Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Las Amelogénesis Imperfecta (AI) constituyen un grupo heterogéneo de desórdenes del desarrollo del esmalte de origen genético. Afectan tanto la estructura como la apariencia del esmalte en diferentes grados, de todos o casi todos los dientes, afectando tanto la dentición temporal como permanente. De acuerdo a la clasificación más ampliamente utilizada, las AI se agrupan en 4 fenotipos clínicos: AI hipoplásicas, hipocalcificadas, hipomaduras e hipomaduras/hipoplásicas con taurodontismo y cuando sobre estos tipos principales se consideran algunos rasgos secundarios específicos del esmalte y además el patrón de herencia se obtienen 15 subtipos diferentes de AI. Hasta la fecha, sólo se han descrito mutaciones causales de AI en 13 genes: amelogenina (AMELX), enamelina (ENAM), ameloblastina (AMBN), cadena β-3 de laminina (LAMB3), cadena β-6 de integrina (ITGB6), enamelisina (MMP20), calicreina 4 (KLK4), proteína 72 con repetidos WD (WDR72), marco de lectura abierto 26 del cromosoma 4 (C4orf26), transportador de solutos 24 A4 (SLC24A), molécula de interacción estromal 1 (STIM1), gen de la familia con similitud de secuencia 83, miembro H (FAM83H) y colágeno 17 (COL17A1). El propósito de este estudio fue comparar los fenotipos clínicos de tres familias chilenas afectadas con AI de tipo hipomadura/ hipomineralizada y dos sujetos control, entre sí y con los datos de la literatura, mediante la realización de un análisis clínico-radiográfico y genético-molecular. Específicamente, se determinó la presencia/ausencia de cinco mutaciones reportadas hasta la fecha en el gen que codifica el miembro A4 de la familia 24 de proteínas transportadoras de solutos (SLC24A4) en tres probandos de tres familias chilenas. Para ello, las familias reclutadas fueron examinadas intra y extra-oralmente y se obtuvieron registros fotográficos, radiográficos y antecedentes genealógicos de los participantes. Mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación directa se analizaron las regiones codificantes y secuencias intrónicas adyacentes de los exones en donde se han localizado cada una de las mutaciones reportadas en el gen SLC24 A4. El análisis bioinformático de los resultados de secuenciación reveló que las mutaciones: g.136454C>G, g.169158A>G, g.173757del, g.124552C>A y g.165151T>G, no están presentes en el ADN genómico de los probandos de las tres familias chilenas analizadas. Sin embargo, se detectó dos variantes de secuencia; una fue clasificada como un cambio intrónico (vecindad exón/intrón 11) que estaba presente en un sujeto control y en el probando de la familia FAI19 y la otra, fue una sustitución sinónima que se encontró en la región codificante del mismo exón, en los probandos de las familias FAI23 y FAI30. Dada la naturaleza de las variantes detectadas, es poco probable que estas sean causales de AI en estas familias. Esto sugiere que otros factores genético-etiológicos podrían estar implicados y que las mutaciones descritas en poblaciones de otros orígenes no son frecuentes en la nuestra. / Adscrito a Proyecto Fondecyt No. 1140905.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Introducción: Las Amelogénesis Imperfectas (AI) son un grupo heterogéneo de defectos hereditarios que afectan la formación del esmalte dental en calidad y cantidad, pudiendo presentarse en dentición primaria como permanente. Es una condición de baja prevalencia (1 en 700 a 1 en 14000), pero con grandes complicaciones para quienes la padecen en sus formas más severas. Clínicamente se pueden distinguir tres tipos principales: AI hipoplásica, hipocalcificada e hipomadura, cada una relacionadas con una etapa del desarrollo del esmalte. También se ha descrito la existencia de familias que presentan fenotipos combinados. Esta patología se transmite en forma autosómica dominante, autosómica recesiva, ligada al cromosoma X o como casos esporádicos. Actualmente, se conoce la existencia de mutaciones en 5 genes que participan en la etiología genética de AI hipomadura: enamelisina (MMP-20), calicreína 4 (KLK4), proteína 72 con repetidos WD (WDR72), transportador de solutos 24 A4 (SLC24A4) y molécula de interacción estromal 1 (STIM1). Objetivo General: El propósito de este trabajo fue analizar clínico-radiográfica y genético-molecularmente probandos de familias chilenas afectadas con AI de tipo hipomadura y determinar la presencia/ausencia de las mutaciones g.7143G>A y g.6930delG reportadas en el gen calicreina-4 (KLK4). Materiales y métodos: Se realizó el análisis clínico y radiográfico de 6 familias que fueron diagnosticadas con AI hipomadura y se analizó molecularmente el ADN de 6 probandos, utilizando las técnicas de PCR, secuenciación directa (Sanger) y análisis bioinformático de las secuencias con programas computacionales. Resultados: No se detectó ninguna de las mutaciones estudiadas en los 6 probandos analizados de las familias chilenas. Conclusiones: Se refuerza el carácter heterogéneo de esta patología, descartando la presencia de mutaciones descritas en otras poblaciones en el exón 3 de KLK4 en nuestras familias, pero no se descarta la posibilidad de encontrar mutaciones en otras zonas del gen o en otros genes implicados en AI. / Adscrito a Proyecto Fondecyt No. 1140905

Introducción: Malaria representa una emergencia médica debido a la posible complicación y muerte del paciente cuando este no fue tratado apropiadamente. Malaria severa y/o complicada (MSC) es causada casi exclusivamente por Plasmodium falciparum. Uno de los factores de riesgo asociado con MSC es el tratamiento inadecuado de los casos de malaria no complicada (MNC). Objetivos: Se genotipificó a los genes dihidrofolato reductasa (Pfdhfr) y dihidropteroato sintasa (Pfdhps) en muestras de 60 pacientes con MSC. La resistencia al tratamiento combinado sulfadoxina-pirimetamina (SP) es causado principalmente por mutaciones puntuales en esos genes Diseño de estudio: Los pacientes con MSC de este estudio fueron enrolados durante el brote de malaria de 1998, cuando SP era la primera línea de tratamiento. Materiales y métodos: Se usó el método de secuenciamiento de Sanger para la identificación de los polimorfismos en el gen Pfdhfr y los métodos PCR-RFLP y PCR alelo-específico para el gen Pfdhps. Resultados: Se encontró que el 84% de las muestras tenían el genotipo del parásito cuádruple mutante N51I/S108N/I164L/inserción repetición Bolivia, y el 16% restante el genotipo mutante simple S108N. Con respecto al gen Pfdhps, encontramos cuatro genotipos, siendo el triple mutante A437G/K540E/A581G el más frecuente (78%). Conclusiones: Observamos que las mutaciones I164L de Pfdhfr y K540E de Pfdhps en los casos de MSC fueron más del doble de frecuente comparado con los reportes publicados en casos de MNC en la misma área y periodo de estudio. / --- Introduction: Malaria represents a medical emergency because it may rapidly progress to complication and death without prompt and appropriate treatment. Severe and/or complicated malaria (SCM) is almost exclusively caused by Plasmodium falciparum. One of the risk factors associated with SCM is an inappropriate treatment of the noncomplicated malaria (NCM). Objectives: We genotyped the dihydrofolate reductase (Pfdhfr) and dihydropteroate synthase (Pfdhps) genes from 60 SCM patients. Resistance to SP in P. falciparum is caused mainly by specific mutations at those genes. Study design: SCM patients of this study were enrolled during the malaria outbreak in 1998, when sulfadoxine/pyrimethamine (SP) was the first line of treatment. Material and methods: We used a Sanger sequencing approach for the identification of polymorphisms at Pfdhfr gene codons, and in the case of Pfdhps gene we used a PCRRFLP and PCR allele-specific methodology. Results: We found that 84% of samples harbored a quadruple mutant genotype N51I/S108N/I164L/insertion Bolivia repeat, and the left 16% of the sample contained an infection with a simple mutant genotype (S108N). Regarding the Pfdhps gene, we found four genotypes, the triple mutant genotype A437G/K540E/A581G was the more frequent (78%). Conclusions: We observed that the mutations I164L and K540E, known as highly predictor to SP resistance, in this group of patients with SCM were twice of frequency of the mutations from patients with NCM from published reports, also in the same area and period of study. / Tesis

La Leucoencefalopatía Megalencefálica con Quistes Subcorticales (MLC) es un tipo raro de leucodistrofia vacuolizante, que presenta como principales características clínicas macrocefalia, deterioro de las funciones motoras, epilepsia y retraso mental medio. Sin embargo, el diagnóstico de MLC se confirma mediante imágenes de resonancia magnética, donde el encéfalo se presenta atrofiado e hinchado, muestra una sustancia blanca anormalmente difusa y hay presencia de quistes subcorticales. Desde el punto de vista fisiopatológico, una biopsia obtenida de un paciente de MLC muestra la presencia de numerosas vacuolas situadas en las láminas más externas de la mielina. Se ha encontrado un primer gen responsable de la enfermedad en el 75% de los pacientes afectados, denominado MLC1. Se han descrito alrededor de 60 mutaciones, aunque existen pacientes que manifiestan las características clínicas de la enfermedad pero no presentan mutaciones en MLC1 ni presentan ligamiento con su locus, sugiriendo que existe al menos otro gen involucrado en la enfermedad. En el 25% de pacientes restantes, la enfermedad se manifiesta de dos maneras diferentes: en un caso, los enfermos presentan las mismas características clínicas que los pacientes con mutaciones en MLC1; y en el otro, presentan síntomas transitorios y los pacientes mejoran, llegando incluso a que la enfermedad remitiera. El gen MLC1 codifica para una proteína transmembrana que lleva el mismo nombre. Su función es todavía desconocida. Aunque muestra un bajo grado de homología con el canal de potasio Kv1.1 no se ha podido detectar actividad de canal iónico en diferentes sistemas heterólogos. No obstante, dicha homología, su confinamiento en la membrana plasmática y el fenotipo característico vacuolizante de los pacientes sugieren que la proteína podría estar mediando la translocación de iones a través de la superficie celular. El total desconocimiento del rol preciso de la proteína MLC1 ha imposibilitado el entendimiento del mecanismo patofisiológico de la enfermedad, y por ello, no se ha podido desarrollar ningún tratamiento efectivo para los pacientes afectados. Es por ello que nuestro grupo quiso apostar por estrategias innovadoras (combinación de bioquímica y genética) para poder encontrar otros genes responsables de la enfermedad. Usando técnicas de purificación por afinidad combinada con métodos de proteómica cuantitativa encontramos a GlialCAM como una proteína que estaba asociada con MLC1. Es por eso que decidimos estudiar (en colaboración) si los pacientes que no tenían mutaciones en MLC1 podían presentar mutaciones en GLIALCAM. Tras el análisis de 40 de estos pacientes encontramos que cuando los enfermos tenían las características clínicas típicas de MLC presentaban dos mutaciones en GLIALCAM (herencia recesiva); mientras que en el caso de aquellos que mejoraban a lo largo del tiempo, éstos solo presentaban una mutación (herencia dominante), demostrando que GLIALCAM es el segundo gen de MLC. En este estudio también se ha podido determinar que mutaciones dominantes en GLIALCAM podían también causar otras enfermedades como la macrocefalia familiar benigna y la macrocefalia con retraso mental, con o sin autismo. Estudios bioquímicos posteriores han permitido avanzar en el entendimiento de la relación que existe entre MLC1 y GlialCAM. Así se ha demostrado que GlialCAM actúa como una molécula escolta, necesaria para localizar específicamente a MLC1 en uniones celulares. De esta forma pudimos descubrir que las mutaciones en GLIALCAM provocaban un defecto en el tráfico de la proteína debido a una deficiente oligomerización. Como consecuencia, estas mutaciones provocaban la deslocalización de los complejos de MLC1-GlialCAM en las uniones astrocitarias. De forma interesante, GlialCAM permite estabilizar la proteína MLC1, sugiriendo nuevas aproximaciones terapéuticas para los pacientes afectos con MLC. Tras el descubrimiento de GlialCAM como segundo gen de MLC gracias a la aproximación proteómica, y tras comprobar que no todo GlialCAM estaba asociado a MLC1, nos planteamos volver a realizar estudios de proteómica para intentar encontrar posibles proteínas que pudiesen estar interaccionando con GlialCAM. De esta manera encontramos que el canal de cloruro ClC-2, estaba asociado con GlialCAM, y pudimos comprobar que GlialCAM también actuaba como molécula escolta para localizar específicamente a ClC-2 en las uniones entre células. Además, también era capaz de modificar sus propiedades de canal, así como aumentar su función, demostrándose interacción directa entre ambas proteínas. Igualmente que para el caso de MLC1, las mutaciones encontradas en GLIALCAM fallaban en la capacidad de concentrar a ClC-2 en las uniones astrocitarias. Por tanto, la función de GlialCAM podría ser necesaria para agrupar tanto a MLC1 como a ClC-2 en tales uniones, particularmente en los pies terminales astrocitarios, donde podrían estar llevando a cabo su función. ClC-2 podría ser necesario para desarrollar un flujo de Cl- transcelular o para compensar gradientes electroquímicos iónicos que pueden estar ocurriendo en dichas uniones durante cambios en la osmolaridad. El descubrimiento de GlialCAM como una subunidad auxiliar de ClC-2 incrementa la compleja regulación de este canal y proporciona nuevas ideas acerca del papel que ClC-2 puede estar desempeñando en las células gliales así como se sugiere que pueda estar involucrado en la fisiopatología de MLC. / Megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts (MLC) is a leukodystrophy characterized by early-onset macrocephaly and delayed-onset neurological deterioration. Recessive MLC1 mutations are observed in 75% of patients with MLC. Genetic-linkage studies failed to identify another gene. We have showed that some patients without MLC1 mutations display the classical phenotype; others improve or become normal but retain macrocephaly. To find another MLC-related gene, we used quantitative proteomic analysis of affinity-purified MLC1 as an alternative approach and found that GlialCAM, an IgG-like cell adhesion molecule, is a direct MLC1-binding partner. Analysis of 40 MLC patients without MLC1 mutations revealed multiple different GLIALCAM mutations. Patients with the classical phenotype had two mutations, and patients with the improving phenotype had one mutation. In addition, patients with dominant GLIALCAM mutations, could also had macrocephaly and mental retardation with or without autism. Therefore, we found that GLIALCAM is the second gene found to be mutated in MLC. Furthermore, we demonstrated that GlialCAM functions as an MLC1 beta-subunit, needed for proper localization of MLC1 in cell-cell junctions. We also demonstrated that MLC1 and GlialCAM form homo- and hetero-complexes and that MLC-causing mutations in GLIALCAM mainly reduce the formation of GlialCAM homo-complexes, leading to a defect in the trafficking of GlialCAM alone to cell junctions. GLIALCAM mutations also affect the trafficking of its associated molecule MLC1, explaining why GLIALCAM and MLC1 mutations lead to the same disease: MLC. In this thesis, we also identify GlialCAM as a chloride channel ClC-2 binding partner. GlialCAM and ClC-2 colocalize in Bergmann glia, in astrocyteastrocyte junctions at astrocytic end-feet around blood vessels, and in myelinated fiber tracts. GlialCAM targets ClC-2 to cell junctions, increases ClC- 2 mediated currents, and changes its functional properties. Disease-causing GLIALCAM mutations abolish the targeting of the channel to cell junctions. Hence, we describes the first auxiliary subunit of ClC-2 and suggests that ClC-2 may play a role in the pathology of MLC disease.

Tesis por compendio / [ES] La medicina actual se dirige hacia un enfoque más personalizado basándose en el diagnóstico molecular del paciente a través del estudio de biomarcadores específicos. Aplicando este principio molecular, el diagnóstico, pronóstico y selección de la terapia se apoyan en la identificación de variaciones específicas del genoma humano, como variaciones de un único nucleótido (SNV). Para detectar estos biomarcadores se dispone de una amplia oferta de tecnologías. Sin embargo, muchos de los métodos en uso presentan limitaciones como un elevado coste, complejidad, tiempos de análisis largos o requieren de personal y equipamiento especializado, lo que imposibilita su incorporación masiva en la mayoría de los sistemas sanitarios. Por tanto, existe la necesidad de investigar y desarrollar soluciones analíticas que aporten información sobre las variantes genéticas y que se puedan implementar en diferentes escenarios del ámbito de la salud con prestaciones competitivas y económicamente viables. El objetivo principal de esta tesis ha sido desarrollar estrategias innovadoras para resolver el reto de la detección múltiple de variantes genéticas que se encuentran en forma minoritaria en muestras biológicas de pacientes, cubriendo las demandas asociadas al entorno clínico. Las tareas de investigación se centraron en la combinación de reacciones de discriminación alélica con amplificación selectiva de DNA y el desarrollo de sistemas ópticos de detección versátiles. Con el fin de atender el amplio abanico de necesidades, en el primer capítulo, se presentan resultados que mejoran las prestaciones analíticas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediante la incorporación de una etapa al termociclado y de un agente bloqueante amplificando selectivamente las variantes minoritarias que fueron monitorizadas mediante fluorescencia a tiempo real. En el segundo capítulo, se logró la discriminación alélica combinando la ligación de oligonucleótidos con la amplificación de la recombinasa polimerasa (RPA), que al operar a temperatura constante permitió una detección tipo point-of-care (POC). La identificación de SNV se llevó a cabo mediante hibridación en formato micromatriz, utilizando la tecnología Blu-Ray como plataforma de ensayo y detección. En el tercer capítulo, se integró la RPA con la reacción de hibridación alelo especifica en cadena (AS-HCR), en formato array para genotipar SNV a partir de DNA genómico en un chip. La lectura de los resultados se realizó mediante un smartphone. En el último capítulo, se presenta la síntesis de un nuevo reactivo bioluminiscente que se aplicó a la monitorización de biomarcadores de DNA a tiempo real y final de la RPA basada en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), eliminando la necesidad de una fuente de excitación. Todas las estrategias permitieron un reconocimiento especifico de la variante de interés, incluso en muestras que contenían tan solo 20 copias de DNA genómico diana. Se consiguieron resultados sensibles (límite de detección 0.5% variante/total), reproducibles (desviación estándar relativa < 19%), de manera sencilla (3 etapas o menos), rápida (tiempos cortos de 30-200 min) y permitiendo el análisis simultaneo de varios genes. Como prueba de concepto, estas estrategias se aplicaron a la detección e identificación en muestras clínicas de biomarcadores asociados a cáncer colorrectal y enfermedades cardiológicas. Los resultados se validaron por comparación con los métodos de referencia NGS y PCR, comprobándose que se mejoraban los requerimientos técnicos y la relación coste-eficacia. En conclusión, las investigaciones llevadas a cabo posibilitaron desarrollar herramientas de genotipado con propiedades analíticas competitivas y versátiles, aplicables a diferentes escenarios sanitarios, desde hospitales a entornos con pocos recursos. Estos resultados son prometedores al dar respuesta a la demanda de tecnologías alternativas para el diagnóstico molecular personalizado. / [CA] La medicina actual es dirigeix cap a un enfocament més personalitzat basant-se en el diagnòstic molecular del pacient a través de l'estudi de biomarcadors específics. Aplicant aquest principi molecular, el diagnòstic, pronòstic i selecció de la teràpia es recolzen en la identificació de variacions específiques del genoma humà, com variacions d'un únic nucleòtid (SNV). Per a detectar aquests biomarcadors, es disposa d'una àmplia oferta de tecnologies. No obstant això, molts dels mètodes en ús presenten limitacions com un elevat cost, complexitat, temps d'anàlisis llargues o requereixen de personal i equipament especialitzat, la qual cosa impossibilita la seua incorporació massiva en la majoria dels sistemes sanitaris. Per tant, existeix la necessitat d'investigar i desenvolupar solucions analítiques que aporten informació sobre les variants genètiques i que es puguen implementar en diferents escenaris de l'àmbit de la salut amb prestacions competitives i econòmicament viables. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha sigut desenvolupar estratègies innovadores per a resoldre el repte de la detecció múltiple de variants genètiques que es troben en forma minoritària en mostres biològiques de pacients, cobrint les demandes associades a l'entorn clínic. Les tasques d'investigació es van centrar en la combinació de reaccions de discriminació al·lèlica amb amplificació selectiva de DNA i al desenvolupament de sistemes òptics de detecció versàtils. Amb la finalitat d'atendre l'ampli ventall de necessitats, en el primer capítol, es presenten resultats que milloren les prestacions analítiques de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) mitjançant la incorporació d'una etapa al termociclat i d'un agent bloquejant amplificant selectivament les variants minoritàries que van ser monitoritzades mitjançant fluorescència a temps real. En el segon capítol, es va aconseguir la discriminació al·lèlica combinant el lligament d'oligonucleòtids amb l'amplificació de la recombinasa polimerasa (RPA), que en operar a temperatura constant va permetre una detecció tipus point-of-care (POC). La identificació de SNV es va dur a terme mitjançant hibridació en format micromatriu, utilitzant la tecnologia Blu-Ray com a plataforma d'assaig i detecció. En el tercer capítol, es va integrar la RPA amb la reacció d'hibridació al·lel específica en cadena (AS-HCR), en format matriu per a genotipar SNV a partir de DNA genòmic en un xip. La lectura dels resultats es va realitzar mitjançant un telèfon intel·ligent. En l'últim capítol, es presenta la síntesi d'un nou reactiu bioluminescent que es va aplicar al monitoratge de biomarcadors de DNA a temps real i final de la RPA basada en la transferència d'energia de ressonància de bioluminescència (BRET), eliminant la necessitat d'una font d'excitació. Totes les estratègies van permetre un reconeixement específic de la variant d'interès, fins i tot en mostres que només contenien 20 còpies de DNA genòmic diana. Es van aconseguir resultats sensibles (límit de detecció 0.5% variant/total), reproduïbles (desviació estàndard relativa < 19%), de manera senzilla (3 etapes o menys), ràpida (temps curts de 30-200 min) i permetent l'anàlisi simultània de diversos gens. Com a prova de concepte, aquestes estratègies es van aplicar a la detecció i identificació en mostres clíniques de biomarcadors associats a càncer colorectal i a malalties cardiològiques. Els resultats es van validar per comparació amb els mètodes de referència NGS i PCR, comprovant-se que es milloraven els requeriments tècnics i la relació cost-eficàcia. En conclusió, les investigacions dutes a terme van possibilitar desenvolupar eines de genotipat amb propietats analítiques competitives i versàtils, aplicables a diferents escenaris sanitaris, des d'hospitals a entorns amb pocs recursos. Aquests resultats són prometedors en donar resposta a la demanda de tecnologies alternatives per al diagnòstic molecular personalitzat. / [EN] Current medicine is moving towards a more personalized approach based on the patients' molecular diagnosis through the study of specific biomarkers. Diagnosis, prognosis and therapy selection, applying this molecular principle, rely on identifying specific variations in the human genome, such as single nucleotide variations (SNV). A wide range of technologies is available to detect these biomarkers. However, many of the employed methods have limitations such as high cost, complexity, long analysis times, or requiring specialized personnel and equipment, making their massive incorporation in most healthcare systems impossible. Therefore, there is a need to research and develop analytical solutions that provide information on genetic variants that can be implemented in different health scenarios with competitive and economically feasible performances. The main objective of this thesis has been to develop innovative strategies to solve the challenge of multiple detection of genetic variants that are found in a minority amount in patient samples, covering the demands associated with the clinical setting. Research tasks focused on the combination of allelic discrimination reactions with selective DNA amplification and the development of versatile optical detection systems. In order to meet the wide range of needs, in the first chapter, the analytical performances of the polymerase chain reaction (PCR) were improved by incorporating a thermocycling step and a blocking agent to amplify selectively minority variants that were monitored by real-time fluorescence. In the second chapter, allelic discrimination was achieved by combining oligonucleotide ligation with recombinase polymerase amplification (RPA), which operates at a constant temperature, allowing point-of-care (POC) detection. SNV identification was carried out by hybridization in microarray format, using Blu-Ray technology as the assay platform and detector. RPA was integrated with allele-specific hybridization chain reaction (AS-HCR), in an array format to genotype SNV from genomic DNA on a chip in the third chapter. The reading of the results was performed using a smartphone. In the last chapter, a new bioluminescent reagent was synthesized. It was applied to real-time and endpoint DNA biomarker monitoring based on bioluminescence resonance energy transfer (BRET), eliminating the need for an excitation source. All the strategies allowed specific recognition of the target variant, even in samples containing as few as 20 copies of target genomic DNA. Sensitive (limit of detection 0.5% variant/total), reproducible (relative standard deviation < 19%), simple (3 steps or less), fast (short times of 30-200 min) results were achieved, allowing simultaneous analysis of several genes. As proof of concept, these strategies were applied to detect and identify biomarkers associated with colorectal cancer and cardiological diseases in clinical samples. The results were validated by comparison with reference methods such as NGS and PCR, proving that the technical requirements and cost-effectiveness were improved. In conclusion, the developed research made it possible to develop genotyping tools with competitive analytical properties and versatile, applicable to different healthcare scenarios, from hospitals to limited-resource environments. These results are promising since they respond to the demand for alternative technologies for personalized molecular diagnostics. / The authors acknowledge the financial support received from the Generalitat Valenciana PROMETEO/2020/094, GRISOLIA/2014/024 PhD Grant and GVA-FPI-2017 PhD grant, the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness MINECO projects CTQ2016-75749-R and PID2019-110713RB-I00 and European Regional Development Fund (ERDF). / Lázaro Zaragozá, A. (2022). Study of Strategies for Genetic Variant Discrimination and Detection by Optosensing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/185216 / TESIS / Compendio

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joaoricardoadossantos_tese.pdf: 8146308 bytes, checksum: b084a50364f9159086f5311dc3310a34 (MD5) Previous issue date: 2012-02-01 / Introduction: The main aim in the use of antiretroviral drugs is delaying the progression of immunodeficiency and restoring, as much as possible, an individual s immunity, increasing the length and quality of life of people living with HIV-1-AIDS. The various polymorphisms presented by HIV-1 may have implications for the pathogenesis, transmission, diagnosis, treatment and development of vaccines which enable an effective prophylaxis. Objective: Describing the resistance profile of HIV-1 to antiretroviral drugs in patients with treatment failure in a reference unit in the treatment of AIDS in the city of Catanduva, Northwestern Region of São Paulo State. Methods: Genotyping tests of 527 patients monitored by the Department of Infectious Diseases belonging to Emilio Carlos School Hospital, located in Catanduva-SP, requested between January 2000 and December 2010 were analyzed. All sequences of the viral genome (TR and PR segment of the pol gene) were analyzed in RENAGENO sites (MS-Brazil) and reanalyzed using Stanford University s algorithm, in order to assess the presence of HIV-1 resistance mutations through updated database. Results: Most analyzed patients were male (58.02%), aged between 40 and 50 years old and had already been subjected to ART. The main therapeutic regimen was 3 ARV, followed by 62.78% of patients. The 184V mutation was the most prevalent (52.7%) among all analyzed ones. There was a high prevalence for TAM: 215Y, 41L, 67N, 210W, 70R, whereas TAM 215F and 219Q were the least frequent ones. Among the multidrug resistance-related mutations, the presence of the 118i mutation may be highlighted in 23.5% of viral genomes. Among the NNRTI mutations, the high prevalence of 103N, found in 28.57% of cases, must be emphasized; 36I mutation was the most frequent among PR leading ones. Conclusion: Analysis of the genomic profile of the virus in the population studied showed that the presence of a specific point mutation does not necessarily increase the resistance of HIV-1 to a certain drug. Interactions among polymorphisms may cause not only resistance but also susceptibility to ART. / Introdução: O principal objetivo do uso dos antirretrovirais é retardar a progressão da imunodeficiência e restaurar, tanto quanto possível, a imunidade do indivíduo, aumentando o tempo e a qualidade de vida das pessoas que vivem com HIV-1-AIDS. Os diversos polimorfismos apresentados pelo HIV-1 podem ter implicações na patogênese, na transmissão, no diagnóstico, no tratamento e no desenvolvimento de vacinas que permitam uma profilaxia eficaz. Objetivo: Descrever o perfil de resistência do HIV-1 aos antirretrovirais em pacientes com falha terapêutica em uma unidade de referência no tratamento da AIDS no município de Catanduva, Noroeste Paulista. Métodos: Foram analisados exames de genotipagem de 527 pacientes acompanhados pelo Departamento de Moléstias Infecciosas do Hospital Escola Emílio Carlos, localizado na cidade de Catanduva-SP, solicitados entre janeiro de 2000 e Dezembro de 2010. Todas as sequências do genoma viral (segmentos da TR e PR do gene Pol) foram analisadas nos sites da RENAGENO (MS-Brasil) e reanalizadas utilizando-se o algoritmo da Stanford University, a fim de avaliar a presença de mutações de resistência do HIV-1 através de banco de dados atualizado. Resultados: A maioria dos pacientes analisados pertence ao sexo masculino (58,02%) e à faixa etária entre 40 e 50 anos e já havia sido submetida à TARV. O principal esquema terapêutico utilizado foi composto por três antirretrovirais, sendo prescrito para 62,78% dos pacientes. A mutação 184V foi a mais prevalente (52,7%) entre todas as analisadas. Houve elevada prevalência para as TAM: 215Y, 41L, 67N, 210W, 70R, enquanto 215F e 219Q foram as TAM menos frequentes. Entre as mutações relacionadas à multirresistência, destacamos a presença da mutação 118I em 23,5% dos genomas virais. Dentre as mutações para ITRNN, ressalta-se a elevada prevalência da 103N, encontrada em 28,57% dos casos; a mutação 36I foi a mais frequente dentre as principais da PR. Conclusão: Análises do perfil genômico dos vírus presentes na população estudada mostraram que a presença pontual de uma determinada mutação não implica no aumento da resistência por parte do HIV-1 a determinada droga. Interações entre polimorfismos podem resultar não só em resistência, mas também em suscetibilidade à terapia antirretroviral.

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic.L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini &#61537;-cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini &#61537;-cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini &#61537;-cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu.L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics. / Small heat shock proteins (sHsps,15-30 kDa) are the most abundant and diversified Hsps in plants. They have been classified according to its homology and cellular localisation in: mitochondrial, chloroplastic, endoplasmic reticulum and class I and II citoplasmic sHsps. Although sHsps-CI are involved in the stress response and accumulate at some stages of embryonic development and there is abundant work correlating stress resisitance and sHsps accumulation, the molecular mechanisms of their activity are not well known. However, in vivo and in vitro chaperone activity under temperature stress has been described. 2D immunodetection patterns of cork oak (Quercus suber) sHsps-CI (thermic, hydric and oxidative). At the 17 kDa region there is a set of protein species highly induced by temperature and, at least some of them correspond to QsHsp17.4-CI. On the other hand, protein species at the ca. 10 kDa region are highly induced under oxidative stress conditions and accumulate in the endogenous oxidatively stressed tissues xylem and phellem but not after a heat shock. PCR and RT-PCR assays allowed us to clone three new members of the sHsps-CI multigenic family in cork oak. Among them, Qshsp10-CI is specially interesting because codes for a truncated protein that lacks 55% of the &#61537;-crystallin domain and all the C-terminal extension, being the more C-terminal truncated sHsp reported to date. Overexpression of recombinant QsHsp10-CI and a more truncated protein lacking the whole &#61537;-crystallin domain in E. coli cells shows that most of the &#61537;-crystallin domain and all the C-terminal extension are dispensable, but amino acids 1 to 41 of the &#61537;-crystallin domain (including the consensus II region) are essential for sHsps-CI protective activity under temperature and oxidative stress conditions. The expression of Qshsp10-CI in response to oxidative but not temperature stress and its protective activity of E. coli cells under oxidative stress conditions points to a correspondence between Qshsp10-CI and the ca. 10 kDa protein species detected in 2D immunodetections and a protective activity of those in the oxidatively stressed phellem cells. Endogenous oxidative stress of phellem cells might generate mutations accumulation in nucleic acids. Variability analyses of DNA and mRNA of phellem cells in the coding region of Qshsp17.4-CI showed a surprisingly high rate of mutation in both mRNA (1/1784 bp) and genomic DNA (1/1520 bp). These are the highest rates described for a nuclear eukariotic genome and are similar to those detected in RNA viruses. With these mutation rates one third of mRNAs of phellem cells would contain mutations and code for abnormal proteins. No mutations were detected in root tip, a normally growing young tissue. With the aim of deeping into the nature of mutations that accumulate in phellem cells, we applied a method to in vitro select mutant sequences using restriction enzymes. The types of mutation predominant in phellem cells mRNA were those related with oxidative stress in other systems (plasmids, phages and bacterial DNA). In addition, the predominant DNA lesions that accumulate in H2O2 treated cork oak plantlets, as shown by GC-MS analyses, generate the same type of mutations detected in mRNA of phellem cells. Accordingly, the high accumulation of mutations detected in phellem cells might be due to its endogenous oxidative stress. Moreover, young and actively growing tissues are also subjected to a certain degree of base lesions and mRNA mutations. However, both mutational spectrum and accumulation levels are different compared to oxidatively stressed tissues.

Introducción: En pacientes con VIH en TARV y fallo virológico a primera línea, establecer un esquema terapéutico tras haber identificado la mutación M184V, que confiere resistencia, representa una disyuntiva. Objetivo: Comparar la respuesta virológica de los esquemas terapéuticos prescritos a pacientes con VIH que presentaron la mutación M184V en dos hospitales nacionales de Lima, Perú durante los años 2008 a 2019 y determinar los factores de riesgo asociados a una mala respuesta virológica. Métodos: Se desarrolló un estudio de cohorte retrospectivo. Resultados: Un total de 175 participantes fueron elegibles para el estudio. El sexo masculino predominó (75.4%), la mediana de edad actual fue 41 años (IQR 35.84 ; 47.47) y tiempo en TARV fue 89 meses (IQR 57.7 ; 124.53). La mediana de carga viral inicial fue 4.5 log10 (IQR 3.97 ; 5.09) y el tiempo entre la genotipificación y el cambio de terapia fue 2 meses (IQR 0 ; 3.57). El esquema antirretroviral más utilizado fue IP + 2 INTR (55.4%). Con el esquema IP + INI se obtuvo 69% menos riesgo de mala respuesta virológica [p=0.019 (IC 95% 0.117 ; 0.825)]. Conclusiones: En los pacientes con VIH y mutación M184V, el esquema IP + INI ha demostrado una mayor disminución de la carga viral de control y, así, una buena respuesta virológica. Los factores de riesgo asociados a una mala respuesta virológica fueron la demora entre la genotipificación y el cambio de terapia, niveles elevados de carga viral inicial y mala adherencia. / Introduction: In patients with HIV in ART and virological failure to the first-line regimen, establishing a therapeutic regimen after having identified the M184V mutation, which confers ART resistance, represents a dilemma. Objective: To compare the virological response of the therapeutic regimens prescribed to patients with HIV who presented the M184V mutation in two national hospitals in Lima, Peru during the years 2008 to 2019, and to determine the risk factors associated with poor virological response. Methods: A retrospective cohort study was developed based on the information of the HIV program participants with the M184V mutation. Results: A total of 175 participants were eligible for the study. The male sex predominated (75.4%), the current median age was 41 years (IQR 35.84, 47.47) and the time on ART was 89 months (IQR 57.7, 124.53). The median initial viral load was 4.5 log10 copies/ml (IQR 3.97, 5.09) and the time between genotyping and the change of therapy was 2 months (IQR 0; 3.57). The most used antiretroviral regimen was PI + 2 NRTIs (55.4%). With the PI + INI ART, 69% less risk of poor virological response was obtained [p=0.019 (CI 95% 0.117 ; 0.825)]. Conclusions: In patients with HIV and the M184V mutation, the PI + INI ART has shown a greater decrease in control viral load and, thus, a good virological response. The risk factors associated with a poor virological response were the delay between genotyping and change of therapy, high levels of initial viral load, and poor adherence among the participants. / Tesis

Tesis por compendio / [ES] La domesticación de los cítricos es un proceso en gran parte desconocido. Las investigaciones llevadas a cabo hasta la fecha indican que las variedades de cítricos que se comercializan en la actualidad son, en general, el producto de introgresiones ancestrales intraespecíficas e interespecíficas. Las introgresiones de tipo intraespecífico tuvieron lugar entre las poblaciones de dos subespecies antiguas de mandarinas y aportaron el comportamiento apomíctico que la mayoría de las mandarinas actuales y otros cítricos relacionados conservan todavía hoy. Una vez dichas mezclas genéticas o admixtures quedaron establecidas, otras introgresiones interespecíficas de pummelo establecieron nuevas características en el genoma de mandarina. Durante el proceso de domesticación, la variabilidad genética de estos cítricos se adquirió fundamentalmente a través de mutación espontánea, y mediante la práctica del injerto los genotipos carentes de semillas se extendieron rápidamente, acentuándose el papel de las mutaciones en la selección de cítricos como las naranjas y las mandarinas modernas. En este trabajo, mostramos que las mutaciones somáticas en cítricos se propagan siguiendo un patrón iterativo determinado por un modelo de ramificación simpodial y, en consecuencia, se agrupan en sectores a lo largo del árbol, donde algunas mutaciones quedan permanentemente fijadas. En este escenario, un árbol puede considerarse un mosaico genéticamente compuesto de diferentes genomas, en el que las ramas más jóvenes acumulan un número mayor de mutaciones. En promedio, nuestro árbol experimental de Clementina de 36 años muestra una tasa de mutación de 4.4 × 10-10 bp-1 yr-1, pudiendo contener en total entre 1500 y 5000 variantes y producir 1 mutación somática en cada meristemo axilar. Este número relativamente alto de mutaciones está en línea con el gran número de variedades derivadas de mutaciones espontáneas que se comercializan en cítricos. Para identificar caracteres esenciales adquiridos durante la domesticación, se han analizado los transcriptomas de la pulpa de frutos en desarrollo de la variedad silvestre e incomestible papeda de Ichang, la mandarina ácida Sun Chu Sha Kat y tres segregantes comestibles derivados de un cruce entre mandarinas comerciales. Basándonos en los resultados obtenidos, se propone que durante la transición de las papedas incomestibles a las mandarinas ácidas, la domesticación se caracterizó por una primera fase de cambios radicales en la expresión de los genes que regulan rutas fundamentales tanto del metabolismo primario como del secundario. Esta fase estuvo determinada principalmente por la estimulación de los procesos de crecimiento y la reducción de las defensas químicas, constituidas por compuestos de sabores desagradables. También se sugiere que en una segunda fase los atributos asociados a la palatabilidad de las mandarinas, especialmente la acidez, se mejoraron progresivamente a través de modificaciones específicas. Otros cambios de relevancia se relacionaron con la regulación de genes involucrados tanto en la síntesis de sustancias básicas de agradable aroma y sabor, como en la modulación de transportadores de azúcares. Por lo tanto, la transición entre las papedas incomestibles y las mandarinas de tipo ácido se caracterizó esencialmente por una drástica reprogramación de la expresión génica de rutas metabólicas fundamentales, mientras que las mandarinas modernas evolucionaron posteriormente mediante un refinamiento progresivo de las propiedades relacionadas con la palatabilidad. En su conjunto, estas observaciones sugieren que en cítricos, las tasas de mutación de los tejidos somáticos son consistentes con la idea de que las mutaciones desempeñaron un papel importante en las últimas fases de la domesticación. / [CAT] La domesticació dels cítrics és un procés en gran part desconegut. Les investigacions poratades a terme fins al moment indiquen que les varietats de cítrics comercialitzades hui en dia són, en general, el producte de introgressions ancestrals intraespecífiques i interespecífiques. Les introgressions de tipus intraespecífic van tindre lloc entre les poblacions de dues subespècies antigues de mandarina tot aportant el comportament apomíctic que la majoria de les mandarines actuals i altres cítrics relacionats encara conserven. Una vegada que aquestes barreges genètiques o admixtures es consolidaren, diferents introgressions interespecífiques de pummelo establiren noves característiques en el genoma de mandarina. Durant el procés de domesticació, la variabilitat genètica dels cítrics va ser assolida mitjançant mutació espontània i, per mitjà de la pràctica de l'empelt, genotips sense llavors es van estendre ràpidamente, accentuant el paper de les mutacions en la selecció de cítrics com les taronges i les mandarines modernes. En aquest treball, mostrem com les mutacions somàtiques en cítrics es propaguen seguint un patró iteratiu determinat per un model de ramificació simpodial i, en conseqüència, queden agrupades al llarg de l'arbre, on algunes d'aquestes mutacions romanen fixades. En aquest escenari, un arbre pot ser considerat un mosaic genèticament format per diferents genomes, en el qual les branques més joves acumulen un nombre major de mutacions. De mitjana, el nostre arbre experimental de Clementina mostra una ràtio de mutació de 4.4 × 10&#8722;10 bp&#8722;1 yr&#8722;1, arribant a incloure en total entre 1500 i 5000 variants i produint-hi 1 mutació somática en cada meristem axil·lar. Aquest nombre relativament elevat de mutacions està en línia amb el gran nombre de varietats provinents de mutacions espontànies que es comercialitzen en cítrics. Per tal d'abordar la identificació de trets essencials adquirits durant la domesticació, s'ha analitzat el transcriptoma de fruits en desenvolupament de la varietat silvestre i incomestible papeda d'Ichang, la mandarina àcida Sun Chu Sha Kat i tres segregants comestibles derivats d'un creuament entre mandarines comercials. Basant-nos en els resultats obtinguts, s'ha proposat que durant la transició de les papedes incomestibles a les mandariens àcides, la domesticació es va caracteritzar per una primera fase de canvis radicals en l'expressió dels gens que regulen rutes fonamentals del metabolisme primari i secundari. Aquesta fase va estar determinada principalment per l'estimulació dels processos de creixement i la reducció de les defenses químiques de gust desplaent. També es suggereix que en una segona fase atributs associats a la palatabilitat de les mandarines, especialment l'acidesa, van ser millorats progressivament mitjançant modificacions específiques. Altres canvis de rellevància van estar relacionats amb l'estimulació de gens involucrats tant en la síntesi de substàncies bàsiques d'agradable aroma i sabor, com en la modulació de transportadors de sucres. Per tant, la transició entre les papedes incomestibles i les mandarines àcides va estar caracteritzada essencialment per una dràstica reprogramació de l'expressió gènica de rutes metabòliques fonamentals mentre que les mandarines modernes evolucionaren posteriorment mitjançant un refinament progressiu de propietats relacionades amb la palatabilitat. En conjunt, aquestes observacions suggereixen que, en els cítrics, les ràtios de mutació dels teixits somàtics són consistents amb la idea que les mutacions tingueren un paper important en les últimes fases de la domesticació. / [EN] Citrus domestication is a largely unknown process. Research carried out to date indicates that current commercial citrus varieties are, in general, the product of ancestral intraspecific and interspecific introgressions. Intraspecific introgressions took place between the populations of two antique subspecies of mandarins and contributed to the apomictic behavior that most current mandarins and other related citrus still retain today. Once these genetic admixtures were established, interspecific pummelo introgression brought new traits to the admixtured mandarin genome. During domestication, genetic variability of these citrus occurred mainly through spontaneous mutations and with the practice of grafting, seedless genotypes expanded rapidly, emphasizing the role of mutations in the selection of citrus such as oranges and modern mandarins. In this work, we provide evidence that somatic mutations in citrus propagate following an iterative pattern determined by the sympodial branching model and consequently are grouped in sectors along the tree, where some of them remain fixed. In this scenario, a tree can be considered a mosaic genetically composed of different genomes, in which younger branches accumulate greater number of mutations. On average, our 36-yr-old experimental Clementine tree shows a mutation rate of 4.4 × 10-10 bp-1 yr-1, may carry a total of 1,500 to 5,000 variants and produces 1 somatic mutation per axillary meristem. This relatively high number of mutations is in line with the large number of varieties derived from spontaneous mutations that are commercialized in citrus. To identify key traits elicited by citrus domestication, we analyzed transcriptomes from developing fruit pulp of wild inedible Ichang papeda, Sun Chu Sha Kat sour mandarin and three palatable segregants derived from a cross between commercial mandarins. Based on these results, we propose that during the transition from inedible papedas to sour mandarins, domestication involved a first phase of major changes in the expression of genes regulating central pathways of primary and secondary metabolism. This stage was mainly characterized by both the stimulation of growth processes and the reduction of distasteful chemicals defenses. It is also suggested that in a second phase, edible attributes of mandarins, especially acidity, were progressively improved through specific modifications. Other relevant changes included upregulation of genes involved in the synthesis of key substances of pleasant aroma and flavor, and the modulation of sugar transporters. Thus, the transition from inedible papeda to sour mandarin was essentially defined by a drastic reprogramming of gene expression of fundamental metabolic pathways, while modern mandarins evolved later through progressive refinement of palatability properties. Taken together, these observations suggest that the rates of mutations occurring in citrus somatic tissues are consistent with the idea that they have played an important role during the later steps of citrus domestication. / This research is co-funded by the Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (Spain) through grant RTI2018-097790-R-100 and by the European Union through the European Regional Development Fund (ERDF) of the Generalitat Valenciana 2014- 2020, through grants IVIA 51915 and 52002 / Pérez Román, E. (2022). Mutation Rate and Gene Expression in Genetic Admixtures of Domesticated Citrus [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191452 / Compendio