The aim of this work was to determine whether there are besides morphogenetic and metabolomic changes in viroid-infected plants also some alterations in the expression of transcription factors (TFs) known from our previous work to be involved in the secondary metabolites production, namely HlMyb1, HlMyb3, HlbHLH, HlbZIPA and HlbZIP2 TFs. Infectious vectors were prepared containing dimers of two closely related viroids- hop stunt viroid (HSVd) and cucumber pale fruit viroid (CPFVd). To achieve infection of hop (Humulus lupulus L.), biolistic inoculation of young shoots was performed. Hop cv. Admiral was chosen as a model for our experiments, because of its high flavonoid content in leaves. Infection of hop with both of these viroid species was proven by means of Northern hybridization and dot-blot techniques. Plants infected with HSVd showed serious symptoms such as stunted growth, epinasty and rugosity of leaves. Interestingly, decoloration of the petioles of the plants infected with HSVd was observed, maybe as a result of lower anthocyanins production. These symptoms were similar but milder in CPFVd-infected hops. On plants bearing symptoms, HPLC analyses were performed and compared to controls to detect changes in the levels of flavonol glycosides, phenolic acids, bitter acids and xanthohumol. In HSVd-infected hop leaves and petioles, significant decrease in the contents of flavonol glycosides and phenolic acids was observed. On the other hand, an increase in the amount of xanthohumol and bitter acids was detected in HSVd-infected tissues compared to healthy controls. Unlike to HSVd infection, the decrease of all analyzed secondary metabolites was observed in CPFVd-infected material. This difference suggests an alternative response of metabolome pathways to CPFVd-caused pathogenesis in comparison to HSVd. Semiquantitative RT PCR was performed to assay levels of TFs in healthy and infected hop tissues. Quantitative RealTime analyses of putative hop transcription factors HlbZIPA and HlbZIP2 were carried out using RNA isolated from HSVd-infected petioles. Increased mRNA levels of bZIP TFs were detected in infected material, suggesting an involvement of these factors in the response of the host plants to HSVd infection. Using thermodynamic methods of TGGE and heteroduplex analysis, several sequence variants of HlbZIP2 were idetified. According to aminoacid sequence alignment, this putative factor belongs to a group of bZIP proteins known for ABA/stress signalling in A. thaliana.

Hepatitis delta virus (HDV) is the smallest known human RNA pathogen. It requires the human hepatitis B virus (HBV) for virion production and transmission, and is hence closely associated with HBV in natural infections. HDV RNA encodes only two viral proteins - the small and the large delta antigens. Due to its limited coding capacity, HDV needs to exploit host factors to ensure its propagation. However, few human proteins are known to interact with the HDV RNA genome. The current study has identified several host proteins interacting with an HDV-derived RNA promoter by multiple approaches: mass spectrometry of a UV-crosslinked ribonucleoprotein complex, RNA affinity chromatography, and screening of a library of purified RNA-binding proteins. Co-immunoprecipitation, both in vitro and ex vivo, confirmed the interactions of eEF1A1, p54nrb, PSF, hnRNP-L, GAPDH and ASF/SF2 with both polarities of the HDV RNA genome. In vitro transcription assays suggested a possible involvement of eEF1A1, GAPDH and PSF in HDV replication. At least three of these proteins, eEF1A1, GAPDH and ASF/SF2, have also been shown to associate with potato spindle tuber viroid (PSTVd) RNA. Because HDV’s structure and mechanism of replication share many similarities with viroids, subviral helper-independent plant pathogens, I transfected human hepatocytes with RNA derived from PSTVd. Here, I show that PSTVd RNA can replicate in human hepatocytes. I further demonstrate that a mutant of HDV, lacking the delta antigen coding region (miniHDV), can also replicate in human cells. However, both PSTVd and miniHDV require the function of the small delta antigen for successful replication. Our discovery that HDV and PSTVd RNAs associate with similar RNA-processing pathways and translation machineries during their replication provides new insight into HDV biology and its evolution.

Los viroides, los agentes infecciosos más simples de la escala biológica, están constituidos por una molécula circular de RNA monocatenario de aproximadamente 250-400 nucleótios (nt) que no codifica proteína alguna. A pesar de esta simplicidad estructural, los viroides son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente y en muchos casos causar enfermedades en sus plantas huéspedes. Las infecciones producidas por viroides representativos generan la acumulación de pequeños RNAs viroidales (vd-sRNAs) de 21-24 nt con características similares a los pequeños RNA interferentes (siRNAs), la huella dactilar del silenciamiento mediado por RNA. La identificación de los vd-sRNAs implica que los viroides son diana de la primera barrera de silenciamiento mediado por RNA, formada por las RNasas ‘Dicer-like’ (DCLs). Para examinar si los vd-sRNAs se unen a las proteínas AGOs —el componente clave del complejo RISC (‘RNAinduced silencing complex’) que constituye la segunda barrera del silenciamiento mediado por RNA— hojas de Nicotiana benthamiana infectadas por el viroide del tubérculo fusiforme de la patata (PSTVd) se agroinfiltraron con nueve de las diez proteínas AGOs de Arabidopsis thaliana. Inmunoprecipitaciones a partir de los halos agroinfiltrados y análisis ‘Western-’ y ‘Northern-blot’ han mostrado que todas las AGOs se expresaron y, a excepción de AGO6, AGO7 y AGO10, unieron vd-sRNAs: AGO1, AGO2 y AGO3 los de 21 y 22 nt, mientras que AGO4, AGO5 y AGO9 también mostraron afinidad por los de 24 nt. La secuenciación masiva mostró que las AGO1, AGO2, AGO4 y AGO5 agroexpresadas unen los PSTVd-sRNAs en función de su tamaño y nucleótido 5’-terminal, y que los perfiles de los correspondientes vd-sRNAs cargados en las AGOs adoptan una distribución específica a lo largo del genoma viroidal. La agroexpresión de AGO1, AGO2, AGO4 y AGO5 en hojas de N. benthamiana infectadas con PSTVd atenuó la acumulación de los RNAs genómico viroidales, indicando que éstos, o sus precursores, también son diana de RISC. En contraste con los ribovirus, la infección de PSTVd en N. benthamiana no afectó de forma significativa la regulación mediada por miR168 de la AGO1 endógena, que carga vd-sRNAs con especificidad similar a su homóloga de A. thaliana. Mientras se conoce bien la biogénesis de los RNA viroidales, su degradación está restringida a algunos datos que implican al silenciamiento mediado por RNA. En el curso de nuestros estudios sobre el PSTVd, hemos observado consistentemente un patrón de 6-7 RNAs subgénomicos (sgRNAs) de polaridad (+) que aparecen junto con los RNAs monoméricos circulares y lineares en berenjena, un huésped experimental de este viroide. Hibridaciones ‘Northern-blot’ con sondas de tamaño parcial y completo, mostraron que los sgRNAs (+) de PSTVd derivan de diferentes regiones del RNA genómico y que algunos son parcialmente solapantes. Parte de los sgRNAs (+) de PSTVd se observaron también en N. benthamiana y tomate, donde han pasado desapercibidos a causa de su menor acumulación. El análisis por extensión de cebador de sgRNAs (+) de PSTVd representativos excluye que sean productos de terminaciones prematuras de la transcripción, pues carecen del extremo 5’ común que cabría esperar si ésta empezara en una posición específica. Ulteriores análisis mediante 5’- y 3’-RACE indican que los sgRNAs (+) de PSTVd tienen extremos 5’-OH y 3’-P, que probablemente resultan de cortes endonucleolíticos de precursores más largos catalizados por RNasas típicas que generan este tipo de extremos. Análisis de sgRNA (-) de PSTVd, que también se acumulan en berenjena infectada, mostraron que presentan características estructurales muy similares a los sgRNA (+). Nuestros resultados proporcionan una nueva visión de cómo ocurre la degradación in vivo de los RNAs viroidales, posiblemente durante su replicación, y sugieren que síntesis y degradación de las cadenas de PSTVd están conectadas, como se ha observado en los mRNAs. / Minoia, S. (2015). Degradación in vivo de un viroide de replicación nuclear: rutas catalizadas por proteínas Argonauta cargadas con pequeños RNAs viroidales y por otras ribonucleasas que generan RNAs subgenómicos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48553 / TESIS

Los cítricos son huéspedes naturales de diferentes especies de viroides, todos pertenecientes a la familia Pospiviroidae. Estudios preliminares para detectar viroides en especies y variedades comerciales dieron resultados erráticos, excepto cuando se utilizaba la especie indicadora cidro Etrog como huésped bioamplificador. Para evitar el uso de este huésped en los ensayos de detección, se desarrolló un método basado en la hibridación northern. El protocolo desarrollado consistía en: (i) extracción de ácidos nucleicos de muestras de corteza recolectadas en diferentes épocas y/o almacenadas en distintas condiciones; (ii) separación de los RNAs en 5% PAGE o 1% agarosa y transferencia a membranas; (iii) hibridación con sondas de DNA marcadas con digoxigenina (DIG) específicas para cada viroide, detección con un anticuerpo anti-DIG conjugado con fosfatasa alcalina y revelado con un substrato quimioluminiscente (CSPD). Con este método se pueden detectar viroides en todas las especies de cítricos ensayadas. La técnica es extremadamente sensible, y acorta el tiempo necesario para la detección fiable de los viroides de cítricos conocidos hasta el momento. La aplicación de esta técnica ha permitido realizar prospecciones en árboles cultivados en distintas regiones citrícolas de Colombia, Perú y Brasil. En limas Tahití de Colombia se han identificado infecciones múltiples con HSVd y CDVd o con CEVd, HSVd y CDVd. Las muestras procedentes del Banco de Germoplasma de Palmira estaban libres de viroides, excepto una fuente de cidro Etrog que estaba infectada con CEVd y CDVd. / Murcia Riaño, N. (2009). DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN AGRONÓMICA DE VIROIDES DE CÍTRICOS. IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y BIOLOGÍCA DE VARIANTES DEL VIROIDE DEL ENANISMO DE LOS CÍTRICOS CDVd [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6343 / Palancia

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Le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd) est un pathogène mondialement répandu et responsable de pertes (directes et indirectes) relativement importantes au niveau de la culture des pêchers. Cependant, peu de données sont actuellement disponibles en ce qui concerne dune part le(s) déterminant(s) de pathogénicité de ce viroïde et dautre part les éventuels mécanismes de résistance des plantes vis-à-vis des viroïdes. Lapproche originale de ce travail a été de jeter les bases de cette double caractérisation. Dans un premier temps, le rôle du pseudo-nud P8, commun à tous les variants du PLMVd actuellement séquencés, a été étudié par mutagenèse dirigée. Dans un second temps, la réponse moléculaire de plants de pêchers infectés par des variants de pathogénicités différentes a été caractérisée par le biais de la cDNA-AFLP. Lobjectif principal de cette thèse était didentifier une voie métabolique éventuellement impliquée dans la résistance des plants de pêcher contre ce viroïde. Au terme de ce travail, il est apparu que le pseudo-nud P8 était impliqué soit dans la stabilité du viroïde au sein des cellules infectées soit dans la réplication du viroïde. En effet, le variant inoculé présentant un pseudo-nud déstabilisé a montré une réplication réduite au cours des douze mois de létude. De plus, bien que le viroïde muté soit présent dans les plantes inoculées, aucun symptôme na été observé. Il est cependant trop tôt pour déterminer si cette latence apparente est due à une quantité trop faible du viroïde ou bien à une implication du pseudo-nud dans la pathogénicité du viroïde. La caractérisation de lexpression des gènes de plants de pêchers infectés par des variants de pathogénicité différente a permis de montrer que le PLMVd réprimait des gènes impliqués dans la photosynthèse et en particulier dans la protection des deux photosystèmes. Cette expression particulière des gènes des plantes infectées peut être mise en relation avec les symptômes de chlorose et de mosaïque sexprimant au cours dune infection par le PLMVd. Cependant, nous ne pouvons encore affirmer avec certitude si elle est une cause ou une conséquence de ces symptômes. De même, la cDNA-AFLP a permis de mettre en évidence la répression de protéines de choc thermique (HSPs) dans les feuilles symptomatiques. Ces protéines jouent généralement un rôle dans le repliement des protéines ainsi que dans leur assemblage, leur déplacement, leur stabilisation et leur dégradation. La régulation de leur expression peut donc avoir une grande influence dans les plantes infectées et, peut-être, jouer un rôle dans lexpression des symptômes. De même, le gène codant pour une novel cap-binding protein (nCBP) est apparu sous-exprimé dans les feuilles symptomatiques. Le rôle de ces protéines est encore mal connu mais elles pourraient intervenir dans la régulation de la traduction des ARNm. Leur répression peut donc également avoir un impact important et déstabiliser diverses voies métaboliques. Enfin deux gènes codant clairement pour des protéines de défense des plantes ont été identifiés. Il sagit dun gène codant pour un intermédiaire de la thiamine (impliquée dans le déclenchement de la SAR, surexprimé dans les feuilles asymptomatiques) et dun autre gène codant pour une protéine inhibitrice des polygalacturonases (sur-exprimé dans les feuilles symptomatiques). Le rôle exact de ces protéines dans la protection des plantes vis-à-vis du viroïde nest cependant pas encore clair. Ce travail constitue une première étude des relations hôte-pathogène établies durant une infection de plants de pêcher par le PLMVd. Cest également le premier, à notre connaissance à avoir analysé lexpression des gènes de plantes infectées en fonction des symptômes observés./ The Peach latent mosaic viroid (PLMVd) infects peach trees in all production areas. This pathogen is responsible of direct and indirect crop losses. However only a few data are available as regards on one hand the determinant of pathogenicity of this viroid and on the other hand the resistance mechanisms of plants against this pathogen. The original approach of this work was to give the foundation of this double characterization. Firstly, the role of the P8 pseudoknot, present in every sequenced PLMVd, was studied by directed mutagenesis. Secondly, the molecular response of different peach trees infected by different variants was evaluated by the use of the cDNA-AFLP. The main objective of this thesis was to identify a metabolic pathway implicated in the plant defence against the PLMVd. In the term of this work, it seemed that the P8 pseudoknot was implicated either in the stability or in the replication of the viroid into the infected cells. Indeed, the inoculated variant (with a destabilized pseudoknot) has shown a reduced replication during the cultural season. In spite of the presence of the mutated variant in the plants, no symptom was observed on the peach tree leaves. However, we cannot conclude if this absence of symptom is due to the low viroid quantity either to an implication of the pseudo-knot in the pathogenicity of the PLMVd. The characterization of the gene expression in the infected peach trees has allowed to highlight that the PLMVd represses genes implicated in the photosynthesis and more specifically genes involved in the protection of the two photosystems. This particular gene expression in the infected leaves was linked to the chlorosis and mosaic induced by the PLMVd. However, we cannot conclude with certitude if these symptoms are a cause or a consequence of this particular genes expression. The cDNA-AFLP has also allowed to identify the repression of genes coding for heat shock proteins (HSPs) in symptomatic leaves. These proteins generally have a role in the protein folding, assembly, translocation, stabilization and degradation. The regulation of their expression may have a great influence in the infected plants and, maybe, play a role in the symptoms expression. The gene coding for the novel cap-binding protein (nCBP) was also identified has repressed in the symptomatic leaves. The biological role of these proteins is unclear but it seems that these proteins act in the regulation of the mRNA translation. The repression of nCBP may thus have an important impact and to destabilize various biological pathways. Finally, two genes implicated in the plant defence were identified. One coding for a polygalacturonase inhibitor (over-expressed in symptomatic leaves) and the other one coding for a thiamine intermediate (involved in the SAR and over-expressed in the non-symptomatic leaves). The role of these proteins in the plant defence against the PLMVd is however unclear. To our knowledge, this is the first work where the host-pathogen relationship established during a PLMVd infection are studied. This is also the first time were the gene expression is linked to the viroid-induced symptoms.

[ES] Los viroides, genomas mínimos de RNA circular no codificante, monocatenarios y muy estructurados, parasitan factores celulares de las plantas para replicarse autónomamente, establecer infecciones sistémicas y usualmente causar enfermedades. Los de la familia Avsunviroidae se replican y acumulan en cloroplastos por un mecanismo de círculo rodante simétrico. Una RNA polimerasa cloroplástica produce concatémeros lineales de polaridad complementaria que son reducidos a monómeros por las ribozimas de cabeza de martillo (HHR) del concatémero. Producen extremos 5'-hidroxilo y 2',3'-fosfodiéster cíclico, que la isoforma cloroplástica de la tRNA ligasa convierte en enlaces 5',3'-fosfodiéster intramoleculares, generando viroides circulares de polaridad complementaria que pueden entrar en otra ronda de transcripción, simétrica a ésta. En esta Tesis se han analizado las secuencias y estructuras viroidales esenciales para su circularización, usando como modelo el viroide latente de berenjena (ELVd), que induce infecciones asintomáticas en berenjena. Expresamos en Escherichia coli precursores del ELVd(+) lineales flanqueados por dos copias de su HHR. Su procesamiento genera monómeros con los extremos adecuados para la ligación por la tRNA ligasa de la berenjena, que es coexpresada. Mutaciones puntuales y deleciones en el sitio nativo de ligación sugieren que solo el dominio HHR es esencial para la circularización. La conservación de la secuencia y estructura de la HHR con las del sustrato natural del enzima (los tRNAs) nos hacen proponer que la HHR del ELVd secuestra la ligasa mimetizando las características generales del bucle anticodón de los tRNAs. Este sistema de expresión permite también producir RNAs recombinantes, insertándolos en una posición particular del RNA del ELVd. Las quimeras son procesadas por las HHRs flanqueantes y sus extremos ligados por la tRNA ligasa. El andamiaje viroidal circular, compacto y posiblemente asociado a la ligasa, permite aumentar la vida media del RNA de interés y su acumulación en la bacteria. En esta Tesis adaptamos el sistema para producir RNAs de doble cadena (dsRNAs) que desencadenen interferencia por RNA (RNAi), un mecanismo de defensa y regulación génica eucariota basado en la complementariedad de bases entre RNAs. dsRNAs complementarios a genes endógenos reducen los niveles de sus transcritos y generan fenotipos de pérdida de función. Los insectos pueden tomar dsRNAs del ambiente, internalizarlos en sus células y distribuirlos sistémicamente, haciendo al RNAi una estrategia prometedora para el control de plagas. Para producir dsRNAs, separamos las repeticiones invertidas del gen diana que genera la horquilla con el cDNA de un intrón autocatalítico del grupo I de Tetrahymena thermophila, aumentando la estabilidad de los plásmidos de expresión. El intrón es eliminado tras la transcripción, resultando en una molécula viroidal de la que protruye el dsRNA de interés. Flanquear las repeticiones invertidas con una copia adicional permutada del intrón permite separar el ELVd del producto final, un dsRNA circular cerrado en ambos lados por pequeños bucles. Ambas moléculas poseen actividad reguladora: las quimeras viroide-dsRNA con homología al gen de la unión septada suave 1 del gusano de la raíz del maíz (Diabrotica virgifera virgifera) exhiben actividad insecticida oral contra las larvas similar a la de horquillas sintetizadas in vitro, y los dsRNAs circulares sin andamiaje viroidal homólogos al gen de la ATPasa vacuolar (subunidad A) y la proteína ribosomal S13 silencian eficientemente estos genes en adultos de la mosca del Mediterráneo (Ceratitis capitata); este caso es de especial relevancia al ser la primera demostración del RNAi para el control de esta plaga. En conclusión, a pesar de su limitada relevancia agrícola, el ELVd es útil para investigar la biología molecular de la familia Avsunviroidae y una poderosa herramienta biotecnológica en combinación con el sistema de expresión en E. coli. / [CA] Els viroides, genomes mínims d'RNA circular no codificant, monocatenaris i molt estructurats, parasiten factors cel·lulars de les plantes per a replicar-se autònomament, establir infeccions sistèmiques i usualment causar malalties. Els de la família Avsunviroidae es repliquen i acumulen en cloroplasts per un mecanisme de cercle rodant simètric. Una RNA polimerasa cloroplàstica produeix concatèmers lineals de polaritat complementària que són reduïts a monòmers per els ribozims de cap de martell (HHR) del concatèmer. Produeixen extrems 5'-hidroxil i 2',3'-fosfodièster cíclic, que la isoforma cloroplàstica de la tRNA lligasa converteix en enllaços 5',3'-fosfodièster intramoleculars, generant viroides circulars de polaritat complementària que poden entrar en una nova ronda de transcripció, simètrica a la primera. En aquesta Tesi s'han analitzat les seqüències i estructures viroidals essencials per a la seua circularització, emprant com a model el viroide latent d'albergínia (ELVd), que indueix infeccions asimptomàtiques en albergínia. Expressem en Escherichia coli precursors de l'ELVd(+) lineals flanquejats per dos còpies del seu HHR. El seu processament produeix monòmers amb els extrems apropiats per a la lligació mediada per la tRNA ligasa de l'albergínia, que és coexpressada. Mutacions puntuals i delecions en el lloc nadiu de lligació suggereixen que només el domini HHR és essencial per a la circularització. La conservació de la seqüència i estructura del HHR amb les del substrat natural de l'enzim (els tRNAs) ens fan proposar que el HHR de l'ELVd segresta la lligasa mimetitzant les característiques generals del bucle anticodó dels tRNAs. Aquest sistema d'expressió també permet produir RNAs recombinants, inserint-los en una posició particular de l'RNA de l'ELVd. Les quimeres són processades pels HHR flanquejants i els seus extrems lligats per la tRNA lligasa. L'RNA viroïdal circular, compacte i possiblement associat a la lligasa, permet augmentar la vida mitjana de l'RNA d'interés i la seua acumulació en els bacteris. En aquesta Tesi adaptem el sistema per a produir RNAs de doble cadena (dsRNAs) que desencadenen interferència per RNA (RNAi), un mecanisme de defensa i regulació gènica eucariota basat en la complementarietat de bases entre RNAs. dsRNAs complementaris a gens endògens redueixen els nivells dels seus transcrits i generen fenotips de pèrdua de funció. Els insectes poden prendre dsRNAs de l'ambient, internalitzar-los en les seues cèl·lules i distribuir-los sistèmicament, fent a l'RNAi una estratègia prometedora en el control de plagues. Per a produir dsRNAs, separem les repeticions invertides del gen diana que genera la forqueta amb el cDNA d'un intró autocatalític del grup I de Tetrahymena thermophila, augmentant l'estabilitat dels plasmidis d'expressió. L'intró és eliminat després de la transcripció, resultant en una molècula viroïdal de la qual protrueix el dsRNA d'interés. Flanquejar les repeticions invertides amb una còpia addicional permutada de l'intró permet separar l'ELVd del producte final, un dsRNA circular tancat als dos costats per xicotets bucles. Els dos tipus de molècules posseeixen activitat reguladora: les quimeres viroide-dsRNA amb homologia al gen de la unió septada suau 1 del cuc de l'arrel de la dacsa (Diabrotica virgifera virgifera) exhibeixen activitat insecticida oral contra les larves similar a la de forquetes sintetitzades in vitro, i els dsRNAs circulars sense l'RNA viroïdal homòlegs al gen de la ATPasa vacuolar (subunitat A) i la proteïna ribosomal S13 silencien eficientment aquests gens en adults de la mosca del Mediterrani (Ceratitis capitata); aquest cas és d'especial rellevància perquè és la primera demostració de l'RNAi per al control d'aquesta plaga. En conclusió, malgrat la seua limitada rellevància agrícola l'ELVd és útil per a investigar la biologia molecular de la família Avsunviroidae i una poderosa ferramenta biotecnològica en combinació amb el sistema d'expressió en E. coli. / [EN] Viroids, minimal genomes of non-coding circular RNA, single-stranded and highly structured, parasitize plant cellular factors to replicate autonomously, establish systemic infections, and typically cause disease. Those of the family Avsunviroidae replicate and accumulate in chloroplasts by a symmetrical rolling circle mechanism. A chloroplast RNA polymerase produces linear concatemers of complementary polarity that are reduced to monomers by the hammerhead ribozymes (HHR) of the concatemer. They produce 5'-hydroxyl and 2',3'-cyclic phosphodiester ends, which the chloroplastic isoform of tRNA ligase converts to intramolecular 5',3'-phosphodiester bonds, generating circular viroids of complementary polarity that can enter another round of transcription, symmetric to the first one. In this Thesis, the viroid sequences and structures essential for its circularization have been analyzed, using as a model the eggplant latent viroid (ELVd), which induces asymptomatic infections in eggplant. We expressed in Escherichia coli linear ELVd(+) precursors flanked by two copies of its HHR. Its processing generates monomers with suitable ends for ligation by the eggplant tRNA ligase, which is co-expressed. Point mutations and deletions at the wild-type ligation site suggest that only the HHR domain is essential for circularization. The conservation of the sequence and structure of the HHR with those of the natural substrate of the enzyme (the tRNAs) lead us to propose that the HHR of the ELVd hijacks the ligase, mimicking the general characteristics of the anticodon loop of the tRNAs. This expression system also allows the production of recombinant RNAs, inserting them into a particular position of the ELVd RNA. Chimeras are processed by flanking HHRs and their ends ligated by the tRNA ligase. The compact, circular viroidal scaffold, possibly associated with the ligase, allows increasing the half-life of the RNA of interest and its accumulation in the bacteria. In this Thesis we adapt the system to produce double-stranded RNAs (dsRNAs) that trigger RNA interference (RNAi), a eukaryotic gene regulation and defense mechanism based on base complementarity between RNAs. dsRNAs complementary to endogenous genes reduce the levels of their transcripts and generate loss-of-function phenotypes. Insects can take dsRNAs from the environment, internalize them into cells, and distribute them systemically, making RNAi a promising pest control strategy. To produce dsRNAs, we separated the inverted repeats of the target gene that generates the hairpin with the cDNA of a group-I autocatalytic intron from Tetrahymena thermophila, increasing the stability of the expression plasmids. The intron is removed after transcription, resulting in a viroidal molecule from which the dsRNA of interest protrudes. Flanking the inverted repeats with an additional copy of the intron in a permuted form allows the ELVd molecule to be separated from the final product, a circular dsRNA molecule capped on both sides by small loops. Both molecules have regulatory activity: the viroid-dsRNA chimeras with homology to the smooth septate junction 1 gene of the corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) exhibit oral insecticidal activity against larvae similar to that of in vitro synthesized hairpins, and the circular dsRNAs without the viroid scaffold homologous to the vacuolar ATPase (subunit A) and ribosomal protein S13 genes efficiently silence those genes in adult Medfly (Ceratitis capitata); this case is of special relevance as it is the first demonstration of RNAi for the control of this pest. In conclusion, despite its limited agricultural relevance, the ELVd is useful for investigating the molecular biology of the Avsunviroidae family and a powerful biotechnological tool in combination with the E. coli expression system. / This work was supported by the Ministerio de Ciencia e Innovación (Spain; co-financed by the European Regional Development Fund) [BIO2017-83184-R] and [BIO2017‐ 91865‐EXP]; Universitat Politècnica de València [PAID-01-17]. We acknowledge support of the publication fee by the CSIC Open Access Publication Support Initiative through its Unit of Information Resources for Research (URICI). / Ortolá Navarro, B. (2023). Heterologous expression of circular RNAs in Escherichia coli for analyzing the ligation process of chloroplastic viroids and producing double-stranded RNAs with insecticidal activity [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/192635