Les variants viraux impliqués dans la transmission du VHC ont rarement été étudiés en raison des difficultés rencontrées pour recruter des patients au stade de la primo-infection. Pour mener cette étude, nous avons analysé le goulot d’étranglement génétique subit par les quasi-espèces virales au cours de 3 accidents d’exposition au sang impliquant des représentants du personnel soignant contaminés par piqûre d’aiguille. En utilisant la technique d’amplification de génomes uniques nous avons obtenu les gènes codant les glycoprotéines d’enveloppe virales E1E2 des variants viraux présents dans ces quasi-espèces. Ces gènes ont été séquencés et soumis à une analyse phylogénétique. Nous avons ensuite pu étudier les propriétés phénotypiques des glycoprotéines d’enveloppe dérivées de variants qui apparaissent au stade très précoce de l’infection. Pendant cette période, le VHC pourrait être plus vulnérable à l’élimination par des vaccins préventifs ou par des immunothérapies. / Little is known about the transmitted variants responsible for the spread of HCV infection, principally because of the difficulties to recruit patients early enough in infection. To address this issue, we proposed to track the genetic bottleneck event in HCV quasispecies, leading to productive clinical infection in three health care workers accidentally contaminated through needlestick accidents. By using a single genome amplification (SGA) approach we identified genes coding the viral envelope glycoprotein E1E2 which composed these quasispecies. The E1E2 sequences were then directly sequenced and subjected to a phylogenetic analysis. By cloning these full-length E1E2 sequences, we investigated the phenotypic properties of the envelope glycoproteins potentially involved in selective HCV transmission and early stage of infection, a period during which the virus might be most vulnerable to elimination by preventive vaccines or immunotherapies.

Les microarrays, assemblages organisés d'entités chimiques, biologiques ou cellulaires sont en pleine expansion, car ils présentent un potentiel élevé en recherche fondamentale et appliquée. La mise en œuvre de la technologie microarray repose sur trois méthodes essentielles : la chimie de surface pour la fonctionnalisation des supports, l'utilisation de technologies de précision micrométrique pour fabriquer les microarrays et la détection. Parmi toutes les applications, les microarrays visant à détecter l'activité enzymatique ont connus un développement rapide car ils permettent de tester l'efficacité d'un grand nombre de substrats ou d'inhibiteurs en parallèle. Les protéases, enzymes indispensables aux organismes vivants, et cibles thérapeutiques reconnues, sont des modèles biologiques de choix pour les études d'activité enzymatique sur microarray. La synthèse chimique sur puce n'est en revanche pas très développée.<br />La technologie développée au sein du laboratoire nous permet de former sur quelques cm2 des microarrays de centaines de microgouttes constituant chacune un microréacteur indépendant. Le but de cette thèse est d'appliquer pour la première fois cette technologie à la synthèse chimique et à l'étude de l'activité protéolytique, avant de combiner de manière novatrice les deux approches pour réaliser un criblage.<br />L'application de ces microarrays en synthèse chimique a été utilisée avec succès pour la synthèse d'une banque de molécules chimiques et pour la recherche combinatoire de nouveaux fluorophores. En ce qui concerne l'enzymologie, l'observation de la protéolyse a été validée en utilisant trois types de substrats fluorogènes, dans un premier temps avec la papaïne, puis avec une métalloprotéase, et enfin avec la protéase virale NS3 du virus de l'hépatite C. Finalement, l'utilisation séquentielle de la synthèse chimique et de la biochimie sur un même microarray, qui constitue une approche inédite, a été dédiée à la recherche de nouveaux inhibiteurs de la protéase virale NS3. Ce criblage a conduit à la découverte de molécules potentiellement intéressantes comme agents antiviraux.

Le virus de l'hépatite C (VHC) est une cause majeure d'affection hépatique chronique, notamment la cirrhose et le cancer du foie. On estime que 170 millions de personnes dans le monde sont des porteurs chroniques du VHC et que 3 à 4 millions de personnes sont infectées chaque année. Un des handicaps majeurs de la recherche sur le VHC est l'absence de systèmes de culture in vitro efficaces et de modèles animaux. Nous avons ainsi choisi une approche recombinante pour l'étude de protéines E1, E2 et p7 du VHC.Les protéines E1, E2 et p7 qui sont impliquées dans des étapes essentielles du cycle viral sont des protéines membranaires. Cependant, l'expression recombinante de cette classe de protéine est extrêmement complexe. En effet, la surexpression des protéines membranaires est souvent toxique pour les cellules hôtes. Ce phénomène est provoqué par l'agrégation ou la dégradation des protéines dans le cytoplasme dû à un manque de membrane disponible pour assurer leur intégration sur la cellule hôte. De plus, la surexpression de protéines membranaires induit la saturation de la machinerie cellulaire liée aux protéines membranaires. Ce détournement empêche le déroulement d'un cycle cellulaire normal et est ainsi fatal pour la cellule hôte. La forte concentration de protéines membranaires ou encore le fait que celles-ci soient hétérologues peut également provoquer la déstabilisation de la membrane de la cellule hôte et de son homéostasie. Afin de nous affranchir de ces limitations, nous avons utilisé une méthode de production des protéines membranaires sous forme native par un système acellulaire en présence de liposomes ; une technologie brevetée par l'université Joseph Fourier et exploitée par la société Synthelis. Dans un premier temps, nous avons procédé à la mise en place du système de production exploitant un lysat bactérien d'E. coli et d'un mélange énergétique complémentaire. Nous avons ensuite utilisé ce system pour étudier la viroporine p7. Cette protéine est essentielle pour la production de particules virales infectieuses et est impliquée dans l'assemblage viral ce qui en fait une cible thérapeutique intéressante. La production de protéoliposomes p7 en grande quantité nous a permis la caractérisation de la protéine par des techniques biochimiques et biophysiques. Nous avons mis en évidence l'inhibition de l'oligomérisation de p7 par le HMA qui ainsi inhibe sa fonction canal ionique. Grâce à la flexibilité du système d'expression acellulaire nous avons caractérisé la structure de la viroporine dans la membrane par réflectivité de neutron et avons confirmé la forme en entonnoir du complexe protéique. Des résultats préliminaires sur les proéoliposomes E1E2 quant à eux permettent d'espérer la production prochaine de particules virales mimant le VHC afin de mieux l'étudier et de lutter contre cette épidémie.L'ensemble de ces résultats confirment la pertinence de l'expression de protéines membranaires sous formes natives en système acellulaire en présence de liposomes. Les protéoliposomes produits constituent des nouveaux outils pour l'étude du VHC et permettent d'envisager de très grandes applications thérapeutiques ainsi que le développement de biomédicaments basés sur l'utilisation de protéines membranaires recombinantes. / The Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease, including cirrhosis and liver cancer. An estimated 170 million people worldwide are chronically infected with HCV and 3 to 4 million people are infected each year. One of the major handicaps of the HCV research is the lack of effective in vitro culture systems and animal models. To adress this issue, we chose a recombinant approach to study the E1, E2 and p7 proteins of HCV.The E1, E2 and p7 proteins are involved in critical steps of the viral cycle. They are membrane proteins, a class of protein that is extremely complex to express. Indeed, overexpression of membrane proteins is often toxic to the host cells. This phenomenon is caused by protein aggregation or degradation in the cytoplasm due to a lack of available membrane space for their integration into the host cell. Moreover, overexpression of membrane proteins induces saturation of the cellular machinery linked to membrane proteins. This diversion prevents the flow of a normal cell cycle and is fatal to the host cell. Destabilization of the host cell's membrane and its homeostatis may also be caused by the high concentration of membrane proteins or their heterologous nature. To circumvent these limitations, we used a method for producing membrane proteins in their native form by a cell-free system in the presence of liposomes; a technology patented by the University Joseph Fourier and licenced by the startup company Synthelis. First, we have set up the cell-free production system using a bacterial lysate from E. coli and a complementary energy mix. We then used this system to study the p7 viroporine. This protein is essential for the production of infectious virus particles and is involved in viral assembly making it an attractive therapeutic target. The production of a large quantity of p7 proteoliposomes allowed us to characterize the protein by biochemical and biophysical techniques. We have demonstrated the inhibition of oligomerization of p7 by HMA, which thereby inhibits its ion channel function. Thanks to the flexibility of the cell-free expression system we have characterized the structure of the viroporine within the membrane in a neutron reflectivity assay and have confirmed the funnel shape of the protein complex. Preliminary results on proteoliposomes E1E2 offer hope for the production viral particles mimicking the hepatitis C virus in order to better study the virus and fight against this epidemic.Together, these results confirm the suitability of the expression of membrane proteins in native forms using a cell-free system in the presence of liposomes. Proteoliposomes products are a new tool for the study of HCV and consideration for very broad therapeutic applications and the development of biopharmaceuticals based on the use of recombinant membrane proteins.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-15T16:15:07Z No. of bitstreams: 1 Sione Passini Prevalência de infecção... 2013.pdf: 2410664 bytes, checksum: 9fd8b1765a81738455f4e2fc95fd769a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-15T16:15:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sione Passini Prevalência de infecção... 2013.pdf: 2410664 bytes, checksum: 9fd8b1765a81738455f4e2fc95fd769a (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A transmissão materno-infantil (TMI) do vírus da hepatite C (VHC) ocorre em 4%-13% das gestações quando a mãe é infectada, e poucos estudos de prevalência foram realizados em gestantes no Brasil. O objetivo desta pesquisa foi determinar a prevalência de infecção e fatores associados à presença de infecção pelo VHC em gestantes, e determinar a taxa de TMI do VHC. O estudo foi realizado em Salvador, no período entre Maio de 2009 e Abril de 2011, na Maternidade Referência Professor José Maria Magalhães Netto. Todas as voluntárias que assinaram ao TCLE, tiveram seus prontuários revisados e tiveram amostra de soro coletada para a realização do teste rápido anti-VHC (Bioeasy), ELISA 3ª geração (Artech), e detecção do VHC-RNA Qualitativo e Quantitativo (AMPLICOR HCV TESTE, ROCHE versão 2.0). Em uma subamostra de gestantes selecionada aleatoriamente, realizouse entrevista para analisar fatores sócio-demográficos e de exposição ao VHC não disponíveis nos prontuários. A análise estatística descritiva e de associação foram realizadas utilizando o programa EPI Info 3.5.3 (CDC, Atlanta, GE, EUA). Foram incluídas no estudo 3.049 gestantes, sendo que 8 (0,26%; IC 95%: 0,12%-0,50%)foram soropositivos para o anti-VHC pelo ELISA e 6 (0,20%; IC 95%: 0,08%-0,41%) confirmaram viremia. Todos os VHC genotipados pertenceram ao genótipo 1, 1a ou 1b. Os principais fatores associados à infecção materna pelo VHC foram uso de drogas, tatuagem, e infecção por HIV (p < 0,05). Das 6 gestantes com HCV positivo, 2 (33,3%; IC 95%: 6,0%-73,8%) transmitiram o HCV para seus filhos. Em um dos casos de TMI, a mãe relatou ter feito uso de drogas injetáveis e inaláveis durante a gestação, possuía tatuagem e era portadora do HIV sob tratamento antiretroviral. O recém-nascido (RN) nasceu com idade gestacional (IG) de 38 semanas através de parto cesariano eletivo. No outro caso, a mãe relatou uso de drogas injetáveis e inaláveis, possuía piercing e tatuagem, mas não foi portadora de HIV. O RN nasceu com IG de 39 semanas, através de parto normal, com tempo de ruptura da bolsa de 15 horas. Concluímos que a prevalência de infecção pelo VHC entre gestantes é baixa quando comparada à da população em geral na mesma localidade, sendo associado a uso de drogas e tatuagem. A taxa de TMI do VHC encontrada foi maior do que o esperado. Assim, estudos mais amplos serão necessários. / The mother-to-child transmission (MTCT) of hepatitis C virus (HCV) occurs in 4%- 13% of pregnancies when the mothers are infected and very few studies were conducted to determine the HCV prevalence in pregnant women in Brazil. The aim of this work was to determine the prevalence and associated factors of HCV infection in pregnant women, and the rate of the MTCT of HCV. It was conducted in Salvador, between March 2009 and April 2011, at the maternity hospital Prof. José Maria Magalhães Netto. All volunteers signed to informed consent, their medical records were reviewed and serum samples were collect for screening anti-HCV antibody by a rapid anti-HCV testing (Bioeasy), ELISA 3rd generation (Artech), and HCV-RNA qualitative and quantitative detection (AMPLICOR HCV TEST, ROCHE version 2.0). In a randomly selected pregnant women subsample, interviews were made to evaluate socio-demographic and exposure factors for HCV, not available in the records. The descriptive and association statistical analysis were performed using Epi Info 3.5.3 (CDC, Atlanta, GE, USA). The study included 3.049 pregnant women, 8 (0.26%; 95% CI: 0.12%-0.50%) were anti-HCV positive by ELISA and 6 (0.20%; 95% CI: 0.08%-0.41%) confirmed viremia. All genotypes HCV belonged to genotype 1, 1a or 1b. Injection and inhaled drug use, tattoo and piercing were the most important associated factors for the mother infection. Out of the 6 HCV infected mothers, 2 (33.3%; 95% CI: 6.0%-73.8%) transmitted HCV to their newborns. In one of the cases of MTCT, the mother reported to injection and inhaled drug user during pregnancy, had tattoo and was HIV carrier held under antiretroviral therapy. The newborn was born at gestational age (GA) 38 weeks by elective cesarean section. In the other case, the mother was also injection and inhaled drug user, had piercing and tattooing. Her newborn was born at GA 39 weeks by normal delivery, and time of rupture of membranes was estimated to be 15 hours. We conclude that the prevalence of HCV infection among pregnant women was lower than the prevalence in the general population in the same locality, been associated to drug use and tattoo. The rate of MTCT of HCV was higher than expected. Thus, larger studies are required.

L’indoléamine-2,3-dioxygénase (IDO) est une enzyme du catabolisme du tryptophane suspectée de jouer un double rôle lors des infections en contribuant aux défenses innées de l’hôte et en régulant la réponse immunitaire. IDO est exprimée au cours de l’infection par le virus de l’hépatite C (VHC). Cependant, les mécanismes moléculaires conduisant à l’expression de IDO lors de l’hépatite C et l’impact de IDO sur la réplication virale et sur la réponse immunitaire ne sont pas connus. Dans ce travail de thèse, nous avons montré que le VHC stimule l’expression de IDO dans les hépatocytes.L’expression de IDO était transitoire et coïncidait avec l’expression des interférons (IFNs) de types I et III et avec la transcription de gènes stimulés par les IFNs. L’expression de IDO était également augmentée dans les hépatocytes exposés à la présence de lymphocytes T CD4+ activés et producteurs d’IFN-γ. L’expression hépatique de IDO diminuait la réplication virale, ce qui suggère que IDO limite la diffusion du VHC dans le foie au cours de l’hépatite C. Grâce à des expériences de silencing, nous avons montré que IDO contribue à l’effet antiviral de l’IFN-α sur le VHC. L’expression de IDO était régulée par l’activation des facteurs de transcription IRF-1 et STAT-1 dans les hépatocytes infectés par le VHC. En plus de son effet antiviral sur le VHC, l’expression hépatique de IDO inhibait significativement la prolifération des lymphocytes T CD4+ activés, suggérant un rôle immunorégulateur de IDO au cours de l’hépatite C. Nos données suggèrent donc que IDO joue un double jeu lors de l’hépatite C, en limitant la réplication virale et en régulant la réponse immunitaire adaptative de l’hôte. Notre travail ouvre la voie à des expérimentations in vivo et à des études cliniques visant à préciser la place des inhibiteurs pharmacologiques de IDO dans l’arsenal thérapeutique contre le VHC. / Indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) is a tryptophan-catabolizing enzyme that plays a dual role during infectious diseases by contributing to the innate defenses against pathogens and by regulating the immune response. IDO is expressed in patients with hepatitis C virus (HCV) infection. However, the molecular mechanism of IDO induction in HCV infection and its role in the antiviral immune response remain unknown. Using primary human hepatocytes, we have shown that HCV infection stimulates IDO expression. IDO gene induction was transient and coincided with the expression of type I and type III interferons (IFNs) and IFN-stimulated genes (ISGs) in HCV-infected hepatocytes. IDO expression was also stimulated when the hepatocytes were incubated with IFN-γ-secreting CD4+ T cells. Expression of IDO prior to HCV infection significantly impaired HCV replication in hepatocytes, suggesting that IDO limits the spread of HCV in the liver. By using siRNA-mediated IDO knockdown experiments, we have shown that IDO contributes to the IFN-α-antiviral effect on HCV replication. IDO expression was regulated by IRF-1 and STAT-1 in HCV-infected hepatocytes. Hepatic IDO expression also had a significant inhibitory effect on CD4+ T cell proliferation, suggesting an immunoregulatory role of IDO during HCV infection. Our data suggest that hepatic IDO plays a dual role during HCV infection by retarding viral replication and also regulating host immune responses. This work paves the way for in vivo experiments and clinical studies aiming to determine the relevance of pharmacological inhibition of IDO during HCV infection.

Infectant près de 185 millions d’individus dans le monde, le virus de l’hépatite C (VHC) est une cause importante d’hépatite virale chronique, qui mène éventuellement à la cirrhose et au carcinome hépatocellulaire. Dans les pays développés, la principale cause d’infection chez les enfants est la transmission de la mère à l’enfant (TME) durant la grossesse ou lors de l’accouchement et qui se produit dans <10% des cas. L’évolution de l’hépatite C lors de la grossesse est mal comprise, on observe une augmentation de la charge virale au 3e trimestre de la grossesse qui redescend suite à l’accouchement. Cette diminution s’accompagne d’une augmentation significative des marqueurs sériques d’inflammation du foie et d’une détérioration de la fonction hépatique chez une proportion importante des femmes infectées. Le développement de modèles de culture in vitro a permis de reconnaître l’implication de la réponse humorale neutralisante anti-VHC dans la progression clinique de l’hépatite C. Par contre, l’impact des anticorps (AC) neutralisants et non-neutralisants dans la pathologie de l’hépatite C en grossesse reste un sujet peu étudié. Dans cette étude, nous avons mis en évidence que la pression sélective exercée par les réponses neutralisantes anti-VHC menait à une diversification de la quasiespèce du VHC chez les femmes mono-infectées ou co-infectées par le VIH. Cette diversification est associée à une fréquence réduite de TME et à des niveaux d’inflammation hépatique plus faible chez les patientes mono-infectées uniquement. Chez les patientes co-infectées, la diversification de la quasiespèce et la présence de réponses neutralisantes ne suffisent pas à diminuer les risques de TME. Nous proposons également un rôle pour les anticorps (AC) non-neutralisants dans l’exacerbation de l’inflammation hépatique chez les femmes ne présentant pas de réponses neutralisantes anti-VHC. Cette inflammation pourrait être reliée à la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC), dont le rôle dans le contrôle de la virémie reste à déterminer. Les différentes avenues entreprises afin d’élaborer un essai permettant de quantifier la réponse ADCC spécifique au VHC seront exposées dans cet ouvrage. Cette étude a ainsi contribué à mieux comprendre le rôle des réponses humorales neutralisantes et l’implication probable de l’ADCC dans la pathogénèse de l’hépatite C en grossesse. / Almost 185 million people worldwide are infected with hepatitis C virus (HCV) and are at risk of developing cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In developed countries, the major cause of infection in children is mother-to-child transmission (MTCT), which occurs in <10% of cases during pregnancy or at delivery. For reasons that remain poorly understood, HCV viral load increases in the third trimester of gestation and decreases following delivery. This situation is often followed by elevated serum markers of liver inflammation and by an exacerbation of hepatic pathology in an important fraction of infected women. The development of in vitro culture models enabled the recognition of the implication of humoral immune responses in the clinical evolution of hepatitis C. Nonetheless, the impact of neutralizing antibodies (AB) and non-neutralizing AB in the pathology of hepatitis C in pregnancy has been under-investigated. In this study, we report evidence that the selective pressure exerted by the neutralizing responses against HCV is responsible for the diversification of HCV quasispecies in HCV mono-infected women and women co-infected with HCV and HIV. This diversification was associated with a reduced frequence of MTCT and with reduced hepatic inflammation in mono-infected patients only. In co-infected patients, quasispecies diversification and the presence of neutralizing antibodies are not sufficient to reduce the risk of MTCT. We also propose a role for non-neutralizing AB in the exacerbation of hepatic inflammation in women without neutralizing activity against HCV. The elevated hepatic inflammation could be linked to the antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC), the role of which has yet to be defined in the control of HCV viremia. In the aim of elaborating a quantitative assay to measure ADCC specific for HCV, different approaches have been tested and will be presented in this monograph. This study has contributed to a better understanding of the role of neutralizing humoral responses and the likely implication of ADCC in the pathogenesis of hepatitis C in pregnancy.

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont responsables de la production d'IFN de type I au cours des infections virales. L'élimination du virus de l’hépatite C (VHC) par une thérapie basée sur l'IFN-α chez plus de 50% des patients chroniquement infectés suggère une diminution possible de la production d'IFN-α endogène par les pDC. Cependant, les pDC exposées à des hépatocytes infectés par le VHC produisent de l'IFN de type I via la signalisation du TLR7. Dans cette étude, nous avons étudié l'impact du virion du VHC sur les différentes fonctions des pDC que sont la production d’IFN-α et de TNF-α, l’expression de marqueurs de maturation et de la protéine cytotoxique TRAIL. De plus, nous sommes posés la question de l’effet de l'exposition des pDC à des hépatocytes infectés par le VHC sur l’induction des autres voies de signalisation que celle de l'IRF-7 et de l'IFN- et impliquant NF-κB nécessaire à d’autres fonctions des pDC. Nous montrons que l'exposition des pDC au virion du VHC extrait du sérum de patients ou produit en culture cellulaire induit une très faible production d'IFN-α et de TNF-α par les pDC par rapport à celle induite par le virus de l’Influenza et le virus de l'herpès de type 1 (HHV-1). Les virions complets du VHC ainsi que les particules dépourvues d’ARN viral (HCV-like particles) inhibent la production d'IFN-α des pDC stimulées avec les agonistes du récepteur « Toll-like Recptor 9 » (TLR9) (CpG-A ou HHV-1). Cependant, ils ne bloquent pas la production d'IFN-α induite par les agonistes du TLR7 (R848, virus de l’Influenza). Le niveau d’ARN messager de l'IFN-α traduit aussi de l’inhibition par le virion du VHC de la voie du TLR9 dès deux heures après stimulation par le CpG-A et corrèle avec régulation à la baisse de l'expression des ARN messagers du facteur de transcription IRF-7 et du récepteur TLR9. De plus, contrairement aux virus de l'influenza, R848 et CpG-B, les hépatocytes infectés par le VHC ne stimulent de façon significative ni la phosphorylation de la sous-unité p65 de NF-B ni la sécrétion de « tumor necrosis factor » (TNF)- par les pDC. Les cellules infectées par le VHC n'induisent pas non plus de façon significative l'expression de marqueurs de différenciation importants CD40, CCR7, et de la molécule de co-stimulation CD86 ni l’expression de TRAIL à la surface des pDC en comparaison avec les virus de l'influenza, R848 et CpG-B. Le profil de signalisation induit par les cellules infectées par le VHC chez les pDC ressemble à celui induit par le CpG-A et diffère de ceux induits par le CpG-B, R848 ou le virus de l’influenza. En conclusion, les premières interactions des particules virales aves des protéines cellulaires des pDC suivies de l'internalisation des particules et du blocage de la voie du TLR9 pourraient être à l’origine d’une détection moins efficace du virion du VHC par les pDC, et d’une production réduite d'IFN-α. De plus, nos résultats suggèrent que les hépatocytes infectées par le VHC signalisent uniquement dans les pDC via les endosomes recrutant IRF7, et que, tout comme le virion du VHC, ils n'induisent pas une réponse fonctionnelle complète des pDC. Nos résultats montrent donc un lien entre les voies de signalisation des pDC et leurs fonctions, et sont importants pour notre compréhension les mécanismes amenant à l’établissement d’une infection chronique par le VHC. / Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are responsible for the production of type I IFN during viral infections. The elimination of hepatitis C virus (HCV) is based on IFN-alpha therapy and is effective in more than 50% of chronically infected patients. This suggests a possible decrease in production of IFN-alpha by endogenous pDCs. However, pDCs exposed to HCV-infected hepatocytes produce type I IFN via TLR7 signaling. In this study, we investigated the impact of HCV virions and of HCV-infected hepatoma cells on pDC functions such as production of IFN-alpha and TNF-alpha, expression of maturation markers and cytotoxic TRAIL protein. In addition, we evaluated the effect of exposure of pDCs to cell-asociated and cell-freed HCV on induction of IRF-7 and NF-kB signaling pathways. We show that exposure of pDCs to HCV virions from serum of patients or produced in cell culture induces a very low production of IFN-alpha and TNF-alpha by pDCs compared to that induced by Influenza virus and herpes virus type 1 (HHV-1). The complete HCV virions and particles lacking viral RNA (HCV-like particles) inhibit the production of IFN-α in pDCs stimulated with agonists of Toll-like Recptor 9 (TLR9) (CpG-A or HHV-1). However, they do not block the production of IFN-alpha induced by agonists of TLR7 (R848, influenza virus). The level of IFN-alpha mRNA also show the inhibition of TLR9 pathway by HCV virions from two hours after stimulation with CpG-A and correlates with downregulation of expression of mRNA of the transcription factor IRF-7 and TLR9. Moreover, unlike influenza virus, R848 and CpG-B, hepatocytes infected with HCV do not significantly stimulate the phosphorylation of p65 subunit of NF- B or the secretion of tumor necrosis factor (TNF) -  by pDCs. Cells infected with HCV do not induce significant expression of differentiation markers CD40, CCR7, and of costimulatory molecule CD86, nor the expression of TRAIL on the surface of pDC compared with the influenza virus, and with synthetic agonists of TLR7 (R848) and TLR9 (CpG-B). The signaling profile induced by cells infected with HCV is similar to that induced by CpG-A on pDCs and differs from those induced by CpG-B, R848 or influenza virus. In conclusion, the initial interations of viral particles with cellular proteins of pDC, followed by the internalization of particles and blockade of TLR9 pathway could cause a less efficient detection of HCV virions by pDCs, and reduced production of IFN-α. Moreover, our results suggest that hepatocytes infected with HCV signalize via endosomes recruiting IRF7, and that, like the HCV virion, they do not induce a complete functional response of pDCs. Our results show a link between the signaling pathways of pDCs and their functions, and are important for understanding the mechanisms leading to the establishment of chronic infection with HCV.

La majorité des individus exposés au virus de l’hépatite C (VHC) développent une infection chronique. Une réponse immunitaire adaptative forte et soutenue est associée avec la guérison spontanée du VHC, mais les mécanismes sous-jacents demeurent mal définis. Le rôle des cellules NK et des cellules dendritiques (DC) dans la guérison spontanée du VHC est encore méconnu. Les cellules NK sont la population effectrice la plus importante de l’immunité innée car elles tuent les cellules infectées et sécrètent diverses cytokines. Les DC reconnaissent des agents infectieux et elles sont les premières à initier et réguler l’immunité adaptative. Les cellules NK et les DC interagissent également entre elles afin de réguler l’immunité innée et adaptative. L’hypothèse du projet de doctorat est que l'activité des cellules NK pendant la phase aiguë de l'infection par le VHC module la fonction des DC afin que ces dernières puissent générer une réponse immunitaire adaptative capable d'éliminer le VHC. Le premier objectif était d’établir une corrélation entre l'activité des cellules NK et l'évolution de l'infection au VHC. Nous avons observé une augmentation de la cytotoxicité, mais une diminution de la sécrétion de cytokines par les cellules NK chez les patients chroniques et qui ont résolu spontanément pendant la phase aiguë en comparaison aux contrôles non infectés, démontrant alors une dissociation entre ces deux fonctions. Nos résultats suggèrent que les cellules NK sont activées pendant la phase aiguë indépendamment de l’évolution de l’infection. Le deuxième objectif était d’établir une corrélation entre le phénotype et la fonction des DC, et l'évolution de l'infection. Nous avons d’abord observé que les DC plasmacytoïdes de tous les patients infectés ont un phénotype plus immature que les contrôles, et que ce phénotype est plus prononcé chez les patients ayant résolu spontanément. De plus, en réponse à des stimulations, nous avons observé que pendant la phase aiguë précoce, les DC myéloïdes (mDC) de tous les patients infectés indépendamment de l’évolution de l’infection produisent davantage de cytokines en comparaison aux contrôles. Cependant, cette hyperréactivité n’est pas soutenue au cours de l’évolution chronique. Le troisième objectif était d’établir une corrélation entre les interactions NK/DC et l’évolution de l’infection. Nous avons étudié la capacité des cellules NK à lyser les DC potentiellement tolérogéniques, ainsi que la capacité des DC matures à activer les cellules NK, et nous avons observé aucune différence entre les patients infectés et les contrôles. Finalement, nous avons démontré pour la première fois la capacité des DC immatures à inhiber la fonction des cellules NK. En conclusion, nous avons démontré que les cellules NK sont activées pendant la phase aiguë de l’infection par le VHC indépendamment de l’évolution de l’infection. De plus, la capacité des cellules NK à éliminer les DC potentiellement tolérogéniques est intacte. Finalement, les mDC sont hyperréactives pendant la phase aiguë de l’infection, mais cette hyperréactivité n’est pas soutenue avec la persistance de l’infection. Cette perte d’hyperréactivité des mDC ne semble pas affecter la capacité des DC à activer les cellules NK, mais elle pourrait jouer un rôle dans l’inefficacité de l’immunité adaptative à éliminer le VHC. / The majority of individuals exposed to the hepatitis C virus (HCV) develop a chronic infection. It is known that a strong and sustained adaptive immune response is associated with the spontaneous clearance of HCV, however the underlying mechanisms are not well defined. The role of natural killer (NK) cells and dendritic cells (DCs) during the spontaneous resolution of HCV remains unknown. NK cells are the primary effector population of the innate immune response which are able to kill infected cells and secrete various cytokines. On the other hand, DCs are the first cell type to initiate and regulate adaptive immunity after recognizing infectious pathogens. NK cells and DCs can also interact reciprocally to further regulate innate and adaptive immunity. Our hypothesis is that NK cell activity during acute HCV will modulate DC function to prime a highly efficient adaptive immune response resulting in viral clearance. The first aim of my project was to establish a correlation between NK cell activity and the outcome of HCV infection. We observed increased NK cell cytotoxicity, but decreased cytokine secretion during acute HCV in patients with chronic evolution as well as spontaneous resolution, further demonstrating a dissociation between these two NK cell functions. Our results suggest that NK cells are activated during acute HCV infection regardless of infection outcome. The second aim was to establish a correlation between DC phenotype, function and the outcome of infection. We observed that plasmacytoid DCs (pDCs) from all HCV-infected patients have a more immature phenotype as compared to negative controls, yet this is more pronounced in spontaneous resolvers. Furthermore, we observed that during the early acute phase, myeloid DCs (mDCs) from all HCV-infected patients, regardless of outcome, have increased production of cytokines as compared to un-infected controls in response to stimulation. However, this hyperresponsiveness of mDCs is not sustained with chronic evolution. The third aim was to establish a correlation between the NK/DC cross-talk and infection outcome. We studied the capacity of NK cells to kill potentially tolerogenic DCs, as well as the capacity of mature DCs to activate NK cells, and we observed no major differences between different stages of HCV infection and un-infected controls. However, we obtained unprecedented data which suggests that immature DCs have the capacity to inhibit NK cell function. In conclusion, our results demonstrate that NK cells are activated during acute HCV infection regardless of its outcome. Furthermore, the capacity of NK cells to kill potentially tolerogenic DCs is intact for all groups of patients. Finally, mDCs are hyperresponsive during acute HCV, but this hyperresponsiveness is not sustained with persistence of viremia. The loss of mDC hyperresponsiveness does not seem to affect the capacity of DCs to activate NK cells, but might play a role in the capacity of DCs to prime a highly efficient adaptive immune response resulting in viral clearance.

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Le virus de l’hépatite C (VHC) est une des principales causes d’hépatite chronique. La protéine F du VHC est codée par un cadre de lecture alternatif du gène de la capside, Core. La protéine F a été découverte après que l’on ait associé Core à plusieurs des fonctions pathogènes du VHC. Nous proposons donc que certaines fonctions biologiques et pathogènes attribuées à la protéine Core résultent de l’activité de la protéine F. Nous avons choisi de développer trois lignées de poissons zébrés (Danio rerio) qui expriment différentes versions de la protéine F afin d’étudier les effets de la protéine F et leur incidence dans la pathogenèse du VHC. Deux versions de la séquence codant pour la protéine F (AF11 et AUG26) et une version mutante du gène core (CoremutI) ont été introduites sur les vecteurs d’un système d’expression répressible spécifique au foie. Ces vecteurs ont été co-injectés dans des embryons unicellulaires de poissons zébrés pour générer les poissons fondateurs des lignées transgéniques. 19, 21 et 36 poissons ont été choisis comme fondateurs pour les lignées AF11, AUG26 et CoremutI respectivement. De ce nombre, 9, 11 et 11 poissons ont atteint la maturité, dans l’ordre pour les mêmes lignées, et seront croisés pour donner naissance à des lignées transgéniques stables. Les résultats de ces expériences nous permettront de mieux cerner les propriétés biologiques de la protéine F et de définir son rôle dans la pathogenèse du VHC. / Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of liver steatosis, fibrosis and hepatocellular carcinoma. HCV F protein is expressed from an alternative reading frame within the Core sequence. F protein was discovered after many of the pathogenic determinants of HCV had been associated with the effects of Core. Hence, we propose that a part of the functions attributed to Core result from the activity of the F protein. We produced and selected 19, 21 and 36 transgenic zebrafish (Danio rerio) to give rise to 3 independent lines expressing different versions of the F protein. Of these founders, 9, 11 and 11 were raised to maturity and will be bred to generate stable transgenic lines. Characterizing the phenotype of these transgenic fish will help determine the precise role of the F protein in the pathogenesis of hepatitis C.