Mes travaux de recherche sont centrés sur la compréhension des relations structure-fonctions de la région 5' non traduite de l'ARN génomique du VIH-1. Le travail réalisé au cours de ma Thèse de Doctorat dans le groupe de B. et C. Ehresmann (UPR 9002 du CNRS) à l'ULP, a porté sur l'étude de la dimérisation de l'ARN génomique du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) 1. Une propriété ubiquitaire des rétrovirus est l'encapsidation de deux molécules d'ARN génomique associées près de leur extrémité 5'. Cette caractéristique, qui traduit l'existence d'une forte pression de sélection, représente un avantage évident pour la recombinaison pendant la rétrotranscription. Elle permet en particulier au virus de se répliquer malgré la présence de lésions dans l'ARN génomique et favorise la variabilité génétique. Nos travaux nous ont permis d'aboutir à plusieurs résultats importants : (1) la dimérisation implique une séquence localisée en amont du site donneur d'épissage 2. Elle est initiée par un mécanisme de reconnaissance de type boucle-boucle entre les deux monomères, au niveau d'une structure en épingle à cheveux très conservée dans les différents isolats du VIH-1, que nous avons appelée DIS (Dimerization Initiation Site) 3; 4. Cette tige-boucle est également appelée SL1. La boucle du DIS possède 9 nucléotides, dont 6 forment une séquence auto-complémentaire. Nous avons montré que l'étape initiale de la dimérisation est réalisée par des appariements Watson-Crick entre les séquences autocomplémetaires de chacun des deux monomères 5; 6; 7. Cependant, ces appariements ne sont pas les seules interactions stabilisant le dimère. Un modèle tridimensionnel du complexe boucle-boucle du DIS obtenu sur la base de résultats de cartographie en solution montre l'existence d'interactions non-canoniques formées par les purines flanquant la séquence autocomplémentaire 8; 9. (2) Le DIS joue un rôle essentiel dans la réplication du virus au niveau de l'encapsidation de l'ARN génomique et de la synthèse de l'ADN proviral double brin 10. (3) Il est possible d'inhiber la dimérisation in vitro par des oligonucléotides sens et antisens 11; 12.<br />En 1997-1998, j'ai effectué un stage post-doctoral dans le laboratoire du Dr. Heinrich Gottlinger (DFCI, Harvard Medical School, Boston, MA, USA). Mon travail était de comprendre le mécanisme de régulation qui permettrait aux précurseurs protéiques viraux de se fixer à la membrane plasmique, lieu d'assemblage des virions. J'ai ainsi confirmé l'existence d'un switch conformationnel de l'acide myristique localisé en N-terminal de la protéine de Matrice du VIH 13.<br />Depuis mon retour à Strasbourg en 1999 dans l'équipe du Dr. Roland Marquet, je me suis intéressé de nouveau au monde de l'ARN et plus précisément au repliement de l'ARN génomique du VIH-1. Ainsi, après avoir mis en évidence un motif de structure tertiaire dans la région 5'-terminale de cet ARN 14, nous avons, en collaboration avec Markus Dettenhofer (Baltimore, MD, USA), caractérisé pour la première fois la structure secondaire de cet ARN dans les cellules infectées et les particules virales 15; 16. Cette avancée technologique nous a permis par la suite (1) d'analyser avec Valérie Goldschmidt (doctorante) les variabilités structurales existantes au sein du complexe d'initiation de la rétrotranscription 17 et (2) de montrer, en collaboration avec l'équipe de Philippe Dumas (UPR 9002), que des antibiotiques de la famille des aminoglycosides se fixent spécifiquement dans la boucle du DIS de l'ARN génomique du VIH-1 non seulement dans un système in vitro 18 mais également en culture cellulaire 19.<br />Récemment, nous avons initié un nouveau projet sur le rôle de la protéine virale Vif dans la réplication virale du VIH-1 et sa relation avec l'ARN génomique (travail de thèse de Simon Henriet). Outre ses activités sur la synthèse de l'ADN proviral, la stabilité du core viral ou encore l'intégration du provirus, nous avons montré que la protéine Vif se fixe de façon spécifique et de manière coopérative aux régions localisées dans la région 5'-terminale du génome rétroviral 20. En particulier, la tige-boucle TAR (région 1-57) est un point de nucléation nécessaire à la propagation de la fixation de Vif à l'ARN (de 5‘ vers 3') mais semble insuffisante pour stabiliser ces interactions.<br /> De nombreuses perspectives découlent directement de ces travaux. Nous souhaiterions étudier la dimérisation de l'ARN génomique du VIH-1 directement dans la cellule et ainsi répondre à plusieurs questions fondamentales : où se forme le dimère d'ARN génomique ? Le DIS, ou la dimérisation, sont-ils nécessaires au transport et à l'encapsidation de l'ARN génomique ? La maturation du dimère d'ARN dans les particules virales est-elle liée à un remaniement conformationnel au niveau du DIS ? Des résultats préliminaires obtenus en collaboration avec par l'équipe de M. Mougel (UMR 5121, Montpellier) indiquent que le DIS pourrait effectivement être un signal positif pour le transport nucléo-cytoplasmique. Ces résultats nous encouragent ainsi à poursuivre le développement de nouveaux agents antiviraux dérivés des aminoglycosides dirigés contre le DIS (collaboration avec P. Dumas, UPR 9002 et P. Pale, UMR 7123-ULP). <br />Dans les perspectives liées à la compréhension du rôle de Vif dans la réplication virale, nous étudierons en particulier son action sur l'initiation de la rétrotranscription et sur la régulation de l'expression des protéines APOBEC-3G/3F. Les protéines APOBEC sont des cytidines désaminases qui ont été identifiées dernièrement et dont l'action hypermutatrice lors de la synthèse du brin (-) de l'ADN proviral est létale pour le virus. Ces protéines, exprimées exclusivement dans les cellules non permissives, sont exclues des particules virales en présence de Vif et dirigées vers la voie du protéasome. Nous étudierons entre autre la régulation de la traduction des protéines APOBEC par Vif (identification des régions de l'ARNm nécessaires) et analyserons les changements conformationnels éventuels au niveau de la région 5' non traduite de l'ARNm induits par la fixation de Vif. <br /> L'ensemble de ces travaux devrait nous permettre de contribuer à la compréhension des mécanismes qui régulent la structure tridimensionnelle de la région 5' non traduite de l'ARN génomique du VIH-1, et à plus long terme d'identifier des molécules capables d'interagir avec les différents domaines structuraux de cette région.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le VIH-1 est un rétrovirus contenant deux copies de son génome ARN simple brin positif. Dans la cellule, son ARN est rétrotranscrit en ADN puis cet ADN est intégré dans le génome cellulaire. L'ADN viral est ensuite transcrit en ARN dont la moitié évite l'épissage. Dans le cytoplasme, cet ARN possède une double fonctionnalité : il sert d'ARNm pour la synthèse des protéines Gag et Gag-Pol et d'ARN génomique (ARNg) qui est encapsidé sous forme de dimère. Malgré sa faible abondance dans la cellule, l'ARNg est préférentiellement encapsidé. Cependant, il a été montré par nous et d'autres que d'autres ARN non-génomiques peuvent également être spécifiquement encapsidés, tels que des ARN viraux épissés et certains ARN cellulaires, bousculant ainsi le dogme d'une spécificité unique pour l'ARNg. Nous avons montré que le VIH-1 contrôlerait l'incorporation des ARN viraux, épissés et non épissés, par un mécanisme de compétition, impliquant des facteurs communs. En revanche, les ARN cellulaires 7SL et U6 semblent encapsidés par des mécanismes indépendants. Afin d'identifier les déterminants qui régissent la spécificité d'encapsidation, nous avons testé le rôle de la nucléocapside (NC) qui est fortement impliquée dans l'encapsidation. Nous montrons ici que de façon tou t à fait inattendue, des mutations de NC conduisent à l'encapsidation d'ADN et augmentent également l'encapsidation d'ARN viraux épissés. Nous avons ensuite cartographié les déterminants de la région 5' UTR de l'ARNg et déterminé que la tige-boucle polyA et la région PBS sont impliquées dans l'encapsidation des ARN viraux épissés. Ce travail apporte une meilleure compréhension de la spécificité d'encapsidation, primordiale pour la mise au point de thérapies géniques utilisant des vecteurs lentiviraux. / HIV-1 is a retrovirus containing two copies of its single stranded positive RNA genome. In the cell, its RNA is reverse transcribed into DNA and this DNA is integrated into the cellular genome. The viral DNA is then transcribed into RNA. One moiety of this RNA pool escapes splicing. Once in the cytoplasm, this RNA has a double function: it serves as mRNA for synthesis of Gag and Gag-Pol proteins and as genomic RNA (gRNA) that is packaged as a dimer. Despite its low abundance in the cell, the gRNA is preferentially encapsidated into virions. However, it has been shown by us and others that other non-genomic RNA can be specifically packaged, such as spliced viral RNA and some cellular RNA, thus shaking up the dogma of a unique specificity for the gRNA. We have shown that HIV-1 might control the incorporation of the spliced and unspliced RNA by a mechanism of competition, involving common factors. In contrast, cellular RNA 7SL and U6 seem encapsid ated through independent mechanisms. To identify the determinants that govern the specificity of encapsidation, we tested the role of the nucleocapsid (NC) which is strongly involved in the packaging. Here we show that unexpectedly, mutations of NC lead to the encapsidation of DNA and also increase the encapsidation of spliced viral RNA. We then mapped the determinants in the 5' UTR of the gRNA and determined that the polyA stem-loop and the PBS region are involved in the encapsidation of the spliced viral RNA. This work provides a better understanding of the specificity of encapsidation that is crucial for the development of gene therapy using lentiviral vectors.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La prolifération, la différenciation ainsi que les fonctions des cellules du système immunitaire sont contrôlées en partie par les cytokines. Lors de l’infection par le VIH-1, les défauts observés dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du système immunitaire sont en large partie attribués à une production altérée des cytokines et à un manque d’efficacité au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces études, nous nous sommes intéréssés à la régulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont l’IL-18 et l’IL-21. Nous avons observé une corrélation inversée significative entre les concentrations sériques d’IL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infectés par le VIH-1. Nos expériences in vitro ont démontré que cette cytokine induit l’apoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut être inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour FasL et TNF-α. Cette mort cellulaire est due à l’expression de FasL sur les cellules NK et à la production de TNF-α par ces cellules. L’IL-18 augmente aussi la susceptibilité à la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous démontrons aussi que, contrairement à l’IL-18, les niveaux d’IL-18BP sont plus faibles dans les sérum de patients infectés. Ceci résulte sur une production non coordonnée de ces deux facteurs, aboutissant à des niveaux élevés d’IL-18 libre et biologiquement active chez les patients infectés. L’infection de macrophages in vitro induit la production d’IL-18 et réduit celle d’IL-18BP. De plus, l’IL-10 et le TGF-β, dont les concentrations sont élevées chez les patients infectés, réduisent la production d’IL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous démontrons que l’IL-18 augmente la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Les niveaux élevés d’IL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infectés contribuent donc à l’immuno-pathogénèse induite par le VIH-1 en perturbant l’homéostasie des cellules NK ainsi qu’en augmentant la réplication du virus chez les patients. Ces études suggèrent donc la neutralisation des effets néfastes de l’IL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de l’IL-18BP exogène. Ceci permettrait de moduler l’activité de l’IL-18 in vivo à des niveaux souhaitables. L’IL-21 joue un rôle clef dans le contrôle des infections virales chroniques. Lors de ces études, nous avons déterminé la dynamique de la production d’IL-21 lors de l’infection par le VIH-1 et sa conséquence sur la survie des cellules T CD4+ et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1. Nous avons démontré que sa production est compromise tôt au cours de l’infection et que les concentrations d’IL-21 corrèlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectées. Nos études ont démontré que le traitement antirétroviral restaure partiellement la production d’IL-21. De plus, l’infection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en réduisant l’expression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi démontré que la fréquence des cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 qui produisent de l’IL-21 est réduite chez les patients virémiques. Selon nos résultats, l’IL-21 empêche l’apoptose spontanée des cellules T CD4+ de patients infectés et l’absence d’IL-21 réduit la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos résultats démontrent que l'IL-21R est exprimé de façon égale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infectés. L’IL-21 active les protéines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rôle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilité des cellules NK, mais ne possède aucun effet sur leur prolifération. Nous démontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions sécrétrices et cytotoxiques ainsi que la viabilité des cellules NK provenant de patients chroniquement infectés par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble présenter ces effets sans augmenter en contrepartie la réplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la réplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectées d'une manière dépendante à l'expression de perforine et à l'utilisation de la protéine LFA-1. Les niveaux d’IL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur l’état de fonctionnalité de ce compartiment cellulaire. De plus, ces résultats suggèrent l’utilisation de cette cytokine en tant qu’agent immunothérapeutique pour restaurer les niveaux normaux d’IL-21 et augmenter la réponse antivirale chez les patients infectés par le VIH-1. / The proliferation, differentiation, function and maintenance of immune cells is controlled in large part by cytokines. HIV-induced dysfunctions of the antiviral immunity is in part related to defects in the cytokine network, as manifested by altered cytokine secretion and responsiveness to these cytokines. In these studies, we investigated the regulation and the functions of two cytokines, IL-18 and IL-21, during HIV-1 infection. In our studies, we observed an inverse correlation between IL-18 concentrations and absolute numbers of various subsets of NK cells in infected persons. IL-18 caused increased death of a human NK cell line, as well as of primary human NK cells in vitro. The IL-18-mediated cell death was dependent upon Fas-FasL interactions and TNF- secretion. IL-18 induced the expression of TNF-, induced the expression of FasL on NK cells, increased the transcription from the human FasL promoter, reduced the expression of Bcl-XL in NK cells, and increased their sensitivity to FasL-mediated cell death. In contrast to IL-18 levels, IL-18BP levels decreased in the serum of HIV-infected patients. This decrease resulted in enhanced levels of free IL-18 in the serum of such patients. The infection increased production of IL-18 but decreased that of IL-18BP in monocyte-derived macrophages (MDM). Furthermore, IL-10 and TGF-β, two cytokines for which concentrations are increased in HIV-infected persons, also decreased production of IL-18BP by human MDM. Finally, recombinant human IL-18 enhanced HIV-1 replication in human CD4+ T cells. The uncoordinated production of these two cytokines represents an imbalance between these two soluble factors in HIV-infected patients. Our study shows that enhanced IL-18 bioactivity in HIV-infected patients may contribute to the pathogenesis of AIDS by disrupting NK cell homoeostasis and increasing viral replication. This uncoordinated production of IL-18 and IL-18BP contribute to IL-18-induced immunopathology and pathogenesis in HIV-infected AIDS patients. Therefore, these studies suggest that the neutralization of IL-18 may represent an appropriate and useful immunotherapeutic strategy in these patients. It may delay AIDS progression and improve the immune status of infected persons. The best way to achieve this goal may be using exogenous interleukin-18 binding protein. IL-21 is a relatively newly discovered immune enhancing cytokine, which plays an essential role in controlling chronic viral infections. Therefore, we sought to determine the dynamics of the cytokine production and its potential consequences on the viability of CD4+ T cells in HIV-infected persons. We show here that the cytokine production is compromised early in the course of the infection. The serum cytokine concentrations correlated with CD4+ T cell counts in the infected persons. Among different groups of HIV-infected persons, only Elite Controllers maintain normal production of the cytokine. The HAART partially restores production of this cytokine. Interestingly, HIV-1 infection of human PBMC as well as of purified CD4+ T cells inhibits the production of the cytokine by decreasing the expression of c-Maf, a transcription factor involved in the activation of the cytokine gene, in the virus-infected cells but not in uninfected bystander cells. We also show that the frequencies of IL-21 producing HIV-specific antigen experienced CD4+ T cells are decreased in HIV-infected viremic patients. Furthermore, we show that recombinant human IL-21 acts as pro-survival factor and prevents enhanced spontaneous apoptosis of ex vivo cultured CD4+ T cells from HIV-infected patients and that increased serum levels of the cytokine are associated with higher frequencies as well as with better functions of HIV-specific CTL in HIV-infected individuals. We show that the cytokine receptors are expressed equally on all NK cell subsets. We demonstrate that the cytokine activates STAT-3, MAPK and Akt to enhance NK cell functions. IL-21 increases expression of anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Bcl-XL, and enhances viability of NK cells, but has no effect on their proliferation. We further show that the cytokine enhances HIV-specific ADCC, secretory and cytotoxic functions as well as viability of NK cells from HIV-infected persons. Furthermore, it exerts its biological effects on NK cells with minimal enhancement of HIV-1 replication, and the cytokine-activated NK cells inhibit viral replication in co-cultured HIV-infected autologous CD4+ T cells in a perforin- and LFA-1-dependent manner. These studies suggest that serum IL-21 concentrations may serve as useful biomarker to accompany CD4+ T cell counts for monitoring HIV-1 disease progression and the fitness of the antiviral immunity. Furthermore, the cytokine may be considered for immunotherapy in HIV-infected patients in order to restore the physiological levels of the cytokine and promote their antiviral immunity.

La protéine Nef du VIH-1 joue un rôle important dans la pathogenèse du VIH-1 en modulant les voies de signalisation de la cellule hôte. La signalisation par le TcR est essentielle à la sélection positive pour générer les cellules simples positives (SP) CD4+ et simples positives (SP) CD8+, processus largement dépendant de l’activité de la Src kinase Lck et de son habileté à lier la queue cytoplasmique des corécepteurs CD4 et CD8. Nous avons précédemment trouvé que l’expression de Nef dans le VIH ou VIS peut induire une sévère déplétion des thymocytes et une baisse d’expression du corécepteur CD4 à la membrane. Nous avons également montré que Nef bloque la génération des thymocytes doubles positifs (DP) CD4+ CD8+ en plus d’altérer la transition des cellules DP vers CD4+ SP. Par contre, ce phénotype est récupérable par plusieurs approches dont le croisement d’une souris transgéniques exprimant Nef avec une souris exprimant la forme constitutivement active de Lck Y505F. Les résultats indiquent que la maturation des cellules CD4+ est altérée par le dysfonctionnement de la signalisation CD4-Lck. Toutefois, les mécanismes moléculaires par lesquels Nef contribue au bloc de la génération des cellules CD4+ dans le thymus demeurent très imprécis. Dans cette étude, en utilisant des approches biochimiques et de microscopie confocale, nous avons trouvé que les thymocytes transgéniques Nef+ expriment plus de Lck que les thymocytes Nef-. Malgré cette augmentation, une partie significative de Lck est incapable d’atteindre la membrane plasmique. Cette fraction était significativement accumulée dans un compartiment intracellulaire des thymocytes transgéniques exprimant Nef. Également, en utilisant la technique d’essai kinase in vitro, nous avons trouvé que l’activité kinase de Lck est significativement augmentée dans les thymocytes transgéniques mais demeure stable suite à une stimulation par un α-CD3ε + α-CD4. Également, comparativement aux thymocytes Nef-, la kinase Lck dans les thymocytes transgéniques était résistante à la dégradation suite à une stimulation. En examinant le statut de c-Cbl, le principal régulateur négatif de Lck, nous avons montré que c-Cbl colocalise faiblement avec Lck, malgré son hyperphosphorylation constitutive. Ceci pourrait expliquer l’échec de la dégradation de Lck. En plus, nous avons trouvé que suite à une stimulation par un α-CD3ε + α-CD4, la phosphorylation de Zap-70 en tyrosine 493 par Lck est diminuée, résultant d’une importante baisse de l’activité kinase de Zap-70 et d’un bloc des premiers évènements de la voie de signalisation par le TcR. Ces données indiquent que la signalisation CD4-Lck est interrompue par la présence de Nef. / HIV-1 Nef protein plays an essential role in the HIV-1 pathogenesis by modulating the host signaling transduction pathways. TcR signalling is important for the thymic selection process to CD4 and CD8 single positive T cells and is greatly dependent on the activity of Src kinase Lck and its ability to bind to CD4 and CD8 cytoplasmic tail. We previously found that expression of HIV or SIV Nef can induce severe thymocytes depletion and downregulation of CD4 expression in Nef+ mice. We also recently showed that Nef blocks generation of double positive thymocytes and impairs DP to CD4+ SP T cells transition. The reversal of this phenotype was accomplished by several approaches, among them by crossing Nef+ mice with mice expressing constitutively active Lck Y505F. These results imply that the maturation of CD4+ T cells is disrupted due to impairment of Lck-mediated CD4 receptor signaling. However, the molecular mechanisms by which Nef contributes to the impairment in thymic CD4 generation remains largely unclear. In this study, using confocal microscopy and biochemical approaches, we found that Nef+ thymocytes express more Lck than the Nef- control. Despite of this increase, a significant portion of Lck molecules were unable to reach to the plasma membrane. It was significantly accumulated in the intracellular endosomal compartment of the Nef+ thymocytes. Moreover, using IVKA we found that the activity of Lck is significantly increased in Nef+ thymocytes but was not further increased upon stimulation by α-CD3ε, α-CD4 or α-CD3ε + α-CD4. Moreover, compared to Nef- controls, Lck kinase in Nef+ thymocytes was resistant to degradation upon stimulation. Examining the status of c-Cbl, the main negative regulator of Lck, showed that c-Cbl localized with Lck poorly, despite his constitutive hyperphosphorylation. This explains the failure of Lck degradation. In addition, we found that upon stimulation, Zap-70 phosphorylation at tyrosine 493 by Lck is decreased, resulting by a decrease of Zap-70 kinase activity and TcR proximal event block. These data indicate that CD4-Lck signaling was interrupted by the presence of Nef.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.