Orientador: Pedro Luiz Onofrio Volpe / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:32:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_DeniseAparecidade_D.pdf: 5185045 bytes, checksum: 36438135c1b0ed1dce86ba104d180928 (MD5) Previous issue date: 2003 / Doutorado

Orientador: Nora Marcela Haun Quiros / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T15:49:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antonio_ReginaVasconcellos_D.pdf: 4164743 bytes, checksum: 1165bdb91953c41821709ee656da6cb9 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: Neste trabalho foram estudadas algumas condições de cultivo da Chromobacterium violaceum (cepa BB-78) com o objetivo de aumentar a produção da violaceína, um pigmento produzido pela bactéria, que apresenta atividades tripanocida e antibiótica. Verificou-se que glicose e frutose são fontes de carbono que inibem a produção de violaceína embora favoreçam a produção de massa celular. Baixas concentrações de glicose e a utilização de fontes de carbono de difícil metabolismo, tais como amido, lactose, manitol e sacarose, favoreceram a produção de violaceína, porém o crescimento celular foi bastante reduzido sob tais condições. Observou-se que a produção de violaceína chega a ser até 36 vezes maior na presença de meios sólidos, quando comparada aos meios líquidos correspondentes, sendo marcadamente maior na presença de grãos de arroz cozido. Metabólitos indólicos, tais como: triptofano, ácido 3-indol acético e 5-hidroxitriptamina, produzidos pela bactéria, aumentaram a eficiência da produção de violaceína., expressa como a razão entre a concentração de violaceína e o peso seco da massa celular, em até 40%, como foi o caso do triptofano. A isatina, também produzida pela bactéria, não teve efeito estimulatório sobre a eficiência da biossíntese de violaceína embora tenha apresentado um efeito indutor sobre esta via na ausência de outros compostos indólicos no meio de cultura, aumentando a eficiência de produção de violaceína 20 vezes em relação ao controle. Ensaios de incorporação do ácido 3-indol acético (IAA) à molécula de violaceína., mostraram que este é integralmente incorporada ao pigmento. Foram sintetizadas duas carboxiamidas, CBX-l e CBX-2, sendo a primeira a partir da condensação do IAA à 5-hidroxitriptamina e a segunda a partir da condensação do IAA à triptamina. Enquanto a primeira foi capaz de aumentar a eficiência da biossíntese de violaceína em 42%, indicando que esta seja um importante intermediário desta via, a CBX-2 não teve efeito algum sobre a biossíntese de violaceína. Devido às semelhança estruturais das carboxiamidas com a violaceína., ambas foram testadas quanto à atividade tripanocida. A CBX-2, além de se apresentar bastante efetiva contra formas amastigotas e tripomastigotas de Trypanosoma cruzi (cepa Y), foi também menos tóxica sobre células V79 de hamster chinês que nifurtimox e metilol violaceína., se constituindo num composto promissor a ser melhor testado como quimioterápico. Por outro lado, a CBX-1 foi pouco efetiva contra T. cruzi / Abstract: Violacein is a pigment produced by Chromobacterium violaceum that has shown trypanocide and antibiotic activity. To improve the violacein biosynthesis, the bacteria growth conditions were studied. Glucose and fructose were shown to inhibit the pigment production although they have stimulated the cellular mass production. Low concentrations of these sugars and other carbon sources slowly metabolized by this bacterium have shown to increase violacein production although cellular mass was reduced in such conditions. Violacein production increased until thirty six fold when C. violaceum was grown in solid medium, being much higher in cooked rice grains. Violacein production efficiency (expressed as the ratio of violacein production and cellular mass, dry weight) was increased by indolic compounds such as tryptophan, indole acetic acid and 5-hydroxytriptamine until forty percent, as did tryptophan. Isatin had no stimuli on violacein biosynthesis, but it increased twenty fold its efficiency when no other indole sources were present in the medium. From experiments with labelled 2_14C and 1_14C-indole acetic acid (14C-IAA), it was concluded that these compounds were incorporated into violacein molecule. Two carboxamides were synthesized, N-ethyl-(5hydroxy-indol-3-yl)-2-indolylethyl amide (CBX1) and N-ethyl-(indol-3-yl)-2-indoliethylamide (CBX-2). CBX-1 increased the violacein efficiency production in forty two percent, this is indicative that this is an important intermediate in violacein biosynthesis. CBX-2 had no effect on violacein efficiency production. Due the structural's similarities between the CBX-1, CBX-2 and violacein, the carboxiamides were assayed to trypanocide activities. Only CBX-2 has shown significant activity on amastigotes and trypomastigote forms of Trypanosoma cruzi (Y strain). It exhibited lower toxicity than nifurtimox and metilol violacein, on V79 chinese hamster cells being a promissory compound to Chagas desease chemotherapy / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Ciências Biológicas

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. / Made available in DSpace on 2013-07-15T22:45:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 223237.pdf: 2071979 bytes, checksum: dba22a02825ff94d9450282e6acca62a (MD5) / Microrganismos, cujo genoma já foram completamente seqüenciados, como é o caso da Chromobacterium violaceum, possuem dados de anotação genômica em geral produzidos por uma equipe que analisa a fisiologia do organismo e os correlaciona com os dados produzidos pelo projeto de seqüenciamento. Esses dados são geralmente armazenados em bases de dados públicas, e precisam muitas vezes ser verificados, ou seja, validados por via experimental. Todavia, os recentes avanços na área de bioinformática e biologia computacional permitem que certas condições fisiológicas sejam verificadas computacionalmente como, por exemplo, a existência ou não de uma dada via metabólica. Vários grupos têm desenvolvido técnicas para predição de vias metabólicas de organismos a partir da anotação do genoma, produzindo bases de dados integradas via/genoma (pathway/genome database). Este trabalho teve como objetivo construir uma base de dados para a C. violaceum (CvioCyc), uma bactéria Gram-negativa, seqüenciada pelo Brazilian National Genome Project Consortium, de grande potencial biotecnológico e biomédico. A C. violaceum produz um pigmento violeta conhecido como violaceína, ao qual são atribuídas propriedades anti-tumorais, anti-chagazíticas, entre outras; além disso, essa bactéria é capaz de produzir biopolímeros de grande interesse comercial. A base de dados via/genoma - CvioCyc (cviocy.intelab.ufsc.br), criada a partir do conjunto de softwares Pathway Tools, mostrou-se uma importante ferramenta de análise do genoma da C. violaceum. Através da análise de 61 vias metabólicas, de um total de 233 geradas automaticamente pelo software, 17 vias foram removidas (27,86%) e 44 mantidas (72,13%). Além da inclusão da via de biossíntese da violaceína a partir do aminoácido triptofano, essas 61 vias foram diretamente curadas a partir dos resultados do Pathway Tools, da análise de dados da literatura, e pelo uso de várias outras ferramentas de bioinformática disponíveis na web, tais como ferramentas BLAST e bases de dados de enzimas (KEGG, ENZYME e BRENDA). Trinta e nove ORFs (quadros abertos de leitura), relacionadas às vias analisadas, foram alteradas na base CvioCyc. Isto representa aproximadamente 24,3% de erro numa amostra de 160 ORFs analisadas. Este resultado está dentro da faixa de erros comumente encontrada na literatura, que varia de 8% a 25%. Vários erros se encaixam nos erros de anotação mais comumente encontrados na literatura, como ORFs falso-positivas, falso-negativas, erros de digitação, e falta de padronização nos nomes de enzimas e de genes. A análise dos genes envolvidos na biossíntese da violaceína nos permite sugerir que a ORF CV3270 pode fazer parte do operon vio, de acordo a predição do Pathway Tools. É, portanto, provável a existência de mais um gene no operon vioABCD. Entre essa ORF e o gene vioD, há uma distância de apenas 12 pares de bases, e observa-se uma estrutura em grampo, à jusante desta ORF, o que indica o término da transcrição após a ORF CV3270. Microorganisms that have already had their genomes completely sequenced, as in the case of Chromobacterium violaceum, have their genome annotation generally produced by a team that analyze the organism's physiology and its correlation to data produced by the sequencing project. These data are generally stored in public domain databases and most of the time they need to be verified, i.e., experimentally validated. However, recent advances in bioinformatics and computational biology allow us to computationally verify some physiological conditions, such as, for instance, the presence or lack of a particular metabolic pathway. Several research groups have developed techniques to predict metabolic pathways from genomic annotation, thus producing integrated pathway/genome database. The main objective of this work was to build a database for C. violaceum (CvioCyc), a Gram-negative bacterium sequenced by the Brazilian National Genome Project Consortium. C. violaceum is a microorganism of great biotechnological and biomedical potential. C. violaceum produces a violet pigment known as violacein, to which it is attributed anti-tumoral and anti-Trypanosoma cruzi properties, among others; moreover, this bacterium is able to synthesize biopolymer of great commercial interest. The pathway/genome database - CvioCyc (cviocyc.intelab.ufsc.br), was built from a suite of programs in the Pathway Tools package, and was shown to be an important tool to analyze the C. violaceum genome. It allowed us re-annotating 61 out of 233 automatically generated metabolic pathways, 17 were removed (27.86%) and 44 were remained (72.13%). Besides the violacein biosynthesis pathway included in the database, from its precursors (tryptophan), those 61 metabolic pathways were directly curated from the results generated by Pathway Tools, and from literature research, and the use of bioinformatics tools available on the web, such as BLAST and enzyme databases (KEGG, ENZYME and BRENDA). Thirty-nine ORFs (open reading frames) were modified in CvioCyc. That represents approximately 24.3% error in the 160 examined ORFs. This result is in agreement with what we have found for other genome annotations (8 to 25%). Most of those errors are among the frequently found in the literature, such as false-positive and false-negative ORFs, typo errors, and lack of standardization in enzyme and gene names. The analysis done on violacein biosynthesis suggests that ORF CV3270 may be part of the vio operon, according to Pathway Tools predictions. Thus, it is likely that it might exist another gene in the vioABCD operon. We have found that there is only a 12 bp distance between the ORF3270 and the vioD gene; besides that, there is a stem-loop (hairpin) structure downstream that ORF, what suggests a transcription termination moiety after CV3270.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2012-10-23T10:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 245430.pdf: 2343086 bytes, checksum: 9276cd2a14ba823e91f55d55056bcccf (MD5) / A violaceína é um pigmento formado pela união de duas moléculas modificadas do aminoácido L-triptofano. Este pigmento apresenta propriedades interessantes como tripanocida e antitumoral. Dentre os microrganismos produtores de violaceína encontra-se a bactéria Chromobacterium violaceum. Os genes necessários à síntese de violaceína em C. violaceum estão organizados em um operon conhecido como vioABCDE. A clonagem e expressão dos genes vioABCDE de C. violaceum sob controle do promotor araBAD foi realizada em Escherichia coli visando avaliar a estabilidade, rendimento e produtividade da produção heteróloga de violaceína neste microrganismo. Os resultados indicam que um dos fatores responsáveis pela instabilidade da produção de violaceína em E. coli está relacionado às alterações que podem ser causadas aos genes vioABCDE devido à produção desta molécula. Apesar da instabilidade observada, foi possível a obtenção de um rendimento e produtividade de violaceína bruta de 22,06 mg/gMS e 10,71 µmol/gMS·h, respectivamente.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-23T12:49:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 240338.pdf: 5928151 bytes, checksum: 3ec335edd174d0f75509099b78fc544c (MD5) / Visando ao desenvolvimento de um sistema heterólogo para produção de polihidroxialcanoatos (PHA) em Escherichia coli, clonou-se o gene da enzima PHA sintase de Chromobacterium violaceum (phaCCv) no plasmídeo pBHR69, o qual continha previamente os genes para as enzimas ß-cetotiolase (phbA) e acetoacetil-CoA redutase (phbB) do operon de Cupriavidus necator, ambas necessárias, juntamente com a PHA sintase, para a biossíntese de PHA em E. coli. Para verificação da produção de polímero em E. coli foram transformadas com o plasmídeo obtido (pRLC2) as linhagens JM101 e DH5a. Em cultivos não otimizados utilizando glicose como substrato obteve-se 1,15 e 1,52 g l-1 de biomassa com rendimento de 29,6 e 42,6 % de PHA do tipo poli(3-hidroxibutirato) nas linhagens JM101 e DH5a, respectivamente. Estes resultados evidenciaram que a PHA sintase de C. violaceum apresenta atividade aparentemente normal em E. coli, diferentemente do que sugeriram estudos anteriores, permitindo, portanto, a sua utilização para produção heteróloga de PHA nesta bactéria. O modelo estrutural teórico obtido para a enzima PhaCCv apresentou uma tríade catalítica similar à observada em lipases e outras enzimas da família a/ß-hidrolase, sugerindo que o resíduo de aspartato pertencente à tríade possa também estar associado à estabilização da ligação enzima-substrato. Assim como nas lipases, observou-se também no modelo a ocorrência de uma região possivelmente relacionada à ativação interfacial da enzima junto à superfície hidrofóbica do grânulo de PHA. As estruturas terciárias obtidas na modelagem estrutural sugerem a necessidade de reavaliação dos modelos mecanísticos de síntese atualmente propostos, uma vez que os mesmos pressupõem que o resíduo de aspartato não participaria da estabilização da ligação enzima-substrato, possuindo unicamente a função de ativação do radical hidroxila durante a biossíntese do polímero.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia Química. / Made available in DSpace on 2012-10-24T01:50:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 255653.pdf: 1907221 bytes, checksum: 0c93fe1f48bf9620cbb617616e9fee05 (MD5) / Biofilmes são comunidades de microrganismos ligados a uma superfície inerte ou viva. Na complexa constituição do material extracelular de biofilmes, os polissacarídeos possuem um importante papel. Dentro da família de exopolissacarídeos sintetizados pelas bactérias com intuito de se proteger do sistema de defesa hospedeiro, encontra-se um com o monômero N-Acetil-D-Glicosamina ligado por conformação ß-1,6. Grupos de genes que produzem tal polímero encontram-se no genoma de diversas bactérias. A associação deste polissacarídeo com fatores de virulência, aliado à síntese em bactérias causadoras de infecção, torna-o um potencial alvo no desenvolvimento de novos antibióticos. A Chromobacterium violaceum, um patógeno oportunístico, e na maioria das vezes fatal, possui o operon hmsHFR-CV2940 cujas proteínas podem sintetizar tal polissacarídeo. Neste trabalho foram utilizados alinhamentos múltiplos entre proteínas de bactérias que sintetizam polissacarídeos com o intuito de verificar a existência de aminoácidos críticos para a atividade patogênica conferida por biofilmes. Foram gerados modelos tridimensionais para visualização da distribuição espacial destes aminoácidos. A análise efetuada mostra que a proteína HmsR conserva os aminoácidos D135, D228, Q264 e R267, considerados críticos para a formação de biofilmes, e estes se encontram próximos. A proteína HmsF de C. violaceum conserva os resíduos D86, D87, H156 e W115. No modelo estrutural gerado observa-se que estes resíduos também encontram-se favoravelmente localizados. Para a proteína HmsH houve comprovação de conservação para o resíduo R104, e na proteína CV2940 conservou-se o resíduo W94. A conservação de aminoácidos considerados importantes para a formação de biofilmes entre as proteínas deste operon em C. violaceum indica que eles desempenham a mesma função enzimática na síntese de biofilmes. Também como no caso de operons de outros organismos patogênicos, pode-se sugerir que o operon hmsHFR-CV2940 esteja ligado à sua patogenicidade.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 221663.pdf: 3298544 bytes, checksum: d7078a9b7ba3ea540646c7eaea3921b0 (MD5) / A Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, violeta-pigmentada, aeróbica facultativa, que vive em regiões de climas tropicais e subtropicais, encontrada principalmente em solos e rios. Este microrganismo tem capacidade de produzir metabólitos de interesse biotecnológico, como por exemplo, a produção de antibióticos, agentes anti-tumorais e biopolímeros. Estas foram algumas das razões que levaram esta bactéria a ter o seu genoma seqüenciado por uma rede nacional de seqüenciamento de DNA, composta por 25 grupos de pesquisa de todo o país (http://www.brgene.lncc.br/cviolaceum/). Com o seqüenciamento do genoma da C. violaceum (linhagem ATCC 12472), o Brasil se incluiu entre os países com grande interesse na fisiologia e potencial biotecnólogico desta bactéria. Uma das características mais notáveis da C. violaceum é a produção de um pigmento de cor violeta, chamado violaceína, quando cultivada sob condições de aerobiose. Este metabólito e derivados da mesma via têm sido alvo de estudos por apresentarem potencial farmacológico. Neste trabalho são investigados os genes envolvidos na regulação da biossíntese de violaceína, bem como o mecanismo de regulação quorum sensing em C. violaceum (linhagem ATCC 12472; mesma linhagem seqüenciada). Além dos genes cviI e cviR (homólogos aos genes que caracterizam o sistema quorum sensing em bactérias Gram-negativas), outros genes foram encontrados serem reguladores da produção de violaceína. Através da análise de homologia entre seqüências e estruturas de proteínas, gerou-se um modelo da estrutura tridimensional do domínio C-terminal da proteína regulatória CviR, que tem uma ação importante no controle transcricional da expressão do operon vioABCD em C. violaceum. Os genes de regulação da biossíntese de violaceína foram investigados através da construção de mutantes por inserção de transposon (mini-Tn5 luxCDABE). Tais mutantes apresentam pouca produção de pigmento em relação à linhagem selvagem ATCC 12472. Moléculas de sinalização quorum sensing, N-acil-homoserinas lactonas (AHL), também foram investigadas na linhagem selvagem e nas mutantes. Três tipos de moléculas AHL foram identificadas na linhagem selvagem ATCC 12472, sendo que duas são de cadeia curta (N-hexahoil-L-homoserina lactona (HHL); N-(3-oxohexanoil)-L-homoserina lactona (OHHL)) e uma de cadeia longa (N-oxododecanoil)-L-homoserina lactona (OdDHL)), o que demonstra maior complexidade no circuito de regulação quorum sensing nesta linhagem de C.violaceum. Outra forma de regulação da produção de violaceína também foi explorada neste trabalho, assim como a atuação do complexo cAMP-CAP na transcrição do gene cviR, que resulta no estímulo da produção de violaceína quando há baixos níveis de glicose. Um modelo da arquitetura da rede de regulação do operon vioABCD foi desenvolvido com base no mecanismo quorum sensing utilizando-se a técnica matemático-computacional de redes de Petri híbrida. O modelo gerou resultados semi-quantitativos para diferentes condições de simulação, prevendo diferentes níveis de produção de violaceína frente ao nocauteamento de genes regulatórios e a presença de glicose ou glicerol no meio de cultura.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 213797.pdf: 598123 bytes, checksum: f46ae31532c19ffd0175779743125ce0 (MD5) / Os produtos de origem natural são utilizados como fonte de medicamentos para tratar enfermidades que acometem o ser humano desde tempos imemoriais. A terapêutica moderna provavelmente não teria se desenvolvido sem o suporte desses produtos. Os organismos vivos, vegetais, microrganismos, animais, são capazes de produzir, transformar e acumular uma série de substâncias não essenciais para o seu crescimento e metabolismo reprodutivo. Estes compostos são denominados de metabólitos secundários, sendo umas das maiores classes de produtos naturais. Com o aparecimento de novas doenças infecciosas e o aumento da resistência bacteriana, surge a necessidade de pesquisas direcionadas ao desenvolvimento de novos antimicrobianos. A Chromobacterium violaceum, é uma bactéria Gram-negativa, de vida livre, que popula solos e águas das regiões tropicais e sub-tropicais. Esta bactéria é responsável pela produção de uma diversidade de metabólitos secundários com grande potencial biotecnológico. Este trabalho teve como objetivo definir estratégias de cultivo, que promovessem o aumento na produção de violaceína e outros metabólitos secundários sintetizados por C. violaceum, bem como avaliar a atividade antibiótica dos principais pigmentos. Sendo assim, estudou a produção de violaceína e pigmentos relacionados, em meios sólidos e líquidos com diferentes fontes de carbono. Foram avaliadas as produções de massa celulares secas, bem como a produção dos pigmentos. Os maiores rendimentos foram em meio LB sólido com glicerol 1%. Os pigmentos foram extraídos em Soxhlet, utilizou-se éter etílico, clorofórmio e metanol como solventes. No extrato etéreo observou-se a predominância de desoxiviolaceína e um pigmento não identificado. Nos extratos metanólicos, violaceína foi o pigmento majoritário. Os pigmentos isolados foram testados para atividade antibiótica contra três espécies bacterianas: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Os resultados mostraram que o extrato metanólico foi mais efetivo sobre P. aeruginosa, na concentração de 125 mg/mL. No entanto, o extrato metanólico nas concentrações analisadas, teve o efeito reduzido sobre as demais bactérias testadas. O extrato etéreo exibiu alta atividade sobre P. aeruginosa. Este extrato mostrou-se o mais efetivo dos extratos sobre as outras linhagens bacterianas testadas. Embora, não obtido o isolamento completo dos pigmentos produzidos por C. violaceum, o extrato etéreo contendo desoxiviolaceína e o pigmento não identificado, sem violaceína, exibiu uma atividade antibiótica promissora.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-graduação em Engenharia Química. / Made available in DSpace on 2012-10-22T01:54:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 212669.pdf: 1833661 bytes, checksum: 70e133626b8e9ea8a2f36eae5af1993f (MD5) / Exopolissacarídeos (EPS) são os principais constituintes de biofilme bacteriano. Esses polímeros, componentes da matriz extracelular bacteriana, têm despertado grande interesse em aplicações industriais e na área médica. Entretanto, têm sido associado com mecanismos de combate bacteriano. A celulose tem sido identificada como um dos EPS da matriz extracelular produzido por várias espécies de bactérias durante a formação de biofilmes. A bactéria Gram-negativa Chromobacterium violaceum, linhagem ATCC 12472, teve seu genoma recentemente seqüenciado pelo Brazilian National Genome Project Consortion. A análise do genoma da C. violaceum mostrou a presença de genes relacionados à biossíntese de celulose, até então desconhecidos. Neste trabalho, analisou-se a estrutura e organização dos genes diretamente envolvidos na biossíntese de celulose, e buscou-se evidências experimentais da presença de celulose na matriz extracelular do biofilme formado por esta bactéria. A metodologia empregada envolveu o uso de ferramentas de bioinformática que exploram informações do seu genoma, como estrutura dos genes, elementos de regulação, domínios e motivos conservados. Ensaios laboratoriais foram utilizados para se obter evidências experimentais das informações genômicas. Estas estratégias permitiram determinar a existência de um operon que compreende cinco genes estruturais codificando as proteínas e enzimas do complexo celulose sintase, como também propor uma via metabólica de biossíntese de celulose a partir de glicose. Identificaram-se ainda 43 ORFs (open reading frames) com domínio GGDEF normalmente associado à atividade de síntese de diguanilmonofosfato cíclico (c-di-GMP) a partir de duas moléculas de guanosina trifosfato (GTP). A molécula c-di-GMP funciona como um componente regulatório de diversas atividades celulares, entre elas a ativação da síntese de celulose. Experimentalmente foi analisado o produto do biofilme formado durante o cultivo de C. violaceum em meio Luria Bertani (LB), culturas estática e agitada. Os resultados obtidos sugerem a presença de celulose como componente do biofilme.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5248_1.pdf: 1569937 bytes, checksum: 3f1b3a3de1d5f859ab866845b409c75b (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, pigmentada, aeróbica facultativa, que vive em regiões de climas tropicais e subtropicais, encontrada principalmente, em solos e rios. Seu potencial biotecnológico demonstrado foi através do genoma seqüenciado da C. violaceum ATCC 12472, que apresentou genes desconhecidos relacionados à biossíntese de quitina. Neste trabalho foi avaliada inicialmente a diversidade genética de quatorze linhagens de C. violaceum de diferentes procedências, utilizando métodos bioquímicos e moleculares, das quais duas foram selecionadas para análise do sistema quitinolítico. As linhagens foram crescidas no meio Luria Bertani (LB) e caracterizadas pelo perfil de ácidos graxos e do gene 16S rDNA, e a diversidade genética, pela técnica de rep-PCR. Em seguida, foi realizada a caracterização das linhagens de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 para a biossíntese de quitina, utilizando células crescidas em meio Luria Bertani (LB) com e sem a presença de quitina coloidal 0,2%, sendo quantificada a atividade quitinásica (gel de atividade e ensaios enzimáticos com dímero e trímero) e proteínas totais. As amostras foram analisadas em gel de eletroforese SDSPAGE, corados com Azul de Coomassie G-250 e os géis da atividade quitinásica foram corados com calcofluor. Para a caracterização do gene de quitinase foram utilizadas seqüências codificadoras de quitinase A e endoquitinase (Cv1897 e Cv2736), utilizando-se o DNA genômico de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 como molde na técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), usando oligonucleotídeos específicos. A metodologia empregada envolveu o uso de ferramentas de bioinformática que exploram informações do genoma, como estrutura dos genes, elementos de regulação, domínios e motivos conservados. Os resultados do perfil de ácido graxos e 16S rDNA permitiu a caracterização das linhagens e o rep-PCR demonstrou que as linhagens estudadas apresentam uma diversidade genética. As linhagens de C. violaceum selecionadas apresentaram um perfil diferenciado de atividade quitinolítica em gel desnaturante com a presença de glicol quitina. Nos ensaios com os substratos sintéticos (N,N - diacetilquitobiose e N, N , N -triacetilquitotriose), verificou-se que houve atividade para ambos ossubstratos. Os resultados indicaram que os maiores valores da atividade quitinolítica foram observados usando-se o cromóforo diacetilquitobiose. A seqüência codificadora do gene CV1897 (endoquitinase) apresentou 439 aminoácidos, correspondendo ao domínio quitinase (CDD:29557) da família 19 da glicosil hidrolase (257 aminoácidos), formada por enzimas que catalisam e hidrolisam as unidades β-1,4-N-acetil-D-glucosamina ligadas no polímero de quitina. Além desta região, as bases restantes proporcionaram a formação de dois sítios, um putativo para a construção de açucares e outro constituído por resíduos catalíticos. A seqüência correspondente ao produto do gene Cv2935 sugere uma provável quitinase A no genoma de C. violaceum ATCC 12472 (BrGene), sendo formada por 439 aminoácidos. Observou-se duas regiões: i) a ChtBD3 como um domínio obrigatório para quitina tipo 3 (29..73) e CDD:47799; ii) a quitinase A com um CDD: 33272 responsável pelo transporte e metabolismo de carboidratos (109..419), pertencente a família 18 da glicosil hidrolase. Os resultados obtidos caracterizaram a C. violaceum UCP 1489 com alta identidade com a linhagem ATCC 12472, demonstrando também, ambos aspectos biotecnológico de produção das enzimas quitinase A (exoquitinase) da família 18 e a endoquitinase da família 19