Thesis (Ph.D.)--University of Nebraska-Lincoln, 2006. / Title from title screen (site viewed May 23, 2007). PDF text: iv, 165 p. : ill. (some col.) ; 1.95Mb UMI publication number: AAT 3237062. Includes bibliographical references. Also available in microfilm and microfiche formats.

Ácaros Brevipalpus yothersi Baker (1949) são vetores do citrus leprosis virus C (CiLV-C), o mais comum causador da leprose dos citros. Esta é considerada, atualmente, a doença viral de maior importância na cultura dos citros no Brasil e ocorre também em países da América do Sul e Central, além do México, na América do Norte. A doença prejudica a vida útil da planta, devido à queda de folhas e frutos, e seca de ramos, podendo levá-la à morte quando o ataque é demasiadamente severo. O controle e manejo da leprose são basicamente atribuídos ao uso de acaricidas, demandando dos produtores um acréscimo significativo no orçamento por defensivos agrícolas e potencial risco ao ambiente. Nos últimos anos, análises de expressão gênica (transcriptoma), envolvendo ácaros praga da agricultura, resultaram em informações importantes como o envolvimento de genes específicos no processo de resistência a acaricidas e desenvolvimento biológico. No entanto, ainda pouco se sabe sobre a interação do ácaro B. yothersi com o CiLV-C, tornando o estudo de transcriptoma muito significativo para a obtenção de informações aprofundadas sobre o atípico padrão vírus-vetor do patossistema leprose. Assim, através do sequenciamento de RNA (RNAseq), foi investigado o perfil de expressão diferencial entre ácaros B. yothersi virulíferos e avirulíferos. O RNAseq foi realizado em sistema Illumina HiSeq 2500, e os dados analisados com base em linguagem R e ferramentas do software Bioconductor. Os reads sequenciados foram mapeados no genoma de B. yothersi e foi feita análise de expressão utilizando DESeq2. Foram observados 5.690 genes diferencialmente expressos (GDE), sendo 2.736 transcritos induzidos em ácaros virulíferos. Os GDE foram analisados em banco de dados do NCBI, buscando por proteínas similares em artrópodes. Dentre os transcritos induzidos em B. yothersi, potencialmente em resposta ao CiLV-C, foram encontrados genes relacionados ao processo de detoxificação de xenobióticos, metabolismo primário e imunidade, com possível envolvimento na interação vírus-vetor. A expressão de 23 genes foi verificada por RT-PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). As análises indicaram que os genes envolvidos em detoxificação são induzidos durante a interação entre o ácaro da leprose e o CiLV-C. / The false spider mite Brevipalpus yothersi Baker (1949) is recognized as vector of citrus leprosis virus C (CiLV-C), the most common causal agent of citrus leprosis disease. Currently, it is considered the viral disease of major importance in citrus in Brazil and occurs in countries of South and Central America, as well as in Mexico, North America. It reduces the lifespam of the plants due to leaf and fruit drop, dried branches, and can lead to death when the attack is severe. The management of leprosis is based primarily on the chemical control of the mite vector, increasing significantly the cost of production and harming the environment. On the last years, gene expression (transcriptome) analyzes involving phytophagous mites resulted in important data, such as the involvement of specific genes in the process of resistance to acaricides and biological development. However, there is little information about B. yothersi-CiLV-C interaction, making the transcriptome a very interesting tool to obtaining data regarding the atypical virus-vector relationship of the leprosis pathosystem. RNA sequencing (RNAseq) was used to investigate the differential expression profiles between viruliferous and aviruliferous B. yothersi mites. The RNAseq was performed using the Illumina HiSeq 2500 system, the data were analyzed using the R language and Bioconductor software packages. The sequenced reads were mapped on the genome of B. yothersi and expression analysis was performed in DESeq2. We identified 5.690 differentially expressed genes (DEGs), of which 2.736 transcripts were induced in viruliferous mites. The DEGs were analyzed in NCBI database, searching for similar proteins in arthropods. Among the transcripts induced in response to CiLV-C, there are genes related to the detoxification of xenobiotics, primary metabolism, immunity and possible involvement in the virus-vector interaction. Expression of 23 genes was verified by quantitative real-time RT-PCR (RT-qPCR). The analyzes indicate that detoxification genes are induced during the interaction between the false spider mite and CiLV-C.

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23786号 / 医博第4832号 / 新制||医||1057(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 小柳 義夫, 教授 髙折 晃史, 教授 齊藤 博英 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Thesis (Ph.D.) - University of Queensland, 2004. / Program shared between two schools. Includes bibliography.

Using reverse genetics, we analyzed a chikungunya virus (CHIKV) isolate of the Indian Ocean lineage lacking direct repeat (DR) elements in the 3′ untranslated region, namely DR1a and DR2a. While this deletion mutant CHIKV-∆DR exhibited growth characteristics comparable to the wild-type virus in Baby Hamster Kidney cells, replication of the mutant was reduced in Aedes albopictus C6/36 and Ae. aegypti Aag2 cells. Using oral and intrathoracic infection of mosquitoes, viral infectivity, dissemination, and transmission of CHIKV-∆DR could be shown for the well-known CHIKV vectors Ae. aegypti and Ae. albopictus. Oral infection of Ae. vexans and Culex pipiens mosquitoes with mutant or wild-type CHIKV showed very limited infectivity. Dissemination, transmission, and transmission efficiencies as determined via viral RNA in the saliva were slightly higher in Ae. vexans for the wild-type virus than for CHIKV-∆DR. However, both Ae. vexans and Cx. pipiens allowed efficient viral replication after intrathoracic injection confirming that the midgut barrier is an important determinant for the compromised infectivity after oral infection. Transmission efficiencies were neither significantly different between Ae. vexans and Cx. pipiens nor between wild-type and CHIKV-∆DR. With a combined transmission efficiency of 6%, both Ae. vexans and Cx. pipiens might serve as potential vectors in temperate regions.

Doctor of Philosophy / Department of Plant Pathology / Anna E. Whitfield / Tomato spotted wilt virus (TSWV) is an economically important plant virus dependent on insects (thrips) for transmission to plant hosts. Like many animal-infecting viruses, TSWV replicates in the cells of its insect vector. The virus is an emergent disease threatening food and fiber crops worldwide. The aim of this work was to develop novel control strategies against TSWV through a better understanding of the virus-vector interaction. Previously, the TSWV GN protein was shown to be the viral attachment protein, a molecule mediating attachment of virus particles to the midgut epithelial cells of vector thrips. The specific goals of my research were to further examine the utility of disrupting the virus-vector interaction for effective virus control by exploiting GN properties, and to track the route of TSWV in thrips using confocal microscopy. To achieve these goals, I expressed soluble and insoluble forms of GN fused to green fluorescent protein (GFP) transiently and transgenically and examined their cellular localization in planta. GN::GFP recombinant protein localized to Golgi stacks throughout the cells as indicated by a punctate pattern or co-localization to a Golgi marker. In contrast, the soluble form of GN, GN-S::GFP, localized to the ER and apparently also to the cytoplasm. Virus acquisition and transmission assays with GN-S::GFP transgenic tomato plants demonstrated that transmission of TSWV by F. occidentalis was reduced by 35 to 100%. These results indicated that transgenic expression of GN-S in tomato plants may have the potential to prevent secondary spread of the virus. Novel features of the morphology of principal (PSGs) and tubular salivary glands (TSGs) of the insect vector F. occidentalis and of their infection with TSWV were described. The virus colonized different cell types and regions within the PSGs with variable intensity and distribution; and accumulated at the lumen of individual cells. The TSGs of F. occidentalis are proposed as a route for TSWV infection into the PSGs. The transgenic plants and the new knowledge of the virus vector interaction are promising tools to control TSWV and a model approach for the control of other vector-borne viruses.

Avaliou-se o efeito de Hirsutella thompsonii ao ácaro da leprose dos citros (Brevipalpus phoenicis). Em laboratório, adultos foram mantidos em arenas sobre folhas de citros em placas contendo ágar-água solidificado. Foram avaliadas a patogenicidade e virulência do fungo ao ácaro, bem como sua persistência e compatibilidade com acaricidas. No campo, os ácaros foram confinados em arenas sobre frutos de laranja pré-infestados com adultos, sendo estes mantidos em plantas de citros. O isolado Esalq-1269 de H. thompsonii foi inoculado em populações do ácaro provenientes de diversas regiões do Estado de São Paulo. Para se verificar o efeito combinado da temperatura e umidade relativa do ar, o patógeno foi aplicado e os ácaros mantidos em condições controladas. A eficiência de Esalq-1269 foi comparada com isolados do banco de patógenos do Cenargen/Embrapa, os quais foram identificados. Além destes testes, determinou-se o efeito de Esalq-1269 em ovos de B. phoenicis. As avaliações da virulência e persistência foram realizadas a partir do patógeno produzido em meio de cultura completo e sólido (MC-S); meio completo e líquido (MC-L); arroz pré-cozido (APC) e arroz pré-cozido seco e moído (APC-SM). Nos bioensaios com os acaricidas, determinou-se a compatibilidade com agrotóxicos registrados para B. phoenicis phoenicis em citros. O efeito de sub-concentrações de H. thompsonii e de Propargite (Omite 720 SC) foram avaliadas, isoladamente e em mistura, para o ácaro. Em todos os bioensaios, as suspensões contendo propágulos do fungo foram preparadas em diferentes concentrações e após a pulverização avaliou-se a mortalidade durante quatro dias. No experimento de campo o patógeno foi aplicado em diferentes concentrações. O primeiro experimento constou da testemunha e H. thompsonii produzida em APC (6kg/ha). O segundo experimento constou: testemunha, H. thompsonii produzida em APC (20kg/ha e 10kg/ha) e H. thompsonii produzida em MC-L (5L/ha). As avaliações foram realizadas após 10 e 20 dias das aplicações, verificando a sobrevivência de adultos e o número de ovos e ninfas. Esalq-1269 foi patogênico a adultos de B. phoenicis provenientes de todas as regiões do Estado avaliadas, porém com diferenças quanto suscetibilidade. Todos os isolados testados foram patogênicos a B. phoenicis, sendo Esalq-1269 o mais virulento. Nos testes de temperatura x umidade, observou-se que Esalq-1269 apresentou alta atividade a 30°C, independentemente da umidade relativa. Porém, baixas temperaturas prejudicaram o desenvolvimento da doença. O patógeno não apresentou efeito em ovos do ácaro. Nos testes de virulência, a menor CL25 obtida foi para o fungo produzido em MC-S (1,9x105con/mL), já as CL25 para o patógeno produzido em APC e APCSM foram semelhantes. O fungo produzido em MC-L foi o que apresentou maior persistência em relação aos demais, sendo capaz de causar mortalidade devido ao efeito indireto. Quanto à toxicidade, a exceção de Dicofol e Cihexatina, todos os acaricidas foram compatíveis com o fungo. Observou-se efeito sinérgico entre a mistura patógeno x propargite, com alta mortalidade de B. phoenicis em sub-concentrações. Em campo, houve diferenças dos tratamentos com o fungo em relação à testemunha, havendo redução no número de adultos e de ovos. / This study aimed to evaluate the effect of Hirsutella thompsonii on the false spider mite (Brevipalpus phoenicis). In laboratory bioassays, adults were confined to arenas prepared with citrus leaves in acrylic dishes containing water-agar. The pathogenicity and virulence of the fungus against B. phoenicis adults, the persistence in citrus leaves and the compatibility with acaricides were studied. Adults were maintained in arenas prepared with fruits which were placed in plants in the field. The H. thompsonii isolate Esalq-1269 was inoculated on mite populations from different regions of São Paulo state. Also, the combined effect of temperature and humidity was measured on the fungus performance when mites were maintained in controlled conditions. The efficiency of Esalq-1269 was compared to isolates from Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Besides these bioassays, the effect of Esalq-1269 isolate in eggs of B. phoenicis was determined. The virulence and persistence tests were conducted using the fungi produced on complete solid culture medium (MC-S); complete liquid culture medium (MC-L); rice (APC) and rice powder (APC-SM). Compatibility of acaricides registered for B. phoenicis control with Esalq-1269 was evaluated and the combined effect of Propagite (Omite 720 SC) with sub-doses of H. thompsonii was determined. Mortality of mites was observed during four days after application of conidial suspensions. In field tests, the pathogen was applied in different concentrations. In the first assay, fungi were produced in APC (6kg/ha). In the second test, three treatments were applied: H. thompsonii cultured on rice (APC) at two concentrations (20Kg/ha and 10 Kg/ha) and H. thompsonii produced by liquid fermentation (MC-L) (5L/ha). Observations were performed after 10 and 20 days after application and adult survival, number of eggs and nymphs per fruit were observed. The isolate Esalq-1269 caused high mortality in all populations of B. phoenicis tested. Also, this strain was the most virulent against the mite and it was negatively affected by low temperatures. At 30°C, high mortality of adults was observed regardless of humidity levels. B. phoenicis was not pathogenic to eggs of B. phoencis . The lowest LC25 value calculated was from pathogen produced in MC-S (1,9x105 conidia/mL). The LC25 values calculated to APC and ACP-SM did not differ statistically. The pathogen produced by liquid fermentation was the most persistent in citrus leaves, causing higher levels of adult mortality. The acaricides Dicofol and Cyhexatin were toxic to Esalq-1269. Synergism between Propargite and H. thompsonii was observed resulting in high adult mortality under low concentrations. In field, results showed differences on concentration and time to death between treatments and control. Field applications resulted in reduction of adult and eggs.

Vários fitovírus são capazes de influenciar o comportamento e desenvolvimento biológico de seus insetos vetores de modo a favorecer sua disseminação entre plantas hospedeiras, mas pouco se sabe a respeito dos efeitos de infecções virais sobre moscas-brancas Bemisia tabaci (Genn.), uma vez que se trata de um complexo de espécies, que transmite vírus de diferentes gêneros com distintos modos de transmissão. Considerando-se a importância de B. tabaci como praga e vetora e o grande prejuízo causado a diversos cultivos devido à transmissão de fitovírus, o presente trabalho teve como objetivos: a) Investigar a preferência para pouso e o comportamento arrestante de B. tabaci MEAM 1 (Middle East-Asia Minor 1) em plantas de tomate não infectadas e infectadas com o crinivírus Tomato chlorosis virus (ToCV) transmitido de modo semipersistente, e o begomovírus persistente-circulativo, Tomato severe rugose virus (ToSRV); b) Avaliar os efeitos diretos e indiretos de ToCV sobre o desempenho biológico de B. tabaci MEAM 1 c) Comparar o comportamento alimentar de adultos não-virulíferos de B. tabaci MEAM 1 em plantas de tomate não infectadas e infectadas com ToCV ou ToSRV, utilizando-se a técnica de Electrical Penetration Graph (EPG); d) Correlacionar as atividades estiletares de B. tabaci MED (Mediterranean) com a inoculação de ToCV em tomateiro. Verificou-se que plantas infectadas com ToCV não exercem atração sobre B. tabaci MEAM 1; há efeito direto quando o inseto está virulífero; no entanto, este efeito não parece favorecer a disseminação de ToCV. Já ToSRV exerce efeito direto que favorece sua disseminação, pois insetos virulíferos são mais atraídos por plantas não infectadas. A mosca-branca exibe comportamento arrestante em plantas de tomate sadias, e tende a deixar plantas infectadas com ToCV ou ToSRV, sugerindo que tais vírus reduzem a qualidade nutricional da planta hospedeira. Em relação ao desenvolvimento biológico do inseto, observou-se efeito direto de ToCV apenas de alongamento da duração do primeiro ínstar ninfal, e efeito indireto negativo sobre a viabilidade da fase ninfal, pois apenas 32% das ninfas eclodidas chegaram à fase adulta em plantas infectadas, contrastando com 77% em plantas não infectadas. Nos ensaios de EPG, verificou-se que a infecção de plantas de tomate por ToCV ou ToSRV não influenciou o comportamento alimentar do vetor de modo a favorecer a transmissão desses vírus, pois afetou apenas parâmetros não relacionados às atividades floemáticas. A transmissão de ToCV está principalmente associada à salivação nos elementos de floema (forma de onda E1) (52,2% de plantas infectadas), mas pode ocorrer com baixa frequência antes de E1 (3,5%). Entretanto, há maior eficiência de transmissão quando os indivíduos realizam vários episódios de E1+E2 (ingestão de seiva nos vasos do floema). Os dados obtidos na presente tese ajudam a esclarecer um pouco mais as complexas relações entre B. tabaci e diferentes fitovírus, e como as respostas comportamentais podem variar em função do modo de transmissão. / Several phytoviruses are capable of influencing the behavior and biological development of their insect vectors in order to promote their spread among host plants, but information about the effects of viral infections on whiteflies Bemisia tabaci (Genn.) is not available, since it is a species complex, which transmits vírus belonging to different genus with distinct transmission modes. Considering B. tabaci importance as a pest and a vector and the great damage caused to several crops due to the transmission of phytovirus, the present work had as objectives: a) To investigate the preference for landing and the arrestant behavior of B. tabaci MEAM 1 (Middle East-Asia Minor 1) in non-infected and infected tomato plants with semi-persistent crinivirus, Tomato chlorosis virus (ToCV) and the persistent-circulative begomovirus, Tomato severe rugose virus (ToSRV); b) To evaluate the direct and indirect effects of ToCV on the biological performance of B. tabaci MEAM 1 c) To compare the feeding behavior of non-viruliferous B. tabaci MEAM 1 in non-infected and ToCV or ToSRV-infected tomato plants using the Electrical Penetration Graph (EPG) technique; d) Correlate the stylets activities of B. tabaci MED (Mediterranean) with the inoculation of ToCV in tomato. It has been found that ToCV-infected plants do not exert an attraction on B. tabaci MEAM 1; there is a direct effect when the insect is viruliferous, however, this effect does not seem to favor the spread of ToCV. ToSRV has a direct effect that favors its dissemination, as viruliferous insects are more attracted to non-infected plants. The whitefly exhibits an arrestment behavior on non-infected plants, and tends to leave plants infected by ToCV or ToSRV, suggesting that such viruses reduce the nutritional quality of the host plant. In relation to the biological development, we observed a direct effect of ToCV only on the first ninfal instar, and a negative indirect effect on nymphal viability, since only 32% of the initial individuals reached adulthood in ToCV-infected plants contrasting with 77% in non-infected plants. In the EPG tests, it was verified that the infection of tomato plants by ToCV or ToSRV did not influence the feeding behavior of the vector in order to favor the transmission of these viruses, since it affected only parameters not related to the phloem. The transmission of ToCV is mainly associated to salivation in the phloem elements (waveform E1) (52,2% of infected plants), but may occur in a low proportion before E1 (3,5%). However, there is a greater efficiency of transmission when individuals perform several episodes of E1 + E2 (phloem sieve elements). The data obtained in this thesis help to clarify a little more about the complex relationships between B.tabaci and different phytovirus, and how the behavioral responses may vary depending on the mode of transmission.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-17T12:01:04Z No. of bitstreams: 1 Frank Magno da Costa.pdf: 2036897 bytes, checksum: 7498ff1cf68c11e56e2e3d7ce12c8e57 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-17T12:01:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Frank Magno da Costa.pdf: 2036897 bytes, checksum: 7498ff1cf68c11e56e2e3d7ce12c8e57 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brevipalpus mites are vectors of several plant viruses called Brevipalpus transmitted virus –BrTV. Among these, Citrus leprosis virus C (CiLV-C) and Coffee ringspot virus (CoRSV) are important due to the damages caused in Citrus spp. and Coffea spp., respectively. The symptoms occur as localized infection on both leaves and fruits. The interactions between vector and virus are of particular interest both from the scientific perspective and on the development of control measures. However, for these and other BrTV, the mode interactions are still unknown. Preliminary study suggests that CoRSV replicates in the vector tissue, while CiLV-C is mode circulates manner. The aim of this study was to investigate the interactions established between CiLV-C and CoRSV with B. phoenicis. Adult females aviruliferous of B. phoenicis were submitted to acquisition access period of respective virus during five days. After this time they were transferred to hosts (treatments): mungbean (Canavalia ensiformis, non-host of the virus), symptomatic and healthy (citrus and coffee plants) and collected after four different periods of time: 0; 7; 14 and 21 days. The interactions were investigated by real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR), transmission electron microscopy (TEM) and transmission assays. The qPCR revealed that there was no increase in viral load over time in all treatments for any of the virus in question. The TEM, it was not possible to detect particles of CiLV-C or CoRSV. CiLV-C transmission rate was 83, 75% and 58% for the treatments symptomatic citrus, mungbean and healthy citrus, respectively. The first symptoms of the leprosis were observed after 30±5 days after mites infestation. In the CoRSV transmission assays no symptoms of coffee ringspot were observed during a period of six months. These results suggest that a long incubation period was be necessary before CoRSV transmission by the vector. By the CiLV-C the results indicate that interaction type virus-vector is of the circulative mode. / Ácaros Brevipalpus são vetores de inúmeros vírus, comumente chamados de vírus transmitidos por Brevipalpus- VTB. Dentre esses, o vírus da leprose dos citros (Citrus leprosis virus C, CiLV-C) e o vírus da mancha anular do cafeeiro (Coffee ringspot virus - CoRSV) são importantes devido aos danos que causam em Citrus spp. e Coffea spp., respectivamente. Os sintomas ocorrem de maneira localizada em folhas e frutos. As interações entre os vírus e seus vetores apresentam particular interesse, tanto do ponto de vista científico quanto no desenvolvimento de novas abordagens para o controle das doenças por eles causadas. Entretanto, para esses e outros VTB, as interações são ainda pouco conhecidas. Estudos preliminares sugerem que o CoRSV se replica no interior do ácaro vetor, enquanto o CiLV-C apenas circula. O objetivo deste trabalho foi investigar os tipos de interações estabelecidas entre o CiLV-C e o CoRSV com B. phoenicis. Fêmeas adultas de B. phoenicis avirulíferas foram submetidas a um período de acesso para aquisição dos respectivos vírus durante cinco dias. Após esse tempo foram transferidas para hospedeiros (tratamentos): feijão-de-porco (não hospedeira dos vírus), plantas suscetíveis, sintomáticas e/ou sadias (laranja doce e cafeeiro) e coletadas após quatro diferentes períodos de tempo: 0; 7; 14 e 21 dias. As interações foram investigadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e testes de transmissão. A qPCR revelou que não houve aumento da carga viral ao longo do tempo em nenhum dos tratamentos avaliados para nenhum dos vírus em questão. A MET não detectou partículas de CiLV-C e CoRSV. A taxa de transmissão do CiLV-C foi de 83; 75 e 58% para os tratamentos frutos de laranja sintomáticos, feijão-de-porco e frutos de laranja sadio, respectivamente. Os primeiros sintomas de leprose dos citros foram observados após 30±5 dias após a infestação dos ácaros. Nos testes de transmissão de CoRSV nenhum sintoma da mancha anular foi observado durante um período de seis meses. Estes resultados indicam a necessidade de longo período é necessário antes da transmissão do CoRSV pelo vetor. Para o CiLV-C os resultados indicam que o tipo de interação vírus-vetor é persistente circulativa.