulent for adult mice. The study was done using mosquito cells culture (C6/36), mammalian cells (HepG2) and in vivo infection in newborn mouse brain. Using next-generation sequencing, we analyzed the mutations acquired over passages in each culture system. Twenty serial passages were conducted in C6/36 cells and six alternate passages between C6/36 and HepG2. Viruses obtained in the sixteenth and twenty passages from the serial experiment and the fourth and sixth passages from alternate model were completely sequenced using the next generation sequencing platform Ion Torrent. Sequence analysis revealed two clearly distinct viral populations observed from the sixteenth passage identified by deletion of two codons in the glycosylation site in the envelope protein domain I. This deletion led to increased fusion of the virus to mosquito cell, since the cytopathic effect increased from this passage to next as well as the viral load. However, this mutation had a deleterious profile in human cells since the mutated population was vanished during the alternate passages. It was also identified seven non-synonymous mutations in the region of nonstructural proteins with very similar percentages, suggesting that they belong to the same population. JHA strain lost the neurovirulent characteristic after 29 passages in C6/36, but quickly recovered it after a single passage in newborn mouse brain. The sequencing of the virus of these passages showed some variability in different sites among the parental virus, not neurovirulent viruses and neurovirulent virus after the single passage in mice. These data indicated that apparently there is no specific determinants of neurovirulence in DENV2, at least in our model, but rather a set of mutations can lead to neurovirulent phenotype, depending on the conditions in which the virus is exposed.
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Ocorrência do vírus dengue em crianças de 0 a 10 anos no município de Manaus, Amazonas, 2008Façanha, Grecilane Palheta, 92-99218-2424 03 May 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-05-03 / During the second half of the twentieth century dengue spread through the tropical and
subtropical regions of the planet, threatening the health of 1/3 of world population. Currently,
the disease causes about 50 to 100 million cases per year, including more than 500 thousand
reported cases of dengue hemorrhagic fever (DHF) and dengue shock syndrome (DSS),
severe disease. In Latin America, unlike Asia, the severe form is most prevalent in adults,
although recent studies show that it is occurring a shift of gravity to younger age groups,
especially in children under 15 years. In this paper we investigate blood samples from
children aged 0 to 10 years, in which was established by RT-PCR infectious virus serotypes
circulating within the city of Manaus / AM during 2008 in order to Epidemiological aspects of
the occurrence of the virus in childhood. Of the 94 children in the study, sixteen (17.0%) were
positive for dengue and DENV-3 was the only viral serotype identified. There was no
statistically significant association of the result of RT-PCR in relation to sex (p = 0.315). The
average time to diagnosis was 2.8 days (SD ± 0.98). All positive samples wreaked havoc in
the first quarter of 2008. All areas and eleven districts were positive for DENV-3. In
descending order, the neighborhoods that stood out were: Alvorada (18.75%), Compensa and
São José Operário (12.50% each). In this study 83.0% of children examined showed negative
for dengue by RT-PCR suggesting the occurrence of other febrile illnesses that need to be
clarified. / Durante a segunda metade do século XX a dengue se propagou através das regiões tropicais e
subtropicais do planeta, ameaçando a saúde de 1/3 da população mundial. Atualmente a
doença causa cerca de 50 a 100 milhões de casos por ano, incluindo-se mais de 500 mil casos
notificados de dengue hemorrágico (FHD) e síndrome do choque do dengue (SCD), formas
graves da doença. Na América Latina, ao contrário da Àsia, a forma grave é mais prevalente
em adultos, apesar de estudos recentes mostrarem que está ocorrendo um deslocamento da
gravidade para faixas etárias mais jovens, principalmente em menores de 15 anos. Nesse
estudo foram investigadas amostras de sangue de crianças na faixa etária de 0 a 10 anos, nas
quais se estabeleceu através da técnica de RT-PCR os sorotipos virais infectantes circulantes
no espaço urbano de Manaus/AM durante o ano de 2008 com o intuito de apresentar aspectos
epidemiológicos da ocorrência do vírus na infância. Das 94 crianças da casuística, dezesseis
(17,0%) foram positivas para dengue e o DENV-3 foi o único sorotipo viral identificado. Não
foi encontrada associação estatisticamente significante do resultado da RT-PCR em relação ao
sexo (p=0,315). O tempo médio de diagnóstico foi de 2,8 dias (Dp ± 0,98). Todas as amostras
positivas grassaram no primeiro trimestre de 2008. Todas as zonas e onze bairros foram
positivos para o DENV-3. Em ordem decrescente, os bairros que se destacaram foram:
Alvorada (18,75%), Compensa e São José Operário (12,50% cada). No presente estudo 83,0%
das crianças analisadas apresentaram resultado negativo para dengue através do RT-PCR
sugerindo a ocorrência de outras doenças febris que necessitam ser esclarecidas.
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Análise da competência vetorial para o vírus dengue em populações naturais de Aedes aegypti e Aedes albopictus de Pernambuco / Analysis of vector competence for dengue viruses of Aedes aegypti and Aedes albopictus natural populations from PernambucoGuedes, Duschinka Ribeiro Duarte January 2012 (has links)
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Previous issue date: 2012 / Os mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus são considerados os principais vetores da dengue, doença que afeta mais de 100 países e atinge, a cada ano, mais de 50 milhões de pessoas. Para que uma espécie seja incriminada como vetor de uma doença, ela deve ser capaz de se infectar com um determinado patógeno via oral, resistir à replicação deste no seu interior e transmiti-lo a um hospedeiro susceptível. Esta habilidade é denominada competência vetorial. Os rápidos avanços da biologia molecular têm facilitado o surgimento de novas abordagens que podem ser utilizadas para avaliar quantitativamente alguns aspectos da competência vetorial. Neste sentido, a RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) tem sido amplamente usada em estudos sobre a interação vírus-vetor. O presente estudo visou avaliar o processo de infecção do vírus Dengue (DENV) em amostras de intestinos e glândulas salivares Ae. aegypti e Ae. albopictus, através da quantificação de partículas virais de três sorotipos de DENV via PCR em tempo real. Os resultados mostraram que as três populações de Ae. aegypti (RecLab, Recife e Petrolina) analisadas no presente estudo foram suscetíveis à infecção com DENV-1, DENV-2 e DENV-3. De uma maneira geral, as populações de Ae. aegypti de campo (Recife e Petrolina) foram mais competentes para a infecção do que a colônia de laboratório (RecLab). Considerando a espécie Ae. albopictus, as duas populações (laboratório e campo) também foram suscetíveis à infecção com os três sorotipos, porém a colônia de laboratório foi mais suscetível à infecção do que a população de campo. Os dados obtidos no presente estudo indicam que diferenças na carga viral usada durante a alimentação artificial podem influenciar nas taxas de infecção do vírus no intestino, porém não influenciam a disseminação dos vírus para as glândulas salivares. Outro aspecto importante foi o curto período de incubação extrínseco (PIE) apresentado pelas duas espécies, exceto na população de Ae.aegypti de Petrolina, diferente do que é descrito na literatura. Este resultado tem uma grande importância epidemiológica, pois quanto menor o PIE, maior será o tempo que a espécie vai ser capaz de transmitir o vírus para um hospedeiro sadio, aumentando assim as chances de transmissão de dengue. Além disso, revela a necessidade da implementação de estratégias mais rápidas para bloquear a transmissão da doença. Estas informações serão necessárias para os estudos de avaliação de risco de transmissão da dengue
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Otimização da RT-PCR Multiplex para detecção de vírus dengue em amostras de Aedes aegypti infectados artificialmente / Optimization of Multiplex RT-PCR for Dengue virus detection in artificially infected Aedes aegypti samplesBarbosa, Priscilla Paschoal January 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A dengue é a mais importante doença viral transmitida por mosquitos, no que diz respeito à morbidade e mortalidade, que afeta os seres humanos. Este vírus é transmitido pelos vetores
Aedes albopictus e Aedes aegypti, este último é o principal vetor nas Américas. O controle da
doença se baseia na vigilância laboratorial e vigilância entomológica. A vigilância laboratorial
visa aprimorar a capacidade do diagnóstico, detectando precocemente a circulação viral e
monitorando os sorotipos circulantes. Dentro deste tipo de vigilância, a RT-PCR é um método
bastante usado no diagnóstico da doença em humanos e mosquitos, porém, a má conservação
do material pode comprometer a integridade do RNA e trazer resultados falso-negativos. O
desenvolvimento de melhores métodos de vigilância do vírus dengue (DENV) em mosquitos é
de grande valor para os programas de controle. Desta maneira, o presente projeto visou
otimizar a técnica de RT-PCR Multiplex para detecção de DENV em amostras de Ae. aegypti
infectadas artificialmente pelo vírus. Primers que amplificam uma região de 80 pb do gene
rpL8 de mosquito foram desenhados no site Primer3 e avaliados na ferramenta online
Multiple Primer Analyzer, junto com primers que amplificam os sorotipos DENV. Não houve
competição de primers e foi observado bandas distintas no gel de agarose. Foi avaliado o
efeito de diferentes formas de preservação do material genético das amostras (RNAlater®,
freezer -80°C e nitrogênio líquido) por 7 dias, onde não houve diferenças significativas em
relação à integridade do RNA. O efeito de diferentes formas de extração de RNA (Kit da
QIAGEN®
, TRIzol®
e Chomczymski-Sacchi) também foi avaliado e o método ChomczymskiSacchi
obteve o melhor desempenho. A otimização desta técnica permitirá uma maior
confiabilidade nos resultados, já que além da detecção dos sorotipos, haverá uma confirmação
da qualidade do RNA, aprimorando a capacidade do diagnóstico e auxiliando a prevenção e
controle da transmissão da dengue.
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Clonagem e expressão das proteínas recombinantes NS1 e NS3 do vírus da dengue tipo 3 / Cloning and expression of recombinant NS1 and NS3 proteins of dengue virus type 3Oliveira, Anibal Silva de 04 April 2013 (has links)
A dengue é uma doença infecciosa com grandes taxas de morbimortalidade, causada pelo vírus da dengue (DENV). Segundo a Organização Mundial de Saúde, cerca de 50 a 100 milhões de pessoas são infectadas anualmente em mais de 100 países tropicais e subtropicais de todos os continentes. O espectro clínico da infecção pelo DENV pode incluir formas assintomáticas ou sintomaticas que variam desde uma febre indeterminada e autolimitada, passando pela febre clássica da dengue (FD) até quadros graves denominados febre hemorrágica da dengue/síndrome do choque da dengue (FHD/SCD). Recentemente, ocorreu um dramático aumento do número de casos de FHD/SCD nas Américas, e este aumento coincidiu com a introdução do dengue sorotipo 3, genótipo III. No presente trabalho, objetivou-se a clonagem e a expressão das proteínas NS1 e NS3 do vírus da dengue tipo 3. As proteínas NS1 e NS3 do DENV-3 foram clonadas e expressas com sucesso em sistema procarioto. A amplificação dos genes das proteínas NS1 e NS3 foi realizada por RT-PCR, o qual gerou amplicons de cerca de 1050 e 1850 pb, respectivamente. Em seguida, os genes foram clonados por inserção dos amplicons no vetor plasmidial pCR-XL. Os genes de NS1 e NS3 foram subclonados no vetor de expressão pQE-30 através de sítios de restrição para as enzimas BamHI e HindIII. A expressão proteica foi obtida em sistema procarioto utilizando a cepa BL21(DE3) de E. coli, resultando em proteínas de 45 e 70 kDa as quais foram confirmadas por análises em Western blot utilizando como anticorpo primário fluido ascítico imune de camundongos e soro de pacientes com dengue. Estas proteínas virais podem ser utilizadas para estudos relacionados à patogênese, replicação e mecanismos de escape do sistema imune do DENV, além disso, podem ser potencias antígenos em métodos de diagnóstico. / Dengue is an infectious disease with high morbidity and mortality rates caused by dengue virus (DENV). According to the World Health Organization, about 50 to 100 million people are infected annually in more than 100 tropical and subtropical countries from all continents. The clinical spectrum of DENV infection can includes asymptomatic or symptomatic forms ranging from undetermined and self-limited fever, through dengue fever (DF) to severe disease called dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome (DHF/DSS). Recently, there has been a dramatic increase in the number of cases of DHF/DSS in the Americas, and this increase coincided with the introduction of dengue virus type 3 (DENV-3), genotype III. The present study aimed to clone and express NS1 and NS3 proteins of DENV-3. The NS1 and NS3 proteins of DENV-3 was successfully cloned and expressed in a prokaryotic system. Amplification of NS1 and NS3 genes was carried out by RT-PCR, which yielded amplicons of approximately 1050 and 1850 bp, respectively. Then, the genes were cloned by inserting the amplicons into the plasmid vector pCR-XL. NS1 and NS3 genes were subcloned into the expression vector pQE-30 through the restriction sites for BamHI and HindIII enzymes. The protein expression was obtained in a prokaryotic system using the strain BL21 (DE3) of E. coli, resulting in 45 and 70 kDa proteins, which were confirmed by Western blot analysis using immune mouse ascitic fluid and serum of patients with dengue as primary antibody. These viral proteins can be used to study the pathogenesis, mechanisms of replication and immune escape of DENV, moreover, can be potential antigens in diagnostic methods.
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Identificação de flavivirus infectando culicídeos de 1999 a 2007 no Brasil / Identification of flavivirus infecting culicídeos of 1999 to 2007 in BrazilFigueiredo, Mario Luis Garcia de 26 April 2010 (has links)
Introdução: Arbovírus são vírus transmitidos por artrópodos, pertencendo, principalmente, aos gêneros Flavivirus (Flaviviridae), Alphavirus (Togaviridae) e Orthobunyavirus (Bunyavirus). Os Flavivirus, em sua maioria, são associados a zoonoses, causando doenças humanas febrís, febres hemorrágicas e encefalites. Inclusive, causam epidemias que são sério problema de saúde pública. Este estudo mostra uma pesquisa de Flavivirus em culicídeos, de diferentes regiões do país, utilizando uma técnica para identificação viral por RT-PCR com primers Flavivirusespecíficos e uma Multiplex-nested-PCR com primers espécie-específicos. Métodos: Culicídeos foram capturados, quantificados, identificados, agrupados em lotes por espécie e congelados. No laboratório, os animais foram macerados e tiveram o RNA extraído. Estes extratos foram submetidos a RT-PCR gênero-específica e à Multiplex-nested-PCR, para detecção e identificação dos vírus a nível de espécie. Resultado: De 3317 culicídios adultos e 571 larvas coletados em 4 diferentes regiões do Brasil, Sul, Sudeste, Norte e Nordeste, fez-se 246 lotes de mosquitos e desses foi possível obter amplicon sugestivo de Flavivirus em 16 (6,5%). Em 3 lotes contendo larvas de Aedes albopictus obteve-se amplicon sugestivo de vírus do dengue tipo 3. Também, em 13 lotes contendo Haemagogus leucocelaenus, Aedes aegypti e Aedes albopictus foi possível obter amplicons sugestivos de vírus do dengue tipos 1 e 2. Dos amplicons obtidos, 4 tiveram nucleotídios seqüenciados o que permitiu confirmar a presença dos vírus do dengue tipo 3 e Cacipacoré. Conclusão: O trabalho permitiu concluir que: a metodologia de RT-PCR para Flavivirus seguida de Multiplex-nested-PCR espécie-específica foi adequada para detecção e identificação destes vírus em culicídios; amplificaram-se genomas de Flavivirus em 6,5% dos lotes de culicídios estudados; vírus do dengue tipo 1 e tipo 2 foram encontrados infectando Aedes aegypti de Santos em 1999, Manaus em 2005-2006 e Foz do Iguaçu; vírus do dengue tipos 2 e 3 foram encontrados em Aedes albopictus de Santos em 1999 e Manaus em 2005-2006, sugerindo que este mosquito participe na transmissão de dengue; vírus do dengue tipo 3 foi encontrado em larvas de Aedes albopictus mostrando transmissão vertical do vírus; vírus do dengue tipo 1 foi encontrado infectando Haemagogus sp. sugerindo existência de ciclo silvático deste vírus; Aedes aegypti do Amazonas estavam infectados com o vírus Cacipacoré. / Introduction: Arbovirus are rodent-borne viruses mostly from Flavivirus (Flaviviridae), Alphavirus (Togaviridae) e Orthobunyavirus (Bunyavirus) genus. Flavivirus, are commonly zoonotic and can cause febrile illness, haemorrhagic fever and encephalitis. Flavivirus outbreaks occur in Brazil and are a major public health problem. We show here a research looking for Flavivirus infections in Culicidae by a RT-PCR using Flavivirus-especific primers and a Multiplex-nested-PCR using specie-specific primers for virus identification. Methods: Culicidae were captured, quantified, identified, pooled based on the specie and frozzen. In the laboratory, the animals were crushed and had the RNA extracted. These extracts were tested by a Flavivirus genus-specific RT-PCR followed by a specie-specific Multiplex-nested-PCR. Results: From 3317 captured adult Culicidae and 571 collected larvae in 4 different regions of Brazil, 246 pools were obtained and from these, Flavivirus indicative amplicons were obtained in 16 (6.5%). Amplicons of dengue type 3 were obtained from 3 pools of Aedes albopictus larvae. It was also possible to obtain indicative amplicons of dengue types 1 and 2 in 13 pools of Haemagogus leucocelaenus, Aedes aegypti and Aedes albopictus. Besides, 4 amplicons had the nucleotides sequenced, confirming the mosquito infection by dengue type 3 and Cacipacoré viruses. Conclusion: The technique combining a Flavivirus genus-specific RT-PCR followed by a specie-specific Multiplex-nested-PCR was suitable for detection of these viruses in the mosquitoes; Flavivirus infecting Culicidae were detected in 6.5% of the analyzed mosquito pools; dengue virus type 1 and type 2 were found infecting Aedes aegypti from Santos (1999), Manaus (2005-2006) and Foz do Iguaçu cities; dengue type 2 virus was found in Aedes albopictus from Santos city (1999) and Manaus city (2005-2006), suggesting that this mosquito could be participating on dengue transmition; dengue type 3 virus was found in Aedes albopictus larvae showing the vertical transmission of this virus; dengue type 1 virus was found infecting Haemagogus sp. what suggests on the existence of a sylvatic maintenance cycle of this virus; Aedes aegypti from Amazonas state were found infeted by Cacipacoré virus.
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Reatividade sorológica de três peptídeos sintéticos derivados dos domínios I e II da proteína do envelope do Dengue virus em amostras de soro de pacientes com suspeita de dengueCOSTA, Lauro Cesar Felipe da 17 January 2014 (has links)
A dengue é um dos principais problemas de saúde publica do mundo, especialmente
nas regiões tropicais e subtropicais. Apesar da magnitude do problema, ainda
existem limitações relacionadas ao diagnóstico, devido à presença de resultados
falsos negativos, muitas vezes apresentados nos laudos laboratoriais. Estudos com
a proteína do envelope são extremamente importantes para o desenvolvimento de
novas vacinas e testes de diagnóstico. Os métodos sorológicos são importantes
para o diagnóstico das infecções por dengue, entre eles, o imunoensaio enzimático
para detecção de IgM contra o vírus da dengue. Neste estudo, 82 amostras de soro
de pacientes com suspeita de dengue foram classificadas como positivas ou
negativas utilizando o kit comercial Panbio ELISA de Captura Dengue IgM. O
desempenho do ensaio do kit comercial foi comparado com os novos ensaios ELISA
indireto usando três peptídeos sintéticos derivados da proteína E como substrato. De
um total de 82 amostras de soro, (52,4%) foram positivas pelo kit comercial Panbio
Dengue IgM ELISA de Captura, 18 (21,9%) apresentaram reatividade contra Pep1,
40 (48,7%) contra o Pep2 e 66 (80,4%) contra Pep3. Entre as amostras de soro
classificadas como positivas pelo kit comercial (42), 11 (26%), também foram
classificadas como positivas usando o peptídeo Pep1. Vinte e duas (52,3%),
utilizando o Pep2 e 40 (95,23%) utilizando Pep3. Entre as amostras classificadas
como negativas por meio do kit comercial (40), 28 (70%) foram classificadas como
negativas usando como substrato o Pep1, vinte 20 (50%) utilizando como substrato
o Pep2 e 13 (32,5%), utilizando como substrato Pep3. Os resultados demonstram
que os peptídeos sintéticos podem ter potencial biotecnológico para o
desenvolvimento de novas vacinas, tratamentos e testes de diagnósticos. / Dengue is a major public health problem worldwide, especially in the tropical and
subtropical regions of the world. Despite the magnitude of the problem, there are still
limitations related to the diagnosis, due to the presence of false negative results often
presented in the laboratory reports. Studies using the envelope protein are extremely
important for the development of new vaccines and new diagnostic tests. Serological
methods are important for the diagnosis of dengue infections, and among them, the
enzyme linked immunoassay that detects IgM against Dengue virus is very
employed. In this study, a panel of 82 serum samples from dengue suspected
patients was classified as positive and negative using the commercial ELISA kit
Panbio Capture Dengue IgM. Assay performance of the commercial kit was
compared with the new indirect ELISA assays using synthetic peptides derived from
E protein (Pep1, Pep2 and Pep3) as substrate. Of a total of 82 serum samples,
(52.4%) were positive by the commercial ELISA kit Panbio Capture Dengue IgM, 18
(21,95%) showed reactivity against Pep1; 40 (48,78%) against Pep2 and 66
(80,48%) against Pep3. Among the serum samples classified as positive by the
commercial kit (42), 11 (26%) are also classified by positive using Pep1 as substrate,
22 (52,3%) using Pep2 as substrate and 40 (95,23%) using Pep3 as substrate.
Among the samples classified as negative by the commercial kit (40), 28 (70%) were
also classified as negative using Pep1 as substrate, 20 (50%) using Pep2 as
substrate and 13 (32.5%) using Pep3 as substrate. The results showed that the
synthetic peptides can have biotechnological potential for the development of new
vaccines and treatments and diagnostic tests. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
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Caracterização molecular de cepas do Vírus dengue 1 isoladas no Brasil entre os anos de 1994 a 2008CARNEIRO, Adriana Ribeiro 15 May 2009 (has links)
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Previous issue date: 2009 / A febre do dengue é uma das mais importantes arboviroses distribuída por todas as áreas tropicais do mundo. O vírus dengue (VDEN) é transmitido principalmente pela picada do mosquito Aedes aegypti infectado. A dispersão do vetor e o aumento do fluxo migratório entre países possibilitaram a
ocorrência de grandes epidemias e manifestações clínicas severas, como febre
hemorrágica do dengue (FHD) e Síndrome do choque do dengue (SCD). O
objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular de isolados do
VDEN sorotipo 1 (VDEN-1) no Brasil ao nível dos genes estruturais C/prM/M/E
de 29 cepas isoladas durante epidemias ocorridas no Brasil no período de 1994
a 2008. A identidade nucleotídica entre as cepas de VDEN-1 do estudo em
relação às outras isoladas no Brasil variou de 96,1% a 100%, enquanto o
percentual de identidade de aminoácidos foi determinado entre 98,4% a 100%.
As diferenças de aminoácidos entre as cepas do estudo, quando comparadas
com a cepa FGA/89 (Guiana Francesa), mostraram a presença de importantes
substituições não-sinônimas com mudança de caráter bioquímico, tais como os
resíduos E297 (Met Tre) e E338 (Ser Leu), sendo necessário estudos para
verificar se essas alterações podem ou não estar relacionadas à virulência. A
análise filogenética para a proteína E, realizada por meio do método de
máxima verossimilhança para as cepas do estudo e outras cepas selecionadas
do banco de dados do Genbank, mostraram que as cepas de VDEN-1 isoladas
no Brasil desde 1982 pertencem ao genótipo V, corroborando com os
resultados publicados anteriormente. O tempo de divergência do VDEN-1,
estimado através da hipótese de relógio molecular, mostrou que este vírus teve
sua origem a partir de uma linhagem ancestral, há aproximadamente, 113 anos
e observou-se ainda que as cepas de VDEN-1 circulantes no Brasil e as
provenientes da África possuem um ancestral comum, sendo necessário estudos de filogeografia que mostrem as possíveis rotas de entrada do VDEN-1
no Brasil. / Dengue fever is one of the most important arboviral disease distributed to all
tropical areas of the world. Dengue virus (DENV) is transmitted mainly by the
bite of infected Aedes aegypti mosquitoes. The dispersion of the vector and the
increase of migration between countries caused the occurrence of major
epidemics and severe clinical manifestations, such as the dengue hemorrhagic
fever (DHF) and the dengue shock syndrome (DSS). The objective of this study
was the molecular characterization of isolates of DENV-1 in Brazil at the level of
structural genes C / prM / M / E of 29 strains isolated during outbreaks occurred
in Brazil between 1994 and 2008. The nucleotide identity among strains of this
DENV-1 study compared with other strains isolated in Brazil ranged from 96.1%
to 100%, while the percentage of amino acid identity was determined between
98.4% to 100%. The amino acid differences between strains of the study,
compared with the strain FGA/89 (French Guiana) showed the presence of
important non-synonymous substitutions change of the amino acid biochemical
character, such as the E297 residue (Met Thr) and E338 (Ser Leu), more
detailed studies are needed to investigate if any of them may be related to
DENV-1 virulence. The phylogenetic analysis of the E gene, performed using
the maximum likelihood method for the studied strains and other strains
selected from the database of GenBank showed that the DENV-1 isolates from
Brazil since 1982 belonged to genotype V, confirming previously published
data. The time of divergence of DENV-1, estimated by molecular clock method,
showed that this virus was originated from an ancestral lineage, there are
approximately 113 years and it was also observed that DENV-1 strains
circulating in Brazil and those from Africa have a common ancestor, and finally
it is necessary phylogeographic studies to show the possible routes of entry of
DENV-1 in Brazil.
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