Les cellules myéloïdes incluant les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques (DCs, dendritic cells) contribuent à la pathogénèse de l’infection à VIH-1 en participant à la dissémination du virus, mais également en représentant des réservoirs viraux potentiels. Leurs fonctions sont exploitées par le VIH-1 afin d’assurer sa propagation à travers l’organisme. Notamment, une infection à VIH-1 est associée à une altération de la présentation antigénique et la perte de lymphocytes T CD4+ spécifiques à des antigènes. L’autophagie est un processus catabolique universel impliqué dans la régulation de la présentation antigénique subséquente à la neutralisation/destruction du pathogène. Des études récentes suggèrent que le VIH-1 altère le mécanisme d’autophagie afin d’assurer sa survie. Le premier volet de ce projet de maîtrise a visé la caractérisation des effets du VIH-1 sur l’autophagie dans les DCs dérivées de monocytes circulants (MDDC, monocyte-derived dendritic cells) et l’identification des stratégies thérapeutiques pour contrecarrer ces effets. Les objectifs spécifiques ont été de : (i) caractériser l’expression de marqueurs de maturation sur des MDDC exposées au VIH-1 in vitro, (ii) quantifier l’expression des protéines liées à la régulation positive (i.e., ATG5, LC3, p62) et négative (i.e., mTOR) de l’autophagie dans les MDDC exposées au VIH, (iii) déterminer le rôle de l’autophagie dans la trans infection du VIH-1 aux lymphocytes T CD4+ et (iv) explorer l’impact de l’autophagie sur la présentation antigénique par les MDDC infectées à VIH-1 in vitro. Nos résultats démontrent qu’une exposition des MDDC au VIH-1 in vitro altère dramatiquement leur maturation et leur habileté à induire la prolifération des cellules T autologues en réponse à Staphylococcus aureus et Cytomegalovirus (CMV) mais pas la réponse induite par Staphylococcal enterotoxin B (SEB). Nous démontrons que l’exposition des MDDC au VIH s’associe à une augmentation de l’expression de la protéine mTOR totale et de sa forme phosphorylée (phospho-mTOR) et de la protéine p62. Le traitement des MDDC à la rapamycine diminue l’expression de mTOR et réduit la capacité de trans infection du VIH-1 par les MDDC, sans toutefois restaurer leur potentiel immunogène. En effet, nous observons que la rapamycine réduit l’expression de CD83 par les MDDC et augmente l’expression de CCR7, indiquant ainsi que l’effet immunosuppresseur documenté de la rapamycine est associé à une défaillance de maturation des MDDC. Le second volet de ce projet de recherche s’est intéressé à la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale chez les sujets infectés par le VIH-1 sous thérapie antirétrovirale. Les objectifs spécifiques ont été : (i) d’évaluer la présence de différentes formes d’ADN viral dans les monocytes circulants de patients infectés par le VIH-1 et (ii) de mesurer l’intégration et la réplication virale dans des macrophages dérivés de monocytes (MDM) de patients infectés sous ART. Nos résultats indiquent que les monocytes portent des formes précoces de transcription virale inverse (ADN du VIH RU5) et que, malgré une charge virale plasmatique indétectable sous ART, les MDM supportent la réplication virale. Ces données très préliminaires apportent des évidences en faveur de la contribution des cellules myéloïdes à la persistance virale sous ART et représentent une ouverture pour un projet de recherche plus complexe dans le futur. En somme, nos résultats démontrent que le VIH-1 altère le potentiel immunogène des MDDC et que la rapamycine peut être employée pour limiter la trans infection des lymphocytes T CD4+ par les MDDC. Néanmoins, l’incapacité de la rapamycine à rétablir le potentiel immunogène des MDDC incite à identifier de nouvelles stratégies manipulant l’autophagie pour une restauration optimale de la compétence immunitaire chez les sujets infectés à VIH-1. Les cellules myéloïdes jouent un rôle primordial dans la dissémination et la persistance virale et doivent donc être ciblées par les stratégies actuelles d’éradication des réservoirs du VIH sous ART. / Myeloid cells including monocytes, macrophages and dendritic cells (DC) contribute to HIV-1 pathogenesis by participating in viral dissemination but also by representing potential viral reservoirs. Myeloid cells functions are exploited by HIV in order for the virus to spread throughout the organism. Notably, HIV-1 infection is associated with alterations in antigen presentation and the loss of pathogen-specific CD4+ T-cells. Autophagy is a universal catabolic process involved in the regulation of antigen presentation subsequent to pathogen neutralization/destruction. Recent studies suggest that HIV inhibits autophagy in DC so that it survives within the host. The goal of the main part of this master’s research project was to characterize the effects of the HIV exposure on the autophagy process in monocytes-derived DC (MDDC) and to identify therapeutic strategies to counteract these effects. The specific aims were to : (i) measure the expression of maturation markers on MDDC exposed to HIV-1 in vitro (ii) quantify the expression of proteins that positively (i.e., ATG5, LC3, p62) or negatively regulate autophagy (i.e., mTOR), (iii) determine autophagy role in HIV-1 trans infection to CD4+ lymphocytes T and (iv) explore the impact of autophagy on antigen presentation by in vitro HIV-infected MDDC. Our results demonstrated that exposure to HIV in vitro dramatically impaired MDDC maturation and their ability to induce proliferation of autologous CD4+ T-cells in response to Staphylococcus aureus and Cytomegalovirus (CMV) but not Staphylococcal enterotoxin B (SEB). Exposition of MDDC to HIV-1 was associated with an increase of mTOR, phosphomTOR and p62 expression. Treatment of MDDC with rapamycin decreased mTOR expression and altered MDDC trans infection ability although it failed to restore MDDC immunogenic potential. Indeed, rapamycin diminished CD83 expression on MDDC surface and increased CCR7 expression, indicating that the documented immunosuppressive property of this drug is associated with an impaired MDDC maturation. The second part of this master’s research project focused on the contribution of myeloid cells to HIV-1 reservoir persistence under ART. The objectives were to: (i) evaluate the presence of different forms of viral DNA in circulating monocytes from HIV-1 infected subjects and (ii) determine the viral integration and replication in monocytes-derived macrophages (MDM) from infected individuals receiving viral suppressive ART. Our results show that monocytes harbor early products from viral transcription (RU5 HIV-DNA) and that MDM support viral replication. Together, these very preliminary findings bring evidences that monocytes contribute to viral persistence under ART. Overall, our results indicate that HIV alters the immunogenic potential of DC and that rapamycin limits HIV trans-infection by DC. However, the fact that rapamycin fails to restore the immunogenic potential of DC stresses the need to identify additional strategies to manipulate the autophagy process for an optimal restoration of immune competence in HIV-infected subjects. Myeloid cells play a crucial role in HIV persistence and dissemination and thus must be aimed at when elaborating an antiviral therapy.

Les progresseurs lents du VIH-1 sont de rares sujets asymptomatiques pendant plusieurs années sans thérapie antirétrovirale. Parmi ces sujets à progression lente vers le SIDA, il est possible qu’un sous-groupe perde le contrôle de leur infection après plusieurs années de contrôle. Notre laboratoire a analysé l’expression différentielle de différentes protéines et voies moléculaires associées à la perte de contrôle de l’infection: l’interleukine-32 (IL-32) est une cytokine pro-inflammatoire dont le niveau des isoformes alpha et delta a significativement diminué chez les progresseurs lents lors de la perte de contrôle. Par ailleurs, des études antérieures ont attribué, de façon intrigante, à l’IL-32 aussi bien des propriétés anti-VIH-1 que des propriétés immunosuppressives induisant un environnement propice à la réplication du VIH-1. Ce projet de maitrise s’est penché sur l’implication de l’IL-32 dans la progression de l’infection à VIH-1 avec un accent particulier sur les progresseurs lents. Nous avons principalement mesuré les niveaux d’IL-32 des sujets séropositifs comparativement aux sujets VIH négatif et estimé les fonctions de cette cytokine à travers des études longitudinales et de corrélation. Nous avons observé que l’IL-32 total demeure plus élevé chez les séropositifs comparativement aux sujets VIH négatif. Également, l’infection par le VIH-1 entraine une augmentation du niveau d’IL-32 total. De plus, après une année de thérapie antirétrovirale, les taux plasmatiques d’IL-32 total demeurent significativement plus élevés que ceux des sujets VIH négatif. Comme attendu, le taux d’IL-32 total augmente lors de la perte de contrôle de l’infection chez les progresseurs lents. Une forte concentration plasmatique d’IL-32 total coïncide avec: 1) une augmentation du taux plasmatique de sCD14 et de la cytokine pro-inflammatoire IL-6, 2) une baisse du compte cellulaire CD4 et une augmentation de la charge virale. Un taux plasmatique élevé de CCL5 pourrait prédire une faible concentration d’IL-32 total. L’isoforme alpha de l’IL-32 est plus élevée dans le plasma des sujets VIH négatif tandis que l’IL-32 gamma semble induire un environnement pro-inflammatoire et immunosuppressif. Il ressort à l’issue de ces observations que l’augmentation de l’IL-32 total est associée à la progression de l’infection à VIH-1 et pourrait constituer un biomarqueur permettant d’apprécier le pronostic de cette infection. / HIV-1 slow progressors constitute a rare population of subjects who remain asymptomatic for many years without antiretroviral therapy. Among this population, some individuals will lose control of their infection after several years of immunological control. Our laboratory has analyzed the differential expression profile of various proteins and molecular pathways associated with the loss of control of HIV infection. The pro-inflammatory cytokine interleukin-32 alpha and delta isoforms significantly decreased in slow progressors as they were losing control of their infection. Furthermore, previous studies have attributed to IL-32 both antiviral property against HIV-1 and immunosuppressive properties that can induce an environment conducive to HIV-1 replication. This project addresses the role of IL-32 in HIV-1 disease progression with a particular emphasis on slow progressors. We compared the levels of IL-32 in HIV-1 positive versus HIV-1 negative subjects and evaluated the role of this cytokine using longitudinal studies. We observed that levels of IL-32 remains higher in HIV-positive compared to HIV-negative subjects. Also, HIV-1 infection leads to increased level of IL-32. In addition, after one year of antiretroviral therapy, IL-32 plasma levels remain significantly higher than those of HIV-negative subjects. As expected, the levels of IL-32 increased as slow progressors lost control of their infection. A high plasma concentration of IL-32 predicts: 1) an increase in plasma levels of sCD14 as well as pro-inflammatory cytokine IL-6, 2) a decrease in CD4 cell count and an increase in viral load. High plasma CCL5 predicted a low concentration of IL-32. The alpha isoform of IL-32 is elevated in the plasma of HIV negative subjects while IL-32 gamma appears to induce a pro-inflammatory and immunosuppressive environment. We conclude that increased IL-32 levels are associated with progression of HIV-1 disease and could be used as a biomarker for assessing HIV-1 prognosis.

Avec près de 30 millions de morts depuis le début de la pandémie, l’infection par le VIH est un véritable fléau à l’échelle mondiale, surtout en Afrique sub-saharienne. Dans ce contexte, disposer d’une formulation microbicide efficace, facile à administrer par la voie vaginale, représenterait un outil de prévention idéal pour lutter contre cette pandémie. Ainsi, la conception rationnelle de telles formulations représente un enjeu majeur de santé publique.Ce travail décrit la recherche de formulations thermogélifiantes et mucoadhésives à base de pluronics et d’hydroxypropyl méthylcellulose (HPMC). Outre la caractérisation de leurs propriétés rhéologiques et d’adhésion, ainsi que des études en culture cellulaire suggérant une très faible toxicité de contact, ces hydrogels ont montré d’une part, leur capacité à véhiculer efficacement le peptide M48U1 (équipe L. Martin, CEA) destiné à bloquer l’entrée cellulaire du VIH et d’autre part à ralentir considérablement la diffusion de nanoparticules modèles mimant les particules virale matures du VIH-1, en comparaison d’hydrogel d'hydroxy éthylcellulose (HEC) fréquemment utilisés dans divers essais cliniques infructueux et aussi au mucus cervico-vaginal de macaque. L’ensemble des résultats suggère donc la capacité de ces formulations à constituer une double barrière, physique et pharmacologique, protectrice de la muqueuse vaginale vis-à-vis du VIH. / With nearly 30 million deaths since the start of the pandemic, HIV infection is a major problem globally, especially in sub-Saharan Africa. In this context, have an effective microbicide formulation, easily administered by the vaginal route, would be a great prevention tool to fight against this pandemic. Thus, the rational design of such formulations is a major issue of public health.This paper describes research of mucoadhesive and thermogelling formulations based on pluronics and hydroxypropyl methylcellulose (HPMC). Further characterization of their rheological properties and adhesion, and cell culture studies suggesting a very low contact toxicity, these hydrogels showed on one hand, their ability to effectively convey the peptide M48U1 (L. Martin team, CEA) for blocking the entry of HIV cellular and on the other hand to considerably slow down the diffusion of nanoparticles models mimicking viral particles mature HIV-1, compared to hydroxy ethylcellulose hydrogel (HEC) commonly used in various unsuccessful clinical trials and also in cervico-vaginal mucus of macaque. The overall results therefore suggest the ability of these formulations constitute a double barrier, physical and pharmacological, protective of the vaginal mucosa from the HIV.

La donnée de séquences nucléotidiques permet d'inférer des arbres phylogénétiques, ou phylogénies, qui décrivent leur lien de parenté au cours de l'évolution. Associer à ces séquences leur date de prélèvement ou leur pays de collecte, permet d'inférer la localisation temporelle ou spatiale de leurs ancêtres communs. Ces données et procédures sont très utilisées pour les séquences de virus et, notamment, celles du virus de l'immunodéficience humaine (VIH), afin d'en retracer l'histoire épidémique à la surface du globe et au cours du temps. L'utilisation de séquences échantillonnées à des moments différents (ou hétérochrones) sert aussi à estimer leur taux de substitution, qui caractérise la vitesse à laquelle elles évoluent.Les méthodes les plus couramment utilisées pour ces différentes tâches sont précises, mais lourdes en temps de calcul car basées sur des modèles complexes, et ne peuvent traiter que quelques centaines de séquences. Devant le nombre croissant de séquences disponibles dans les bases de données, souvent plusieurs milliers pour une étude donnée, le développement de méthodes rapides et efficaces devient indispensable. Nous présentons une méthode de distances, Ultrametric Least Squares, basée sur le principe des moindres carrés, souvent utilisé en phylogénie, qui permet d'estimer le taux de substitution d'un ensemble de séquences hétérochrones, dont on déduit ensuite facilement les dates des spéciations ancestrales. Nous montrons que le critère à optimiser est parabolique par morceaux et proposons un algorithme efficace pour trouver l'optimum global.L'utilisation de séquences échantillonnées en des lieux différents permet aussi de retracer les chaînes de transmission d'une épidémie. Dans ce cadre, nous utilisons la totalité des séquences disponibles (~3 500) du sous-type C du VIH-1 (VIH de type 1), responsable de près de 50% des infections mondiales au VIH-1, pour estimer ses principaux flux migratoires à l'échelle mondiale, ainsi que son origine géographique. Des outils novateurs, basés sur le principe de parcimonie combiné avec différents critères statistiques, sont utilisés afin de synthétiser et interpréter l'information contenue dans une grande phylogénie représentant l'ensemble des séquences étudiées. Enfin, l'origine géographique et temporelle de ce variant (VIH-1 C) au Sénégal est précisément explorée lors d'une seconde étude, portant notamment sur les hommes ayant des rapports sexuels avec des hommes. / Nucleotide sequences data enable the inference of phylogenetic trees, or phylogenies, describing their evolutionary re-lationships during evolution. Combining these sequences with their sampling date or country of origin, allows inferring the temporal or spatial localization of their common ancestors. These data and methods are widely used with viral sequences, and particularly with human immunodeficiency virus (HIV), to trace the viral epidemic history over time and throughout the globe. Using sequences sampled at different points in time (or heterochronous) is also a mean to estimate their substitution rate, which characterizes the speed of evolution. The most commonly used methods to achieve these tasks are accurate, but are computationally heavy since they are based on complex models, and can only handle few hundreds of sequences. With an increasing number of sequences avail-able in the databases, often several thousand for a given study, the development of fast and accurate methods becomes essential. Here, we present a new distance-based method, named Ultrametric Least Squares, which is based on the princi-ple of least squares (very popular in phylogenetics) to estimate the substitution rate of a set of heterochronous sequences and the dates of their most recent common ancestors. We demonstrate that the criterion to be optimized is piecewise parabolic, and provide an efficient algorithm to find the global minimum.Using sequences sampled at different locations also helps to trace transmission chains of an epidemic. In this respect, we used all available sequences (~3,500) of HIV-1 subtype C, responsible for nearly 50% of global HIV-1 infections, to estimate its major migratory flows on a worldwide scale and its geographic origin. Innovative tools, based on the principle of parsimony, combined with several statistical criteria were used to synthesize and interpret information in a large phylogeny representing all the studied sequences. Finally, the temporal and geographical origins of the HIV-1 subtype C in Senegal were further explored and more specifically for men who have sex with men.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joaoricardoadossantos_tese.pdf: 8146308 bytes, checksum: b084a50364f9159086f5311dc3310a34 (MD5) Previous issue date: 2012-02-01 / Introduction: The main aim in the use of antiretroviral drugs is delaying the progression of immunodeficiency and restoring, as much as possible, an individual s immunity, increasing the length and quality of life of people living with HIV-1-AIDS. The various polymorphisms presented by HIV-1 may have implications for the pathogenesis, transmission, diagnosis, treatment and development of vaccines which enable an effective prophylaxis. Objective: Describing the resistance profile of HIV-1 to antiretroviral drugs in patients with treatment failure in a reference unit in the treatment of AIDS in the city of Catanduva, Northwestern Region of São Paulo State. Methods: Genotyping tests of 527 patients monitored by the Department of Infectious Diseases belonging to Emilio Carlos School Hospital, located in Catanduva-SP, requested between January 2000 and December 2010 were analyzed. All sequences of the viral genome (TR and PR segment of the pol gene) were analyzed in RENAGENO sites (MS-Brazil) and reanalyzed using Stanford University s algorithm, in order to assess the presence of HIV-1 resistance mutations through updated database. Results: Most analyzed patients were male (58.02%), aged between 40 and 50 years old and had already been subjected to ART. The main therapeutic regimen was 3 ARV, followed by 62.78% of patients. The 184V mutation was the most prevalent (52.7%) among all analyzed ones. There was a high prevalence for TAM: 215Y, 41L, 67N, 210W, 70R, whereas TAM 215F and 219Q were the least frequent ones. Among the multidrug resistance-related mutations, the presence of the 118i mutation may be highlighted in 23.5% of viral genomes. Among the NNRTI mutations, the high prevalence of 103N, found in 28.57% of cases, must be emphasized; 36I mutation was the most frequent among PR leading ones. Conclusion: Analysis of the genomic profile of the virus in the population studied showed that the presence of a specific point mutation does not necessarily increase the resistance of HIV-1 to a certain drug. Interactions among polymorphisms may cause not only resistance but also susceptibility to ART. / Introdução: O principal objetivo do uso dos antirretrovirais é retardar a progressão da imunodeficiência e restaurar, tanto quanto possível, a imunidade do indivíduo, aumentando o tempo e a qualidade de vida das pessoas que vivem com HIV-1-AIDS. Os diversos polimorfismos apresentados pelo HIV-1 podem ter implicações na patogênese, na transmissão, no diagnóstico, no tratamento e no desenvolvimento de vacinas que permitam uma profilaxia eficaz. Objetivo: Descrever o perfil de resistência do HIV-1 aos antirretrovirais em pacientes com falha terapêutica em uma unidade de referência no tratamento da AIDS no município de Catanduva, Noroeste Paulista. Métodos: Foram analisados exames de genotipagem de 527 pacientes acompanhados pelo Departamento de Moléstias Infecciosas do Hospital Escola Emílio Carlos, localizado na cidade de Catanduva-SP, solicitados entre janeiro de 2000 e Dezembro de 2010. Todas as sequências do genoma viral (segmentos da TR e PR do gene Pol) foram analisadas nos sites da RENAGENO (MS-Brasil) e reanalizadas utilizando-se o algoritmo da Stanford University, a fim de avaliar a presença de mutações de resistência do HIV-1 através de banco de dados atualizado. Resultados: A maioria dos pacientes analisados pertence ao sexo masculino (58,02%) e à faixa etária entre 40 e 50 anos e já havia sido submetida à TARV. O principal esquema terapêutico utilizado foi composto por três antirretrovirais, sendo prescrito para 62,78% dos pacientes. A mutação 184V foi a mais prevalente (52,7%) entre todas as analisadas. Houve elevada prevalência para as TAM: 215Y, 41L, 67N, 210W, 70R, enquanto 215F e 219Q foram as TAM menos frequentes. Entre as mutações relacionadas à multirresistência, destacamos a presença da mutação 118I em 23,5% dos genomas virais. Dentre as mutações para ITRNN, ressalta-se a elevada prevalência da 103N, encontrada em 28,57% dos casos; a mutação 36I foi a mais frequente dentre as principais da PR. Conclusão: Análises do perfil genômico dos vírus presentes na população estudada mostraram que a presença pontual de uma determinada mutação não implica no aumento da resistência por parte do HIV-1 a determinada droga. Interações entre polimorfismos podem resultar não só em resistência, mas também em suscetibilidade à terapia antirretroviral.

Au cours de ce travail de thèse expérimental, nous nous sommes intéressés à l’étude de la localisation nucléaire et nucléolaire de la protéine de la nucléocapside (NC) du VIH-1. Des études antérieures menées au laboratoire avaient mis en évidence une très forte accumulation de la NC dans les nucléoles. Ce compartiment nucléaire est connu pour être ciblé par de nombreux virus afin de promouvoir leur réplication. Des expériences de microscopie électronique avaient révélé la structure complexe du nucléole et montré qu’il est composé de trois sous-compartiments : les centres fibrillaires, le compartiment fibrillaire dense et le compartiment granulaire dans lesquels se déroule la synthèse des ribosomes. Afin de caractériser la localisation de la NC dans ces trois sous-compartiments, nous avons développé une approche de microscopie optique à haute résolution permettant d’obtenir des images à deux couleurs avec une résolution spatiale améliorée. Pour cela, nous avons mis au point un protocole qui permet d’utiliser simultanément une protéine fluorescente photocommutable et un fluorophore organique introduit par immunomarquage. Après avoir minimisé les aberrations optiques et corrigé les dérives mécaniques inhérentes au montage, nous avons visualisé simultanément la localisation de la NC surexprimée dans des cellules HeLa avec des marqueurs spécifiques des trois sous-compartiments nucléolaires (immunomarquage). La microscopie de fluorescence à haute résolution a permis de résoudre pour la première fois les différents compartiments et de montrer que la NC se localise préférentiellement dans le compartiment granulaire. Finalement, des expériences préliminaires avec des cellules vivantes ont permis de mettre en évidence que la NC est transportée de manière active dans le noyau et qu’elle pourrait interagir directement avec des protéines nucléolaires / During this experimental thesis work, we investigated the nuclear and nucleolar localization of the nucleocapsid protein (NC) of HIV-1. Previous studies performed in our laboratory evidenced a strong accumulation of NC in a subnuclear structure called nucleolus. Playing role in multiple cellular processes, nucleolus is often targeted by viruses to promote their replication. Electron microscopy revealed three nucleolar components (fibrillar centers, dense fibrillar component and granular component) associated to specific steps of the ribosome biogenesis. To characterize the distribution of the NC in these three sub-compartments and therefore shed light on the nucleolar localization of NC during the replication cycle, we developed a high-resolution optical microscopy approach. After having minimized the optical aberrations and corrected the mechanical drifts inherent to the imaging setup, the NC-mEos2 fusion protein overexpressed in HeLa cells was visualized simultaneously with immunolabeled nucleolar markers. The use of high-resolution fluorescence microscopy enabled us to resolve for the first time the three nucleolar compartments and to demonstrate the preferential localization of NC in the granular compartment of nucleolus. Finally, preliminary experiments performed with living cells showed that NC is actively transported in the nucleus and therefore may interact directly with nucleolar proteins.

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L'intégrase (IN) du VII 1 1 catalyse l'insertion de l'ADN viral dans le génome de la cellule infectée en deux étapes: le 3' processing et le transfert de brins. Nous avons déterminé le mode de liaison d'inhibiteurs de l'IN (des dérivés des Styrylquinoléines) au domaine central de la protéine, en corrélation avec leur mécanisme d'action in vitro. Afin de comprendre les effets d'analogues de l'ADN viral sur l'activité de 3' processing et donc sur l'interaction séquence spécifique IN/ADN, nous avons prédit la structure et la flexibilité de nucléosides modifiés en 2' et d'analogues de l'extrémité LTR U5 de l'ADN viral.

L’épidémie du VIH-1 dure maintenant depuis plus de 25 ans. La grande diversité génétique de ce virus est un obstacle majeur en vue de l’éradication de cette pandémie. Au cours des années, le VIH-1 a évolué en plus de cinquante sous-types ou formes recombinantes. Cette diversité génétique est influencée par diverses pressions de sélection, incluant les pressions du système immunitaire de l’hôte et les agents antirétroviraux (ARV). En effet, bien que les ARV aient considérablement réduit les taux de morbidité et de mortalité, en plus d’améliorer la qualité et l’espérance de vie des personnes atteintes du VIH-1, ces traitements sont complexes, dispendieux et amènent leur lot de toxicité pouvant mener à des concentrations plasmatiques sous-optimales pour contrôler la réplication virale. Ceci va permettre l’émergence de variantes virales portant des mutations de résistance aux ARV. Ce phénomène est encore plus complexe lorsque l’on prend en considération l’immense diversité génétique des différents sous-types. De plus, le virus du VIH est capable de persister sous forme latente dans diverses populations cellulaires, rendant ainsi son éradication extrêmement difficile. Des stratégies pouvant restreindre la diversité virale ont donc été préconisées dans le but de favoriser les réponses immunes de l’hôte pour le contrôle de l’infection et d’identifier des variantes virales offrant une meilleure cible pour des stratégies vaccinales ou immunothérapeutiques. Dans cet esprit, nous avons donc étudié, chez des sujets infectés récemment par le VIH-1, l’effet du traitement ARV précoce sur la diversité virale de la région C2V5 du gène enveloppe ainsi que sur la taille des réservoirs. En deuxième lieu, nous avons caractérisé la pression de sélection des ARV sur des souches virales de sous types variés non-B, chez des patients du Mali et du Burkina Faso afin d’évaluer les voies d’échappement viral dans un fond génétique différent du sous-type B largement prévalent en Amérique du Nord. Notre étude a démontré la présence d’une population virale très homogène et peu diversifiée dans les premières semaines suivant l’infection, qui évolue pour atteindre une diversification de +0,23% à la fin de la première année. Cette diversification est plus importante chez les sujets n’ayant pas initié de traitement. De plus, ceci s’accompagne d’un plus grand nombre de particules virales infectieuses dans les réservoirs viraux des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) chez ces sujets. Ces résultats suggèrent que l’initiation précoce du traitement pourrait avoir un effet bénéfique en retardant l’évolution virale ainsi que la taille des réservoirs, ce qui pourrait supporter une réponse immune mieux ciblée et potentiellement des stratégies immunothérapeutiques permettant d’éradiquer le virus. Nous avons également suivi 801 sujets infectés par des sous-types non-B sur le point de débuter un traitement antirétroviral. Bien que la majorité des sujets ait été à un stade avancé de la maladie, plus de 75% des individus ont obtenu une charge virale indétectable après 6 mois d’ARV, témoignant de l’efficacité comparable des ARV sur les sous-types non-B et B. Toutefois, contrairement aux virus de sous-type B, nous avons observé différentes voies moléculaires de résistance chez les sous type non-B, particulièrement chez les sous-types AGK/AK/K pour lesquels les voies de résistances étaient associées de façon prédominante aux TAM2. De plus, bien que la divergence entre les virus retrouvés chez les patients d’une même région soit faible, nos analyses phylogénétiques ont permis de conclure que ces mutations de résistance se sont produites de novo et non à partir d’un ancêtre commun porteur de résistance. Cependant, notre dernière étude au Mali nous a permis d’évaluer la résistance primaire à près de 10% et des études phylogénétiques seront effectuées afin d’évaluer la circulation de ces souches résistantes dans la population. Ces études suggèrent qu’un contrôle de la réplication virale par les ARV peut freiner la diversité du VIH et ainsi ouvrir la voie à un contrôle immunologique ciblé, utilisant de nouvelles stratégies vaccinales ou immunothérapeutiques. Toutefois, une thérapie antirétrovirale sous-optimale (adhérence, toxicité) peut conduire à l’échappement virologique en favorisant l’émergence et la dissémination de souches résistantes. / The HIV epidemic has been ongoing for 25 years. The striking genetic diversity of this virus is a formidable obstacle to the eradication of the pandemic. Throughout the years, HIV-1 has evolved in more than fifty subtypes and circulating recombinants forms. This evolution is shaped by selective pressures including the host immune responses and sub-optimal HAART treatment. In the era of HAART, HIV associated morbidity and mortality has decreased dramatically and significantly improved the life expectancy of infected individuals. However, treatments are complex, expensive and are associated with toxicity. When viral replication is not fully contained, drug mutations arise which further complicate treatment options. This phenomenon is even more complex when taking into account the great genetic diversity of various HIV-1 subtypes. HIV also has the capacity to persist in different cellular population and thus eradication is extremely difficult to achieve. Strategies aiming at limiting viral diversity and improving the host immune responses to control HIV replication are needed. The identification of conserved viral variants could ultimately be useful in vaccine design or as an immunotherapeutic target. Thus, we have studied the effects early HAART during primary HIV infection has on viral diversity in the C2V5 region of the env gene and on the size of viral reservoir. We then characterized the selective pressure of ARV on non-B subtype and evaluated drug resistance pathways in non-B HIV genetic background in infected subjects from Mali and Burkina Faso as they initiated treatment. Our study demonstrated a homogenous viral population during the first weeks post infection. Viral diversity did increase during the first year to reach +0.23% at the end of the first year post infection. Patients not initiating treatment exhibited a higher magnitude of viral diversity, and the size of their viral reservoir as determined by the number of infectious units per million PBMC’s also reached higher values. Our results suggest that early treatment, by slowing viral evolution and size of viral reservoir, could permit strong immune system responses against contemporaneous viruses and could help achieved eradication. In another study, we followed 801 patients infected with non-B subtype who were about to start antiretroviral therapy. The majority of these patients were at advanced stages of the infection. Nevertheless, more than 75% achieved undetectable viral load after 6 months of therapy. This very encouraging result led us to conclude that antiretroviral therapy was efficient in controlling replication in non-B subtype infection at similar level than in subtype B infection. In contrast to subtype B infection, we observed different molecular resistance pathways in non-B subtypes, particularly in the AGK/AK/K subtype for which mutations were predominantly associated with the TAM2 pathway. Although our phylogenetic analysis showed a very closely related viral population in our population, we were able to determine that those mutations were not from a common ancestral virus transmitted in this population but rather were emerging de novo in those patients. We conducted another study in Mali and our results showed a primary drug resistance frequency of 10%. We are now conducting phlylogenetic studies to evaluate the prevalence of drug resistance virus transmission in this population. Our studies suggest that controlling viral replication by treatment could delay viral evolution. A slower viral diversity could have a beneficial effect on the immune system and could lead to the development of new vaccines or immunotherapeutics strategies. However, sub-optimal drugs concentrations (poor adherence, toxicitiy) could lead to viral escape and emergence of virus bearing drug resistance mutations which could further be disseminated in the population.

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une déplétion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en l’absence de traitements anti-rétroviraux, conduit inéluctablement à la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mécanismes impliqués dans ce dysfonctionnement de la réponse cellulaire T ont été élucidés et ont révélé un rôle important de la molécule PD-1 dans l’exhaustion des cellules T en phase chronique de l’infection. En effet, des niveaux élevés de PD-1 ont été associés à une charge virale élevée ainsi qu’à une diminution de la production de cytokines et de la capacité de proliférer des cellules T spécifiques du virus. De plus, bloquer in vitro l’interaction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rétabli la fonction de ces cellules. De façon intéressante, notre groupe ainsi que d’autres équipes, ont montré que l’expression de PD-1 était non seulement augmentée sur les cellules spécifiques de l’antigène mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant à l’impact de l’expression de PD-1 sur le renouvellement et la différenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de l’infection. L’expression de PD-1 n’a notamment pas été étudiée en phase aigue de l’infection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue qu’en phase chronique de l’infection, l’expression de PD-1 est augmentée sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naïves. Nous avons également mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phénotype plus différencié, et ce à tous les stades de la maladie. Dans cette thèse, nous discutons le rôle possible de PD-1 dans l’homéostasie des cellules T chez les individus infectés par le VIH-1. En étudiant la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection, nous avons trouvé que les sous-populations T CD8+ des individus récemment infectés exprimaient moins de PD-1 que celles des individus à un stade plus avancé de la maladie. Ces niveaux plus élevés de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associés à des niveaux réduits de prolifération in vivo – comme mesuré par l’expression de Ki67 – suggérant que l’expression de PD-1 est partiellement impliquée dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naïves s’accumulent en fréquence lors de la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection. Considérant que les cellules naïves expriment déjà des hauts niveaux de PD-1, nous avons émis l’hypothèse que l’activation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infectés est affectée. En résumé, nous proposons un modèle où des hauts niveaux d’expression de PD-1 sont associés à (1) un dysfonctionnement de la réponse cellulaire T CD8+ et (2) un défaut d’activation des cellules naïves ce qui contribue non seulement à la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter l’efficacité de potentiels vaccins dans l’infection par le VIH-1 en empêchant toute nouvelle réponse d’être initiée. Afin de mieux disséquer la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection comme celle du VIH-1, nous avons développé un outil qui permet de détecter les cellules T CD4+ i.e. des tétramères de CMH de classe II. Ces réactifs ont pour but d’augmenter l’avidité du CMH de classe II pour son ligand et donc de détecter des TCR de faible affinité. Dans cette thèse, nous décrivons une méthode originale et efficace pour produire diverses molécules de HLA-DR liant de façon covalente le peptide antigénique. Mieux déterminer les mécanismes responsables de l’exhaustion des cellules T dans l’infection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que développer des outils de pointe pour suivre ces réponses T, est central à une meilleure compréhension de l’interaction entre le virus et le système immunitaire de l’hôte, et permettra ainsi le développement de stratégies pertinentes pour lutter contre l’infection par le VIH-1. / HIV-1 infection leads to a progressive CD4+ T cell depletion and T cell dysfunction, which in the absence of successful anti-retroviral therapy, results in individuals progressing to AIDS. Some of the underlying mechanisms for this T cell dysfunction have been elucidated and reveal an important role for the inhibitory receptor program death-1 (PD-1) in T cell exhaustion during chronic HIV-1 infection. Indeed, PD-1 up regulation correlates with increased viral load as well as decreased cytokine production and proliferative capacity of HIV-1 specific T cells. Moreover, blocking in vitro the interaction of PD-1 with its counter-receptor PD-L1 using antibodies restores HIV-1 specific T cell effector functions. Interestingly, our group and others have shown that levels of PD-1 during chronic HIV-1 infection are not only up regulated on virus-specific T cells but also on the total pool of CD4+ and CD8+ T cells. However, little is known about the impact of PD-1 expression on the turnover and maturation status of the PD-1 expressing cells during the course of the disease. Of note, PD-1 expression has never been investigated in acute HIV-1 infection. In this thesis, we clearly show that, in both acutely and chronically HIV-1 infected individuals, PD-1 is up regulated on all T cell subsets, including naïve T cells. We also uncovered an abnormal distribution of T cell subsets toward a more differentiated phenotype at all stages of the disease. In this thesis, we discuss the possible role of PD-1 in the homeostasis breakdown observed in HIV-1 infected individuals. More interestingly, if we focus on the transition from the acute to the chronic phase of the infection, we found that PD-1 is expressed at much lower levels on total CD8+ T cell subsets from acutely infected individuals than chronically infected individuals. These augmented PD-1 expression levels on CD8+ T cell in chronic infection are associated with reduced levels of in vivo cell proliferation - as monitored by Ki67 expression - suggesting that PD-1 expression may be partially responsible for the loss of CD8+ T cell function. In addition, naïve T cells accumulate in frequency during the transition from the acute to the chronic phase of the infection. Considering that naïve T cells already express high levels of PD-1, we hypothesize that priming of T cell might be impaired in chronically infected individuals. Altogether, we propose a model where high PD-1 expression is associated with (1) impaired CD8+ T cell function in chronic HIV-1 infection and suggest that lower levels of PD-1 may partially preserve the CD8+ T cell function and (2) impaired priming of T cells contributing to the progressive immunodeficiency in HIV-1 infection but also limiting the effectiveness of vaccine strategies by preventing any new responses to be triggered. To better understand immune responses in infection such as HIV-1 disease, we next developed multimeric reagents for the detection of CD4+ T cells, namely tetramers of HLA-DR molecules. These reagents aim at increasing the overall avidity of peptide-MHC class II complexes to detect low affinity TCRs. In this thesis, we describe a versatile and efficient method to produce different soluble HLA-DR molecules covalently linked to antigenic peptides. Gaining further insights into mechanisms underlying T cell exhaustion and disease progression, in addition to the development of state-of-the-art immune monitoring tools, will be crucial in better understanding of the interplay between the virus and the host immune system, leading to rational strategies in the fight against the AIDS epidemic.