Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-06-14T14:38:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO RODRIGO JOSE VIDERES CORDEIRO DE BRITO. PERFIL EPIDEMIOLOGICO.pdf: 514696 bytes, checksum: 811c40da5b89d6993c34ce5a1c927604 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T14:38:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO RODRIGO JOSE VIDERES CORDEIRO DE BRITO. PERFIL EPIDEMIOLOGICO.pdf: 514696 bytes, checksum: 811c40da5b89d6993c34ce5a1c927604 (MD5) Previous issue date: 2009-08-28 / Esta dissertação de mestrado é composta por uma revisão bibliográfica sobre as formas de transmissão do HCV e um artigo original, a ser submetido a publicação, que versa sobre os fatores de risco de uma subpopulação do Norte da Bahia com anti-HCV positivo. Para a revisão realizou-se busca nas bases de dados eletrônicas LILACS, MEDLINE, COCHRANE e SciELO, considerando o período de janeiro de 1990 até março de 2009. Os seguintes descritores foram utilizados: (1) hepatite C crônica; (2) Transmissão do HCV (3) Transmissão vertical do HCV (4) Transmissão sexual do HCV. Além disso, as referências dos artigos encontrados também foram revisadas. O artigo original é um estudo descritivo, do tipo série de casos, sem grupo controle, realizado entre outubro e dezembro de 2008, cujo título é: Fatores de risco para infecção pelo vírus da hepatite C em Centro de Referência no Norte da Bahia. Foram avaliados consecutivamente 147 pacientes com infecção pelo HCV, maiores de 18 anos, matriculados no Centro de Informação em doenças sexualmente transmissíveis DSTs, HIV e AIDS (CIDHA) do Município de Juazeiro, situado no Norte do Estado da Bahia. Destes, 99 (67,3%) foram selecionados por residirem na região Norte da Bahia por um período mínimo de 20 anos. Testes de amplificação do RNA-HCV e um questionário foram realizados com o objetivo de descrever os principais fatores de riscos para a infecção pelo vírus da hepatite C (VHC) e a características sociodemográficas dos pacientes e características virais da infecção. O sexo masculino foi predominante (82,8%) e os principais fatores de risco para transmissão foram uso de seringa descartável de vidro (85,9%), mais de 5 parceiros sexuais (81,8%), internações (65,7%), passado história de doenças sexualmente transmissíveis (60,6%), uso de Gluconergan ® (55,6%), cirurgias anteriores (53,5%), o consumo de drogas ilícitas (24,2%), transfusões sanguíneas (18,2%). A incidência de genótipos virais (56,6%) para o genótipo 1, (1%) para o genótipo 2 e (38,3%) ao genótipo 3 .. O consumo de Gluconergan® foi associado ao sexo masculino (p <0,001), o consumo de etanol (p = 0,001), história de doença sexualmente transmissível (p <0,001). Os dados revelam um importante comportamento sociocultural complexo caracterizado pelo uso de álcool e de suplementos vitamínicos endovenosos, semelhante aos usuários de drogas ilícitas, com a partilha de seringas e da utilização de técnicas inadequadas para a limpeza. / This master's thesis consists of a literature review on ways of transmission of HCV and an original article which is about the risk factors of a subpopulation of northern Bahia with anti-HCV positive. For a review of literature was carried out search in electronic databases LILACS, MEDLINE, Cochrane Library and SciELO, considering the period from January 1990 until March 2009. The following descriptors were used: (1) chronic hepatitis C, (2) Transmission of HCV (3) Vertical transmission of HCV (4) Sexual transmission of Moreover, the references of articles found were also reviewed. The original article is a descriptive study, the type of case series without control group, conducted between October and December 2008, whose title is: Risk factors for infection with hepatitis C virus in the Reference Center in northern Bahia. We evaluated 147 consecutive patients with HCV infection, over 18, enrolled in the Center for Information on sexually transmitted diseases STDs, HIV and AIDS (CIDHA) of the city of Juazeiro, located in the northern state of Bahia. Of these, 99 (67.3%) were selected to reside in the northern region of Bahia for a minimum period of 20 years. Amplification tests for HCV-RNA and a questionnaire were carried out to describe the main risk factors for infection by the hepatitis C virus (HCV) and sociodemographic characteristics of patients and characteristics of viral infection. Male gender was predominant (82.8%) and the main risk factors for transmission were use of disposable glass syringe (85.9%), more than 5 sexual partners (81.8%), hospitalizations 65.7 %), past history of sexually transmitted diseases (60.6%), use of Gluconergan ® 55.6%), previous surgeries (53.5%), illicit drug use (24.2%), blood transfusions 18.2%)The incidence of viral genotypes (56.6%) for genotype 1, (1%) for genotype 2 and 38.3%) to genotype 3 . The consumption of Gluconergan ® was associated with male gender (p <0.001), consumption of ethanol (p = 0.001) and history of sexually transmitted disease (p <0.001). The data reveal an important sociocultural complex behavior characterized by the use of alcohol and intravenous vitamin supplements, similar to users of illicit drugs, with the sharing of syringes and use of inappropriate techniques for cleaning.

Introdução: A infecção pelo VHC é uma epidemia de proporções globais, que se torna crônica em cerca de 85% dos indivíduos. Sobrecarga de ferro secundária a mutações HFE vem sendo proposta como fator agravante na evolução da hepatite crônica C. Objetivos: Avaliar se sobrecarga de ferro, mutações no gene HFE estão associadas a progressão da fibrose hepática e a carcinoma hepatocelular (CHC) em portadores crônicos VHC. Casuística e Métodos: De um banco de 2300 pacientes matriculados nos Ambulatórios de Hepatologia e de Transplante Hepático do HCFMUSP, selecionaram-se 320 portadores de hepatite crônica C. Os homens (55,6%) apresentaram 50,8 anos de idade em média e as mulheres 54,3. Obtiveram-se dados clínicos e laboratoriais da época da biópsia hepática, admissionais ou com pelo menos um ano de wash-out do tratamento antiviral. Considerou-se sobrecarga bioquímica níveis de ferro, saturação da transferrina e ferritina acima dos valores de referência. Sobrecarga de ferro tecidual foi identificada pela coloração de Perls graus 3-4. As mutações HFE C282Y e H63D foram pesquisadas pela técnica de PCR em tempo real, em DNA extraído de sangue total, após assinatura de TCLE aprovado pelo comitê de ética local. A fibrose hepática foi considerada avançada para graus 3-4 da classificação SBH/SBP e Metavir (n=167, 52,2%). CHC foi definido por biópsia ou por imagem típica por 2 métodos e AFP 400 mg/dL (n=45, 14,1%). Investigaram-se antecedentes de etilismo, diabetes mellitus, IMC e esteatose em biópsia hepática. A partir dos resultados de genotipagem HFE, constituiu-se um subgrupo caso-controle (n=182) com os portadores de mutações e pares de idade, sexo, etnia e IMC similares. Procederam-se análises de correlação bivariada e multivariada (IC=95%) nos grupos geral e caso-controle. Resultados: Quando se compararam casos com fibrose leve vs avançada, observaram-se níveis elevados de ferro em 17,7% vs 25,2% (p=0,019); saturação da transferrina em 24,3% vs 36,7% (p=0,001); ferritina em 25,8% vs 32,4% (p=0,040) e sobrecarga de ferro tecidual em 3,6% vs 1,4% (p=0,126). Quanto à mutação C282Y, observaram-se frequências alélicas de 0,9% vs 2,0% (p=0,110) e à H63D 5,0% vs 8,0% (p=0,033). No subgrupo casocontrole, as associações de C282Y e H63D com fibrose avançada ocorreram com significâncias de p=0,072 e 0,008, respectivamente. A análise multivariada, tendo fibrose como variável dependente nesse mesmo subgrupo, confirmou as associações com C282Y (OR=31,45; p=0,006) e H63D (OR=33,70; p=0,001). Neste mesmo subgrupo, a presença de pelo menos um alelo mutante esteve associada à ocorrência de CHC (p=0,015). Não se identificaram outros parâmetros associados a transformação carcinomatosa. Na análise multivariada, foram variáveis associadas a evolução da fibrose idade avançada (OR=2,36; p=0,000), etilismo (OR=2,18; p=0,007), saturação da transferrina (OR=2,11; p=0,010) e mutação H63D (OR=1,97; p=0,03). Discussão e Conclusões: Houve correlação de graus mais avançados de fibrose com níveis elevados de ferro, saturação da transferrina e ferritina; contudo, esses marcadores também podem estar igualmente elevados nos indivíduos com pouca fibrose. Ao contrário, em muitos casos, a sobrecarga bioquímica de ferro pode ser conseqüência da progressão da doença hepática, e não sua causa. As mutações H63D e C282Y ocorreram em associação com maiores graus de alteração arquitetural; mas, como não houve associação entre siderose tecidual e fibrose, é possível que seu papel na agressão hepática não ocorra diretamente por meio da sobrecarga de ferro. Os portadores de mutações HFE apresentam CHC com maior frequência que seus casos-controle. / Introduction: HCV infection is an epidemic of global proportions, which becomes chronic in about 85% of individuals. Iron overload due to HFE mutations has been proposed as aggravating factor in the evolution of chronic hepatitis C. Objectives: To assess whether iron overload, mutations in the HFE gene are associated with progression of liver fibrosis and hepatocellular carcinoma (HCC) in chronic HCV. Patients and Methods: From a database of 2300 patients enrolled in the outpatient clinics of Hepatology and Liver Transplantation, HCFMUSP, 320 patients with chronic hepatitis C were selected. Men (55.6%) were 50.8 years old on average and women 54.3. Admissional clinical and laboratory data at the time of liver biopsy were obtained; when patient had been previously treated with antiviral drugs, the wash-out period required was of at least one year. Biochemical iron overload was defined as iron, ferritin and transferrin saturation above the reference values. Tissue iron overload was identified by Perls staining of grades 3-4. The HFE C282Y and H63D mutations were searched by real-time PCR technique in DNA extracted from whole blood, after signing of FICT approved by the local ethics committee. The liver fibrosis was considered advanced for grades 3-4 in the classification SBH/SBP and METAVIR(n = 167, 52.2%). HCC was defined by biopsy or by typical image by 2 methods and AFP 400 mg / dL (n = 45, 14.1%). Personal history of alcoholism, diabetes mellitus, BMI and steatosis in liver biopsy were obtained. A casecontrol group was constituted based on the results of HFE genotyping (n = 182), subjects were paired by age, gender, ethnicity and BMI. Bivariate correlation and multivariate analysis (CI = 95%) groups in general and case-control were carried-out. Results: When comparing patients with mild vs advanced fibrosis, biochemical high levels of iron were detected in 17.7% vs 25.2% (p = 0.019), transferrin saturation in 24.3% vs 36.7% (p = 0.001), ferritin in 25.8% vs 32.4% (p = 0.040) and tissue iron overload in 3.6% vs 1.4% (p = 0.126). Regarding to HFE mutations, the allelic frequencies of C282Y were 0.9% vs 2.0% (p = 0.110); and of H63D, 5.0% vs 8.0% (p = 0.033). In casecontrol group, associations of C282Y and H63D with advanced fibrosis occurred with significance of p=0.072 and 0.008, respectively. Multivariate analysis with fibrosis as the dependent variable in that group, confirmed the associations with C282Y (OR = 31.45, p = 0.006) and H63D (OR = 33.70, p = 0.001). In this same subgroup, the presence of at least one mutant allele was associated with occurrence of HCC (p = 0.015). There were not any other parameters found in association with carcinomatous transformation. The multivariate analysis using fibrosis as dependent variable showed association with age (OR = 2.36, p = 0.000), alcoholism (OR = 2.18, p = 0.007), transferrin saturation (OR = 2.11, p = 0.010) and H63D mutation (OR = 1.97, p = 0.03). Discussion and Conclusions: Advanced degrees of fibrosis were correlated with high levels of iron, transferrin saturation and ferritin; however, these markers can also be elevated in individuals with slight fibrosis. In contrary, in many cases, the biochemistry of iron overload may be a consequence of progression of liver disease. C282Y and H63D mutations occurred in association with more advanced fibrosis. However, as there was not any correlation between tissue siderosis and fibrosis, it might be possible that liver injury occurs not by the iron overload pathway. Finally, carriers of HFE mutations were found with HCC more frequently than their casecontrol.

La polymérase NS5B du virus de l’hépatite C (VHC) porte une activité ARN polymérase ARN-dépendante essentielle pour la réplication de l'ARN génomique viral. Cette réplication implique la synthèse d'un intermédiaire de réplication de polarité négative. In vitro et probablement in vivo, la NS5B initie la synthèse d'ARN par un mécanisme de novo qui nécessite des interactions spécifiques entre la polymérase virale et des éléments des ARN viraux. Dans une première partie nous avons étudié le rôle du GTP et d’un domaine C-terminal nommé linker de la polymérase. Nos résultats démontrent que des concentrations élevées de GTP sont nécessaires pour la transition de l'initiation à l'élongation de la synthèse de l'ARN. Des mutations dans le linker à la position 556 ne modifient pas la concentration de GTP nécessaire pour la transition. Toutefois, l'initiation de la synthèse d'ARN est augmentée par la mutation S556K. Une analyse structurale menée en parallèle suggère une implication directe du linker dans l'initiation de novo de la synthèse de l'ARN. Dans les deuxièmes et troisièmes parties, nous avons étudié le rôle de motifs ARN dans la traduction et la synthèse de l’'ARN du VHC. Nous avons démontré que la tige boucle SL-E1 formée par la région entre les nt 177 et 222 de l'extrémité 3' de l’ARN (-) est importante pour la synthèse d'ARN in vitro par la NS5B recombinante et dans les cellules Huh7 exprimant le complexe de réplication (RC) du VHC. SL-E1 est impliquée dans l’initiation de la synthèse d’ARN, au moins in vitro. Nous avons également étudié le rôle des tiges boucles SLV et SLVI du gène core. Nos données n'ont pas montré de rôle évident de ces séquences ou de leur complément dans la synthèse de l'ARN in vitro par la NS5B recombinante et en culture cellulaire par le RC du VHC. Nous avons confirmé leur effet négatif sur la traduction IRES dépendante par interaction ARN-ARN longue distance entre SL-VI et le 5'UTR et démontré que le miR122 ne peut pas empêcher cet interaction. Par contre, la présence de SL-VI prévient l’inhibition de la traduction induite par l’interaction entre le domaine III de l’IRES et la tige boucle 5BSL3.2 en 3’ du génome. Ces résultats démontrent la complexité des interactions ARN/ARN et ARN/protéines dans la régulation de la réplication virale. / The hepatitis C virus (HCV) NS5B protein displays a RNA-dependent RNA polymerase activity essential for replication of the viral RNA genome. This replication involves the synthesis of a replication intermediate of negative polarity. In vitro and likely in vivo, the NS5B initiates RNA synthesis by a de novo mechanism which requires specific interactions between the polymerase and viral RNA elements. In the first part of results, we described a combined structural and functional analysis of HCV-NS5B to study the role of a C-terminal segment (termed linker) and of GTP in RNA synthesis. Our results demonstrated that high GTP concentrations are necessary for the transition from the initiation to the elongation of RNA synthesis, and that linker mutations at position S556 did not modify the GTP requirement of NS5B for this transition. However, the initiation of RNA synthesis was greatly enhanced by a S556K mutation. These results together with a structural analysis point to the direct involvement of the linker in the de novo initiation of RNA synthesis. In the second and third parts of results, we studied the role of RNA elements in RNA synthesis. We demonstrated that the SL-E1 stem–loop formed by nucleotides 177–222 from the 3’-end of the HCV (-) RNA is important for RNA synthesis both in vitro by the recombinant NS5B and in Huh7 cells by HCV replication complex (RC). We also showed that SL-E1 is involved in initiation of RNA synthesis, at least in vitro. Then we studied the role of other viral RNA elements in core coding sequences (SLV and SLVI stem loops) and the involvement of the microRNA miR122 in RNA translation and RNA synthesis. For SLV and SLVI, our data did not show any clear role of these core-coding sequences or of their complement in the (-) RNA in RNA synthesis both in vitro by the recombinant NS5B and in cell culture by HCV-RC. We confirmed their negative effect on HCV-IRES translation through long range RNA-RNA interaction between SL-VI sequences and the 5’UTR and demonstrated that miR122 cannot disrupted this interaction and switches the region to an open conformation. Conversely, our data indicated that the SL-VI domain can counteract the negative effect of the interaction between the domain III of IRES and the 5BSL3.2 stem loop localized at the 3’end of the genome. These results point to the complexity of RNA/RNA and RNA/proteins interactions in the HCV replication cycle.

Le but du projet est l’étude des régulateurs de la voie de signalisation intracellulaire de la voie Pi(3)K-Akt au travers de l’analyse du suppresseur de tumeur PTEN (Phosphatase and tenson homolog) et de la sérine/thréonine kinase mTOR (Mamalian Target of Rapamycin). Cette étude à plusieurs objectifs :1. Modulation de la voie Akt par HCV sur des foies humains, foies de souris FL-N/35 au niveau basal dans un premier temps et lors d’un boost de la voie in vitro sur des cultures primaires d’hépatocytes murins.2. Etude de l’expression ainsi que des modifications post-traductionnelles des modulateurs de la voie PI(3)K dans un modèle murin exprimant (FL-N/35) ou non l’ORF complète du virus de l’hépatite C (VHC).3. Confirmer nos précédentes données avec l’invalidation de PTEN dans un modèle de souris KO pour PTEN.4. Etendre ses données au niveau moléculaire dans l’optique d’une étude mécanistique grâce à l’analyse in vivo, ex vivo et in vitro d’un modèle murin KO pour PTEN.5. Compléter cette étude par l’analyse des déterminants viraux impliqués dans la dérégulation de la signalisation intracellulaire grâce à l’étude de souris NS5A.6. Examiner l’impact de la dérégulation de la voie PI(3)K-Akt dans le développement des Carcinomes hépatocellulaires (CHCs) induit par le VHC. / The goal of myt thesis is to study regulators of intracellular signaling pathway of Pi route (3) K-Akt through the analysis of tumor suppressor PTEN (Phosphatase and tenson homolog) and serine / threonine kinase mTOR (Target of Rapamycin Mamalian). This study has several objectives:1. Modulation of the Akt pathway by HCV in human liver, mouse livers FL-N / 35 to the basal level in a first time and at a track boost in vitro on primary cultures of mouse hepatocytes.2. Study of the expression and post-translational modifications of modulators of PI path (3) K in a murine model expressing (FL-N / 35) or not the complete ORF of hepatitis C ( HCV).3. Confirming our previous data with the invalidation of PTEN in a knockout mouse model for PTEN.4. Extending its data at the molecular level with a view to a mechanistic study through analysis in vivo, ex vivo and in vitro of a knockout mouse model for PTEN.5. Complete this study by analyzing the viral determinants involved in the dysregulation of intracellular signaling through the NS5A mouse study.6. Examine the impact of deregulation of IP route (3) K-Akt in the development of hepatocellular carcinoma (CHCs) induced by HCV.

Le diagnostic et le suivi des infections par le VIH, VHB et VHC restent un défi dans les pays à faibles ressources qui sont par ailleurs les plus touchés. Il est urgent de pouvoir disposer d'outils de biologie simples, fiables et peu chers pour le contrôle de ces infections virales. Le défi est immense d'un point de vue clinique et politique de santé. L'objectif de ce travail de recherche effectué dans le cadre de la présente thèse est de développer et valider des stratégies et de nouveaux outils de biologie adaptés au diagnostic et au suivi des hépatites virales et de l'infection VIH dans les pays à ressources limitées. Dans un premier temps, nous avons investigué sur les résultats de sérologie VIH discordants, car en biologie et en pratique clinique, il est important d'établir le statut sérologique réel des personnes dépistées avec des résultats clairs pour une prise de décision adéquate à l'échelle individuelle. Dans ce travail, nous avons trouvé que les résultats discordants par l'algorithme de dépistage des femmes enceintes au Burkina Faso, étaient dans 94% des cas de faux positifs dus au test Determine™ HIV-1/2 et 4% de faux négatifs liés au test Genie II™ HIV-1/HIV-2. En matière de santé publique, les femmes présentant ce type de résultat peuvent être considérées comme séronégatives dans les centres où des investigations supplémentaires ne sont pas possibles, surtout dans les pays comme le Burkina Faso où la prévalence de l'infection est basse avec une faible diversité génétique. Dans un second temps, nous avons focalisé nos travaux sur la faisabilité d'une stratégie de dépistage qui combine la détection des trois infections (VIH, VHB et VHC) sur une seule carte DBS. Dans cette étude pilote, nous avons démontré que le DBS collecté en parallèle au test rapide VIH dans un centre de dépistage volontaire permet d'une part de faire la confirmation du VIH par immunoblot, et d'autre part de compléter par le diagnostic des hépatites B et C par ELISA suivi de western blot et PCR pour la confirmation pour le VHC. Cette stratégie peut servir de modèle pour promouvoir et vulgariser le dépistage des hépatites virales B et C dans les pays à ressources limitées. Le DBS peut servir de contrôle et de confirmation du diagnostic du VIH, VHB et VHC. Par la suite, nous avons évalué la performance de deux tests de 4ème génération immunoluminométriques (Elecsys® HIV Combi PT assay, Roche Diagnostics et Liaison® XL Murex HIV Ab/Ag test, DiaSorin) sur des échantillons séchés sur papier filtre en comparaison au test de diagnostic rapide et aux échantillons de sérum frais prélevés chez les patients en primo-infection VIH. Ces travaux ont clairement montré que les deux tests de 4ème génération réalisés sur papier filtre offrent de bonnes performances dans le diagnostic de la primo-infection par rapport aux tests de diagnostic rapide sur sérum frais. Cette méthode peut être utilisée pour détecter précocement le VIH chez les personnes difficiles à atteindre et les populations vivant dans des zones périphériques des pays à ressources limitées. Enfin, nous avons mis au point une technique de PCR en temps réel de détection et de quantification de l'ADN du VHB. A cet effet, nous sommes partis de deux PCR « maison » ciblant deux régions génomiques différentes (gène X pour la qPCR 1 et gène S pour la qPCR 2) en comparaison à un test commercial de charge virale (Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan HBV Test, version 2.0, Roche Diagnostics). La qPCR 2 avec un seuil de détection à 91 UI/ml (vs 104 UI/ml pour la qPCR 1) a montré une meilleure performance dans la quantification de l'ADN du VHB. Cette qPCR 2 peu chère est aujourd'hui produite sous forme de kit par une start-up appelée OMUNIS. Ce kit en développement fera l'objet d'une évaluation multicentrique en France, en Afrique et en Asie du Sud-Est à travers un réseau de laboratoires sous la promotion de l'ANRS. / Diagnosis and management of hepatitis B, hepatitis C and HIV infections are a real challenge in middle and low-income countries. There is an urgent need for simple, reliable and inexpensive tools to control these infections in high prevalence sittings like Africa and Asia. The challenge is immense in clinical and public health policy hands. The main goal of this research work performed for our PhD is the development and validation of strategies and tools to diagnose and monitor HIV, HBV and HCV infections in resource-constrained countries. At a first step, we investigated the results of HIV discordant results, since it is important to establish the real HIV status of people tested with clear results for appropriate decision-making in biological and clinical practice. This work show that discordant results obtained in the algorithm of HIV screening among pregnant women in Burkina Faso, are false positive results in 94% of cases due to the Determine™ HIV-1/2 immunochromatographic test and false negative results in 4% of cases due to the Genie II ™ HIV-1 / HIV-2 test. In public health practice, women with this type of result can be considered as negative for HIV testing in centers where additional investigations are not possible, especially in countries like Burkina Faso with a low incidence and a low genetic diversity of HIV.In a second step, we focused our work on the feasibility of a screening strategy that detects HIV, HBV and HCV infections into a single card of DBS. In this pilot study, we demonstrated that DBS collected in parallel to HIV rapid testing in a voluntary counseling and testing center allows HIV confirmation using immunoblotting, and an additional testing by diagnosing HBV and HCV using ELISA followed by immunoblotting and PCR for HCV confirmation. This strategy can serve as a model to promote and scale-up the screening of HBV and HCV in resource-limited countries. DBS can be served as control and confirmation of HIV, HBV and HCV diagnosis. Furthermore, we evaluated the performance of two 4th generation chemiluminescent immunoassays (Elecsys HIV Combi PT assay, Roche Diagnostics and Liaison XL Murex HIV Ab/Ag test, DiaSorin) tested on filter paper samples in comparison to rapid diagnostic test and fresh serum samples from patients with acute HIV infection. These studies have clearly shown that the two 4th generation tests performed on filter paper offer good performance in terms of sensitivity for the diagnosis of HIV infection in its early phases compared with rapid diagnostic tests. This approach may be used in combination with HIV rapid tests in hard-to-reach individuals and populations living in remote areas of when an early HIV infection is suspected since rapid tests do not offer appropriate performance in this case.Finally, we developed a real-time PCR for HBV DNA detection and quantification. In this study, we evaluated two in-house PCR targeting two different regions of HBV genome (X gene for qPCR 1 and S gene for qPCR 2) in comparison with a commercial Roche HBV DNA test (Cobas AmpliPrep / Cobas TaqMan HBV Test, version 2.0, Roche Diagnostics) as a gold standard. The qPCR 2 with a low detection limit of 91 IU/ml (vs 104 IU/ml for 1 qPCR) showed a better performance in HBV DNA quantification. This inexpensive qPCR with best performance characteristics is producing by a start-up called OMUNIS. This kit will be evaluated in France, in Africa and in South and East Asia in a research study funded by ANRS (France REcherche Nord & sud Sida-hiv Hépatites).

Les tests de laboratoire basés sur des techniques de biologie moléculaire sont des outils inestimables pour le suivi des patients, en particulier dans le cadre de l’infectiologie. Dans ce contexte clinique, ils peuvent permettre d’établir un diagnostic, un pronostic ainsi que de déterminer la stratégie thérapeutique antivirale la plus adaptée. Les virus hautement variables tel que le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), de l’hépatite B (VHB) et de l’hépatite C (VHC) sont présents sous forme de quasi-espèces au sein de leur environnement réplicatif. Lorsque des pressions de sélection s’exercent telle que l’administration d’un antiviral, une redistribution des variants majoritaires est fréquemment observée en variants mutés pour mieux s’adapter à cet environnement. Nos travaux ont permis, dans ce contexte, de valider l’impact clinique des mutations majoritaires mais aussi minoritaires grâce à la mise en œuvre de plusieurs techniques de séquençage (pyroséquençage, séquençage à haut débit et PCR en allèle spécifique). Nous avons également validé l’utilisation d’un logiciel simple, fiable et utilisable en routine par le clinicien pour l’interprétation clinique de la masse de données générées par le séquençage à haut débit. Enfin dans le contexte du test diagnostique, nous avons cliniquement validé sur une cohorte de patients infectés par le VHB, l’utilisation du papier buvard (Dried Blood Spot) comme support de prélèvement alternatif non invasif de diagnostic, en particulier pour les populations n’ayant pas accès aux structures classiques de soins et pour les pays en voie de développement. / Molecular biology based assays are invaluable tools for the patients follow-up. They can help to establish the prognosis, guide for the treatment decisions and assess the virological response to therapy. Highly variable viruses like Human Immunodeficiency Virus (HIV), Hepatitis B Virus (HBV) and Hepatitis C virus (HCV) which have a quasispecies distribution. Selection pressure on viral replicative environment such as an antiviral drug treatment, generally lead to a redistribution of the viral quasispecies with an increasing of the best adapted viral mutant. Our work allowed in this context to validate the clinical impact of majority but also minority mutations through the implementation of several sequencing techniques (pyrosequencing, high-throughput sequencing and allele-specific PCR). We also validated the use of a simple, reliable and routinely software solution by clinician for clinical interpretation of the mass of data generated by high-throughput sequencing. Finally, in the context of the diagnostic testing, we clinically validated in a cohort of patients infected with HBV, use the Dried Blood Spot technique as a supporting noninvasive diagnostic alternative sampling, especially for populations that have no access to conventional health structures and developing countries.

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Les pDCs répondent aux infections virales par la production d'IFN-α. L'élimination du virus de l'hépatite C (VHC) chez plus de 50% des patients infectés par le traitement à l'IFN-alpha suggère que les pDCs jouent un rôle majeur dans le contrôle de l'infection VHC. Les pDCs exposées aux hépatocytes infectés par VHC, produisent beaucoup d'IFN-α. Néanmoins, en dépit de cette production par TLR7 par les pDCs, VHC continue à se répliquer dans le foie infecté. J'ai approfondi les connaissances des mécanismes moléculaires d'exploration des particules de VHC et des cellules infectées par le VHC par les pDCs. J'ai ciblé ma recherche sur le contact des particules de VHC avec la surface des pDCs, sur la voie de signalisation de déclenchée, sur leur effet sur la production des IFNs et des cytokines proinflammatoires et sur la différenciation cellulaire. Nos résultats suggèrent que le virus associé aux cellules signalise dans les pDCs via un mécanisme dépendant de l'endocytose et d'IRF7 mais pas de la voie NF-κB. En dépit de l'induction d'IFN-α, le VHC associé aux hépatocytes n'induit une réponse pleinement fonctionnelle des pDCs. Les particules virales de VHC inhibent, via la fixation de la glycoprotéine E2 aux CLRs, la production d'IFN-α et d'IFN-λ dans les pDCs exposées aux hépatocytes infectés par VHC et induisent dans les pDCs, une phosphorylation rapide d'Akt et Erk1/2, d'une manière similaire au crosslinking de BDCA-2 ou DCIR. Ainsi, le blocage de BDCA-2 et de DCIR avec des fragments Fab des anticorps monoclonaux préserve la capacité des pDCs à produire des IFNs de type I et III en présence des particules virales. / Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) respond to viral infection by production of alpha interferon (IFN-alpha), proinflammatory cytokines, and cell differentiation. The elimination of hepatitis C virus (HCV) in more than 50% of infected patients by treatment with IFN-alpha suggests that pDCs play an important role in the control of HCV infection. pDCs exposed to HCV infected hepatoma cells produce large amounts of IFN-alpha. However, despite large amounts of Toll-like receptor 7-mediated IFN-α, produced by pDCs, HCV still replicates in infected liver. During my PhD training, I went into in depth to understand the molecular mecanisms used by HCV particles and HCV infected hepatocytes to explore pDCs. I focused my research on the binding of HCV particles with the pDC surface, on the triggered downstream signaling pathway, on the cellular differentiation. Our results suggest that cell-associated HCV signals in pDCs via an endocytosis-dependent mechanism and IRF7 but not via the NF-kappaB pathway. In spite of IFN-alpha induction, cell-associated HCV does not induce a full functional response of pDCs. HCV particles inhibit, via binding of E2 glycoprotein to CLRs, production of IFN-α and IFN-λ in pDCs exposed to HCV-infected hepatocytes, and induce in pDCs a rapid phosphorylation of Akt and Erk1/2, in a manner similar to the crosslinking of BDCA-2 or DCIR. Blocking of BDCA-2 and DCIR with Fab fragments of monoclonal antibodies preserves the capacity of pDCs to produce type I and III IFNs in the presence of HCV particles.

Le traitement du VHC connaît une évolution rapide avec le développement d'antiviraux à action directe plus efficaces et mieux tolérés qui vont modifier les stratégies thérapeutiques, les facteurs prédictifs de réponse et les modalités de suivi des patients. Notre travail s'intéresse aux paramètres de suivi du traitement que sont les dosages pharmacologiques de ribavirine et le suivi des cinétiques virales lors d'une trithérapie. L'étude d'une cohorte prospective incluant 186 patients sous trithérapie par IP montre que 60% d'entre-eux présentent une SVR12 et que les facteurs prédictifs sont le génotype de l'IL28B et la réponse au précédent traitement. Une diminution de la filtration glomérulaire réversible est également observée. La mesure du taux résiduel de ribavirine permet de réduire les risques hématologiques chez des patients insuffisants rénaux, la réalisation de l'ASC témoigne d'une moins bonne exposition à la ribavirine chez des patients co-infectés par le VIH/VHC et la biodisponibilité de la ribavirine et la sévérité des anémies augmentent chez des patients traités par télaprévir. Au sein de la cohorte CUPIC, la négativation ou la diminution >50-70% de la charge virale initiale à S2 de trithérapie sont fortement prédictives de la SVR12. Cette mesure à S2 permet aussi de dépister les échappements viraux précoces. La place de la ribavirine est importante dans les associations thérapeutiques actuelles et futures. Sa surveillance pharmacologique peut avoir un intérêt au cours de futures multi-thérapies exposant à d'éventuelles interactions médicamenteuses / The rapid development of new direct antiviral agents (DAA) against HCV gives hope of more potent and well tolerated treatments. These new compounds will deeply modify therapeutic schedules, virological response prognostic factors and patients’ monitoring. The aim of our work was to define the relevance of ribavirin plasma concentration and viral kinetics monitoring during triple therapy. The study of a prospective cohort including 186 patients under triple therapy showed an SVR12 rate of 60%. Associated predictive factors were IL-28B genotype and previous treatment response. A reversible decrease of glomerular filtration rate was also observed. Ribavirin plasma concentration monitoring reduced hematological risks among patients with renal insufficiency. Early ribavirin plasma exposure showed an underexposure among HIV/HCV patients and ribavirin biodisponibility with severe anemia increased among telaprevir-treated patients. Within the CUPIC cohort, the initial viral load undetectability or decrease up to 50% or 70% at week 2 of triple therapy were predictive of SVR12. Moreover, this week 2 viral load assessment allowed the detection of early viral breakthrough. Ribavirin still plays a major role in current and future therapeutic strategies. Ribavirin monitoring could also be important during future multi-drug therapy that could be associated with drug interactions

L’infection chronique par le virus de l’hépatite C (VHC) conduit au développement de la fibrose et de la cirrhose qui risque d’évoluer vers le carcinome hépatocellulaire (CHC). La protéine de capside du VHC interagit avec de nombreuses protéines de l’hôte et en particulier avec Smad3, protéine majeure de la voie de signalisation du transforming growth factor beta (TGF-Β). Mon travail de thèse consistait à étudier les conséquences biologiques de l’interaction entre la protéine de capside avec la voie de signalisation du TGF-Β. Le VHC présente une grande variabilité génétique et des travaux du laboratoire ont montré l’existence de séquences différentes de protéines de capside du virus entre les régions tumorales (cT) et cirrhotiques (cNT) d’un même sujet. Nous avons montré que ces différentes protéines de capside exprimées dans des hépatocytes orientent les réponses biologiques du TGF-Β vers la promotion tumorale en diminuant l’apoptose et en augmentant la transition épithelio-Mésenchymateuse (TEM) en particulier le variant cT. Cet effet est attribué à la capacité de la protéine de capside de diminuer l’activité transcriptionnelle de Smad3. De plus, les variants de la protéine de capside activent le TGF-Β latent via l’augmentation de l’expression de la trombospondine. L’un des marqueurs classiquement exprimé au cours d’une TEM est l’alpha-Actine musculaire lisse (αSMA). Nous avons montré qu’une autre isoforme, la γSMA, était polymérisée dans les cellules hépatiques développant une TEM. L’expression de γSMA a été retrouvée sur des coupes de CHC et a pu être significativement corrélée à la fois avec des marqueurs de la TEM, des marqueurs progéniteurs et avec l’agressivité de la tumeur.Ce travail apporte une meilleure compréhension du rôle de la protéine de capside dans la fibrose hépatique liée à l’infection virale. En effet, la protéine de capside du VHC agit à la fois de façon autocrine dans les hépatocytes en modulant les réponses du TGF-Β vers la promotion tumorale et de façon paracrine, en affectant l’activation des cellules étoilées en myofibroblastes par le TGF-Β activé. / Chronic HCV infection) may progress to liver fibrosis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). HCV core binds several cellular proteins and in particular Smad3, a major protein of transforming growth factor beta (TGF-Β) signalling.. The aim of this study was to determine the implication of HCV core protein in TGF-Β responses. High genetic variability is a characteristic of HCV and it was previously shown that HCV core protein isolated from tumour (cT) or adjacent non-Tumour (cNT) livers displayed different sequences. Both were able to shift TGF-B responses from tumour suppressor to tumour promotor by decreasing hepatocyte apoptosis and increasing epithelial-Mesenchymal transition (EMT). Core cT was more potent than core cNT to promote this effect that was mainly attributed to the capacity of HCV core to alleviate Smad3 activity. Moreover, HCV core protein activated the latent form of TGF-Β through increased thrombospondin expression. It is commonly accepted that αSMA (alpha smooth muscle actin) is a hallmark of EMT. In the current study another SMA isoform, γSMA was found to be polymerized during hepatocyte EMT. γSMA was expressed in HCC tissues and correlated with EMT, stem cell and aggressiveness markers. In conclusion, this work contributed to a better understanding of the HCV core role in hepatitis fibrosis and HCC related to HCV. Indeed, HCV core might act both as an autocrine and paracrine way by modulating TGF-Β responses within hepatocytes and by activating hepatic stellate cells in stromal environment through its capacity to activate TGF-Β.