Lors d’une infection par un pathogène, des lymphocytes T CD8+ naïfs (LTn) spécifiques de l’antigène sont activés, prolifèrent et se différencient en LT effecteurs (LTe). Les LTe produisent différentes cytokines et acquièrent une activité cytotoxique menant à l’élimination du pathogène. Seulement 5 à 10 % des LTe survivront et se différencieront en LT mémoires (LTm), qui sont capables de répondre plus rapidement lors d’une seconde infection par le même pathogène, contribuant au succès de la vaccination. Toutefois, la compréhension de l’ensemble des mécanismes régulant le développement des LTe et des LTm demeure incomplète. Afin de mieux comprendre les signaux requis pour la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immune, nous avons posé deux hypothèses. Nous avons d’abord proposé que différentes cellules présentatrices d’antigène (CPA) fournissent différents signaux au moment de la reconnaissance antigénique influençant ainsi le devenir des LT CD8+. Vu leur potentiel d’utilisation en immunothérapie, nous avons comparé la capacité d’activation des LT CD8+ par les lymphocytes B activés via le CD40 (CD40-B) et les cellules dendritiques (CD). Nous avons montré que l’immunisation avec des CD40-B induit une réponse effectrice mais, contrairement à l’immunisation avec des CD, pratiquement aucun LTm n’est généré. Les LTe générés sont fonctionnels puisqu’ils sécrètent des cytokines, ont une activité cytotoxique et contrôlent une infection avec Listeria monocytogenes (Lm). Nous proposons qu’une sécrétion plus faible de cytokines par les CD40 B ainsi qu’une interaction plus courte et moins intime avec les LT CD8+ comparativement aux CD contribuent au défaut de différenciation des LTm observé lors de la vaccination avec les CD40-B. Ensuite, nous posé l’hypothèse que, parmi les signaux fournis par les CPA au moment de la reconnaissance antigénique, la voie de signalisation Notch influence le développement des LTe, mais aussi des LTm CD8+ en instaurant un programme génétique particulier. D’abord, grâce à un système in vitro, le rôle de la signalisation Notch dans les moments précoces suivant l’activation du LT CD8+ a été étudié. Ce système nous a permis de démontrer que la voie de signalisation Notch régule directement l’expression de la molécule PD-1. Ensuite, grâce à des souris où il y a délétion des récepteurs Notch1 et Notch2 seulement chez les LT CD8+ matures, un rôle de la voie de signalisation Notch dans la réponse immune des LT CD8+ a été démontré. Nos résultats démontrent que suite à une infection avec Lm ou à une immunisation avec des CD, la signalisation Notch favorise le développement de LTe, exprimant fortement KLRG1 et faiblement CD127, destinés à mourir par apoptose. Toutefois, la signalisation Notch n’a pas influencé la génération de LTm. De façon très intéressante, l’expression des récepteurs Notch influence la production d’IFN- en fonction du contexte d’activation. En effet, suite à une infection avec Lm, l’absence des récepteurs Notch n’affecte pas la production d’IFN- par les LTe, alors qu’elle est diminuée suite à une immunisation avec des CD suggérant un rôle dépendant du contexte pour la voie de signalisation Notch. Nos résultats permettent une meilleure compréhension des signaux fournis par les différentes CPA et de la voie de signalisation Notch, donc des mécanismes moléculaires régulant la différenciation des LT CD8+ lors de la réponse immunitaire, ce qui pourrait ultimement permettre d’améliorer les stratégies de vaccination. / Following an infection with a pathogen, antigen-specific naive CD8+ T lymphocytes (Tn) will proliferate and differentiate into effector (Te) cells. Those Te cells will produce different cytokines and acquire a cytotoxic activity, leading to pathogen clearance. Only 5 to 10 % of Te cells will survive and differentiate into memory CD8+ T lymphocytes (Tm) able to respond rapidly following a second encounter with the same pathogen, contributing to the success of vaccination. However, the mechanisms regulating Te and Tm cells development remain incompletely understood. To better understand the signals required for CD8+ T lymphocytes during an immune response, we proposed two hypotheses. First, we propose that different antigen presenting cells (APCs) can deliver different signals to CD8+ T lymphocytes at the time of priming leading to different outcome. Given their potential for use in immunotherapy, we compared the ability of CD40 activated B lymphocytes (CD40-B) and dendritic cells (DCs) to activate CD8+ T lymphocytes. We have shown that CD40-B cell immunisation leads to an effector response but very few Tm cells are generated compared to DC immunisation. The Te cells generated following CD40-B cell immunisation are functional because they secrete cytokine, are cytotoxic and control a Listeria monocytogenes (Lm) infection. We propose that CD40-B cells secrete less cytokines and interact during shorter period of time with the CD8+ T lymphocytes, without engulfment, contributing to the decreased Tm generation observed following immunisation with CD40-B cells. Second, among the signals provided by APC at the time of CD8+ T lymphocyte priming, we have hypothesised that the Notch signalling pathway influences Te and Tm cell differentiation by inducing a particular genetic program. Using an in vitro system, we first studied the role of the Notch signalling pathway in the hours following CD8+ T lymphocyte priming. We demonstrated that Notch signalling directly regulates PD-1 expression. Then, studying mice where Notch1 and Notch2 receptor genes are deleted only in mature CD8+ T lymphocytes, we characterised the role of the Notch signalling pathway on Te and Tm differentiation during an immune response. Our results show that following Lm infection or a DC immunisation, the Notch signalling pathway promotes the differentiation of short lived effector cells Te cells (KLRG1highCD127low) meant to die by apoptosis. However, the Notch signalling pathway did not influence the generation of CD8+ Tm cells. Most interestingly, IFN- regulation by the Notch signalling pathway depends on the activation context. Indeed, following Lm infection, lack of Notch receptors does not impact IFN- secretion by Te cells while it is significantly decreased following a DC immunisation suggesting a context dependant role for the Notch signalling pathway. Our findings provide a better understanding of the key signals provided by APC as well as the Notch signalling pathway, and thus the molecular mechanisms leading to CD8+ lymphocyte effector and memory generation which is crucial as this knowledge may ultimately lead to improved vaccination.

De nombreuses études ont montré que l'exposition de cultures cellulaires à des particules α conduit à des changements biologiques importants autant dans les cellules irradiées que dans les cellules bystander non-irradiées. L'étude des réponses biologiques non-ciblées dans des cultures cellulaires exposées à de faibles fluences d’ions lourds permet d’estimer les risques pour la santé du rayonnement spatial et de la radiothérapie. Nous avons caractérisé les mécanismes sous-jacents de l'induction d'effets stressants dans des cultures confluentes de fibroblastes normaux humains exposés à de faibles fluences d’ions fer de 1000 MeV/u (transfert d'énergie linéique (TEL) ~151 keV/µm), d’ions silicium de 600 MeV/u (TEL ~50 keV/µm) ou d’ions carbone de 290 MeV/u (TEL ~13 keV/µm). Nous avons comparé ces résultats avec ceux obtenus dans des cultures cellulaires exposées, en parallèle, à de faibles fluences de particules α de 0,92 MeV/u (TEL ~109 keV/µm). L'induction de dommages à l'ADN, les changements dans l'expression des gènes, la carbonylation des protéines et la peroxydation lipidique durant les 24 h suivant l'exposition de cultures confluentes à de faibles doses (0,2 cGy et plus) d’ions fer ou d'ions silicium ont très largement contribué à la propagation d’effets stressants des cellules irradiées aux cellules bystander non-irradiées. Pour une dose moyenne de 0,2 cGy, seules ~1 et 3 % des cellules seraient irradiées dans le noyau par un ion, respectivement, fer ou silicium. Les immunoblots ont révélés des augmentations significatives des niveaux de phospho-TP53 (sérine 15), p21Waf1 (CDKN1A), HDM2, phospho-ERK1/2, de carbonylation des protéines et de peroxydation lipidique dans les 24 h suivant l’exposition. L'ampleur de ces réponses suggère la participation de cellules non ciblées dans les effets observés. De plus, lorsque les populations cellulaires irradiées ont été ré-ensemencées dans un milieu de culture frais peu après l'irradiation, les niveaux de ces marqueurs ont aussi augmentés durant 24 h. Ensemble, ces résultats montrent un effet rapidement propagé et persistant. Des analyses in situ réalisées dans des cultures cellulaires confluentes ont montré que la formation de foyers de la protéine 53BP1, marqueur de dommages à l'ADN, touchait un nombre de cellules plus important que celui auguré par la fraction de cellules traversées dans le noyau par un ion fer ou silicium. Cet effet est exprimé dès 15 min suivant l'exposition, atteint son maximum 1 h après l’exposition puis diminue jusqu’à 24 h. Une tendance similaire s'est produite après exposition à une dose moyenne absorbée de 0,2 cGy de particules α de 3,7 MeV, mais non après 0,2 cGy d’ions carbone de 290 MeV/u.Des analyses utilisant des puits de cultures intégrant une fine épaisseur de CR-39, détecteur solide de traces nucléaires, et permettant ainsi l’identification des cellules irradiées aux ions fer ou silicium, confirment la participation de cellules bystander dans la réponse au stress. Des études mécanistiques ont, de plus, indiqué que les jonctions gap permettant la communication intercellulaire, certaines voies de la réparation de l’ADN, ainsi que le métabolisme oxydatif participent à la propagation des effets non ciblés induit par des radiations de haut TEL. Nous avons également examiné la contribution possible des particules secondaires produites le long des traces d’ions primaires dans les réponses biologiques. Les simulations réalisées avec le code de transport de particules FLUKA ont révélé que la dose due aux produits de fragmentation, autres que les électrons, est inférieure à 1 % de la dose absorbée dans les cultures cellulaires exposées à des ions lourds. De plus, la dose radiale des ions lourds secondaires est limitée à ~10-20 µm autour de l’ion primaire. Ainsi, ces derniers sont peu susceptibles de contribuer de manière significative à la réponse biologique observée dans des cellules non ciblées par des ions lourds primaires / Widespread evidence indicates that exposure of cell cultures to α particles results in significant biological changes in both the irradiated and non-irradiated bystander cells in the population. The induction of non-targeted biological responses in cell cultures exposed to low fluences of high charge (Z) and high energy (E) particles is relevant to estimates of the health risks of space radiation and to radiotherapy. Here, we investigated the mechanisms underlying the induction of stressful effects in confluent normal human fibroblast cultures exposed to low fluences of 1000 MeV/u iron ions (linear energy transfer (LET) ~151 keV/µm), 600 MeV/u silicon ions (LET ~50 keV/µm) or 290 MeV/u carbon ions (LET ~13 keV/µm). We compared the results with those obtained in cell cultures exposed, in parallel, to low fluences of 0.92 MeV/u α particles (LET ~109 keV/µm).Induction of DNA damage, changes in gene expression, protein carbonylation and lipid peroxidation during 24 h after exposure of confluent cultures to mean doses as low as 0.2 cGy of iron or silicon ions strongly supported the propagation of stressful effects from irradiated to bystander cells. At a mean dose of 0.2 cGy, only ~1 and 3 % of the cells would be targeted through the nucleus by an iron or silicon ion, respectively. Within 24 h post-irradiation, immunoblot analyses revealed significant increases in the levels of phospho-TP53 (serine 15), p21Waf1 (also known as CDKN1A), HDM2, phospho-ERK1/2, protein carbonylation and lipid peroxidation. The magnitude of the responses suggested participation of non-targeted cells in the response. Furthermore, when the irradiated cell populations were subcultured in fresh medium shortly after irradiation, greater than expected increases in the levels of these markers were also observed during 24 h. Together, the results imply a rapidly propagated and persistent bystander effect. In situ analyses in confluent cultures showed 53BP1 foci formation, a marker of DNA damage, in more cells than expected based on the fraction of cells traversed through the nucleus by an iron or silicon ion. The effect was expressed as early as 15 min after exposure, peaked at 1 h and decreased by 24 h. A similar tendency occurred after exposure to a mean absorbed dose of 0.2 cGy of 3.7 MeV α particles, but not after 0.2 cGy of 290 MeV/u carbon ions.Analyses in dishes that incorporate a CR-39 solid state nuclear track detector bottom identified the cells irradiated with iron or silicon ions and further supported the participation of bystander cells in the stress response. Mechanistic studies indicated that gap junction intercellular communication, DNA repair, and oxidative metabolism participate in the propagation of the induced effects.We also considered the possible contribution of secondary particles produced along the primary particle tracks to the biological responses. Simulations with the FLUKA multi-particle transport code revealed that fragmentation products, other than electrons, in cells cultures exposed to HZE particles comprise <1 % of the absorbed dose. Further, the radial spread of dose due to secondary heavy ion fragments is confined to approximately 10-20 µm Thus, the latter are unlikely to significantly contribute to the stressful effects in cells not targeted by primary HZE particles.

L’échec thérapeutique des maladies cérébrales est lié, entre autres, à la présence de barrières entre le sang et le Système Nerveux Central (SNC), en particulier la Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). La BHE est une structure neuro-vasculaire localisée au niveau des MicroVaisseaux Cérébraux (MVC) limitant l’entrée des molécules thérapeutiques dans le cerveau. Ce rôle barrière est dû à plusieurs facteurs, dont principalement, l’existence du côté luminal et/ou abluminal de la BHE de plusieurs transporteurs d’efflux, dont les transporteurs de type ABC (ATP Binding Casette) et SLC (SoLute Carrier) et qui sont à l’origine des phénomènes de résistance aux médicaments. Les études de recherche actuelles visent à identifier les voies de signalisation régulant l’activité de ces protéines d’efflux afin d’optimiser la pharmacothérapie cérébrale. Mais la majorité de ces études sont effectuées chez l’adulte. Très peu de données existent chez l’enfant.Cette étude a été réalisé dans la perspective de 1) Etudier l’ontogenèse des transporteurs ABC et SLC de la BHE au cours de la maturation cérébrale, 2) Elucider le rôle fonctionnel de quatre transporteurs d’efflux ((P-glycoproteine (P-gp), Breast Cancer Resistance Protein (bcrp), Organic Anion Transporter 3 (oat3), and Transporting Peptide 1a4 (oatp1a4) transporters) dans le cerveau des enfants et 3) Elucider les mécanismes qui régulent leur expression fonctionnelle dans des conditions normales et pathologiques, notamment inflammatoires, parce que des modifications dans les composantes structurales et fonctionnelles de l'unité neurovasculaire ont été rapportées dans une longue liste de pathologies du SNC chez les enfants et les adultes. Nos résultats ont montré l’existence de différences fonctionnelles, en terme de passage de molécules, entre la BHE pédiatrique et celle adulte. De plus, cette étude a mis en évidence une régulation différentielle liée à l'âge des transporteurs d'efflux de médicaments de la barrière dans des conditions normales et inflammatoires.Ces résultats fournissent des preuves sur l’intérêt de prendre en compte les propriétés spécifiques de la BHE pédiatrique et la distinguer de la BHE adulte lors des définitions des stratégies thérapeutiques destinées à traiter les maladies cérébrales chez les enfants. / One major reason of CNS pharmacotherapy’s impediment is the existence of “barriers” between blood and CNS, especially the Blood-Brain Barrier (BBB), a neurovascular structure localized at the level of brain microvasculature. Main factors responsible for this barrier function are drug efflux transporters type ABC (ATP-Binding Cassette) and SLC (SoLute Carrier) expressed at BBB level and known to be at the origin of multi-drug resistance phenomenon. Recent researches aim at unraveling the signaling mechanisms regulating these transporters in order to modulate their activity and improve pharmacotherapy in brain diseases. For years, these transporters have been studied in adult organism. But, there is a wide spread belief that the BBB in embryo, fetus, new born and infant is “immature”, implying caution in giving drugs to infants. However, current knowledge on the functional status of the BBB in immature organism remains very limited.This study was performed in the aim of understanding: 1) The ontogenesis of ABC and SLC transporters during brain maturation, 2) the functional role of four BBB drug efflux transporters (P-glycoprotein (P-gp), Breast Cancer Resistance Protein (bcrp), Organic Anion Transporter 3 (oat3), and Transporting Peptide 1a4 (oatp1a4) transporters) in children’s brain, and 3) the mechanisms that regulate their functional expression under normal and pathological conditions, mostly under inflammatory conditions, because indeed alterations in structural and functional components of the BBB have been reported in a long list of CNS pathologies in adults. Our results showed changing properties of the BBB during ontogenesis, as well as an age-related differential regulation of BBB drug efflux transporters under normal and inflammatory conditions.These findings highlight the importance of considering an age-related response of CNS to drugs and of taking into account the specific properties of juvenile BBB during definition of therapeutic strategies designed to treat childhood brain diseases, and this in the clinical perspective of developing new drugs with enhanced efficacy in children’s CNS.

La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le système nerveux central (SNC) en contrôlant le passage des substances sanguines et des cellules immunitaires. La BHE est formée de cellules endothéliales liées ensemble par des jonctions serrées et ses fonctions sont maintenues par des astrocytes, celles ci sécrétant un nombre de facteurs essentiels. Une analyse protéomique de radeaux lipidiques de cellules endothéliales de la BHE humaine a identifié la présence de la voie de signalisation Hedgehog (Hh), une voie souvent liées à des processus de développement embryologique ainsi qu’au niveau des tissus adultes. Suite à nos expériences, j’ai déterminé que les astrocytes produisent et secrètent le ligand Sonic Hh (Shh) et que les cellules endothéliales humaines en cultures primaires expriment le récepteur Patched (Ptch)-1, le co-récepteur Smoothened (Smo) et le facteur de transcription Gli-1. De plus, l’activation de la voie Hh augmente l’étanchéité des cellules endothéliales de la BHE in vitro. Le blocage de l’activation de la voie Hh en utilisant l’antagoniste cyclopamine ainsi qu’en utilisant des souris Shh déficientes (-/-) diminue l’expression des protéines de jonctions serrées, claudin-5, occcludin, et ZO-1. La voie de signalisation s’est aussi montrée comme étant immunomodulatoire, puisque l’activation de la voie dans les cellules endothéliales de la BHE diminue l’expression de surface des molécules d’adhésion ICAM-1 et VCAM-1, ainsi que la sécrétion des chimiokines pro-inflammatoires IL-8/CXCL8 et MCP-1/CCL2, créant une diminution de la migration des lymphocytes CD4+ à travers une monocouche de cellules endothéliales de la BHE. Des traitements avec des cytokines pro-inflammatoires TNF-α and IFN-γ in vitro, augmente la production de Shh par les astrocytes ainsi que l’expression de surface de Ptch-1 et de Smo. Dans des lésions actives de la sclérose en plaques (SEP), où la BHE est plus perméable, les astrocytes hypertrophiques augmentent leur expression de Shh. Par contre, les cellules endothéliales de la BHE n’augmentent pas leur expression de Ptch-1 ou Smo, suggérant une dysfonction dans la voie de signalisation Hh. Ces résultats montrent que la voie de signalisation Hh promeut les propriétés de la BHE, et qu’un environnement d’inflammation pourrait potentiellement dérégler la BHE en affectant la voie de signalisation Hh des cellules endothéliales. / The blood-brain barrier (BBB), composed of tightly bound endothelial cells (ECs), regulates the entry of blood-borne molecules and immune cells into the CNS. Recent studies indicate that the Hedgehog (Hh) signaling pathway in adult tissues plays an important role in vascular proliferation, differentiation and tissue repair. Using a lipid membrane raft-based proteomic approach, I have identified the Hedgehog (Hh) pathway as a signaling cascade involved in preserving and upkeeping BBB functions. My study shows that human astrocytes express and secrete Sonic Hh (Shh) and conversely, that human BBB-ECs bear the Hh receptor Patched-1 (Ptch-1), the signal transducer Smoothened (Smo) as well as transcription factors of the Gli family. Furthermore, activation of the Hh pathway in BBB-ECs restricts the passage of soluble tracers in vitro. By blocking the Hh signaling in vitro and by using Shh knock-out (-/-) embryonic mice, I demonstrate a reduced expression of TJ molecules claudin-5, occludin and ZO-1. Hh activation also decreases the surface expression of cell adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1, and decreases BBB-ECs secretion of pro-inflammatory chemokines IL-8/CXCL8 and monocytes chemoattractant protein 1 MCP-1/CCL2, resulting in a reduction of migrating CD4+ lymphocytes across human BBB-EC monolayers. In vitro treatment with inflammatory cytokines TNF-α and IFN-γ, upregulates the production of astrocytic Shh and the BBB-EC surface expression of Ptch-1 and Smo. In active Multiple Sclerosis (MS) lesions, in which the BBB is disrupted, Shh expression is drastically upregulated in hypertrophic astrocytes, while Ptch-1 and Smo expression is down-regulated or left unchanged, suggesting that a deregulation in the Hh signaling pathway may prevent the barrier stabilizing properties of Hh. Our data demonstrate an anti-inflammatory and BBB-promoting effect of astrocyte-secreted Hh and suggest that a pro-inflammatory environment disrupt the BBB by impacting, at least in part, on Hh signaling in brain ECs.

Les lésions surrénaliennes surviennent dans la population générale à une fréquence d’environ 2-3%. Parmi les anomalies génétiques identifiées jusqu’à présent dans les tumeurs surrénaliennes, les mutations somatiques de β-caténine sont les plus prévalentes. Elles sont présentes dans environ 20% des adénomes et carcinomes cortico-surrénaliens. β-caténine est l’élément central de la voie canonique de WNT qui joue un rôle crucial dans le développement embryonnaire, l’homéostase et la tumourigenèse. Les mutations activatrices de β-caténine conduisent à l’accumulation nucléaire de β- caténine qui interagit avec les TCF/LEF-1 qui active la transcription des gènes cibles. Les gènes cibles de β-caténine, varient et dépendent du contexte cellulaire. Dans la glande surrénale, les gènes cibles de β-caténine sont inconnus. Nous avons effectué des études de microarray qui nous ont permis d’identifier 490 transcrits dérégulés dans les adénomes corticosurrénaliens porteurs de mutations ponctuelles de β-caténine. L’expression aberrante d’ISM1, RALBP1, PDE2A, CDH12, ENC1, PHYHIP et CITED2 dans les adénomes porteurs de mutations de β-caténine a été confirmée par PCR en temps réel. Le traitement des cellules humaines de carcinome cortico-surrénalien H295R (mutation de CTNNB1, Ser45Prol) avec les inhibiteurs de β-caténine/TCF (PKF115-584 et PNU74654) ont confirmé l'implication de β-caténine dans la régulation transcriptionelle d’ISM1, RALBP1, PDE2A, ENC1 et CITED2. En conclusion, nos travaux ont conduit à l’identification de nouveaux gènes cibles de β-catenin impliqués dans la tumourigenèse cortico-surrénalienne. / Adrenal lesions occur in the general population at a prevalence of about 2-3%. Several mutations have been identified in adrenocortical tumours. β-catenin mutations were recently found to be the most frequent genetic alteration in both sporadic adrenocortical adenomas and carcinomas (20-30%). β-catenin is the central player in canonical Wnt signaling which plays a key role in organ/ gland development, maintenance of homeostasis and tumourigenesis. Activation of Wnt signaling by altered regulation of β-catenin levels evokes -catenin accumulation in the nucleus, and interaction with the TCF/LEF-1 proteins that activates the transcription of target genes. These target genes are believed to be highly cell and context specific and are linked to developmental and cell cycling functions. β-catenin target genes in adrenocortical tumours are unknown. Using microarray technology, we found 490 transcripts that are deregulated in adrenocortical adenomas harbouring β-catenin activating mutations in comparison to non mutated adenomas and normal adrenal glands. These genes differ highly in function and many are poorly characterized genes. Differential expression of ISM1, RALBP1, PDE2A, CDH12, ENC1, PHYHIP and CITED2 in adenomas with activating β-catenin mutations was confirmed by real-time PCR. Treatment of human adrenocortical carcinoma cells, H295R (CTNNB1 Ser45Prol), with β-catenin/TCF inhibitors (PKF115-584 and PNU74654) further confirmed the implication of β-catenin on the transcriptional regulation of ISM1, RALBP1, PDE2A, ENC1 and CITED2. In conclusion, we have found new potential β-catenin target genes that may be involved in adrenocortical tumourigenesis.

Une dérégulation de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 est observée dans plus de 30% des cancers et des mutations activatrices de RAS sont observées dans 30% à 50% des adénomes colorectaux. À la suite d’une analyse extensive de biopsies de tumeurs colorectales humaines par micromatrices tissulaires (TMA), nous avons observé que 44% des tissus cancéreux exprimaient MEK1/2 phosphorylés, contre 10% des tissus normaux. L'analyse des TMA a également révélé que 79% des tumeurs arboraient un marquage nucléaire de MEK1/2 phosphorylés, contre 4 % pour les tissus normaux. Bien que la voie MEK/ERK1/2 soit fréquemment activée dans les cancers, le rôle précis des isoformes de MEK1 et de MEK2 n'a jamais été clairement établie. De même, l'impact de cette localisation nucléaire aberrante de phospho-MEK1/2, dans l'initiation et la progression des cancers colorectaux, est inconnu. Lors d'un premier projet, nous avons démontré, que l’expression de MEK1 ou MEK2 activé est suffisante pour transformer in vitro des cellules intestinales épithéliales de rat (IEC-6). L'expression des mutants actifs de MEK1 ou MEK2 est suffisante pour induire une dérégulation de la prolifération cellulaire et engendrer la formation d'adénocarcinomes invasifs dans un modèle de greffe orthotopique du côlon chez la souris. Nous avons également démontré que l'inhibition de MEK2 par shRNA supprime complètement la prolifération des lignées humaines de cancer du côlon, alors que la suppression de MEK1 a peu d'effet sur la capacité de prolifération. Le deuxième projet, nous a permis d'observer que l'expression d'un mutant nucléaire de MEK1 dans les cellules IEC-6 transforme drastiquement les cellules. Une augmentation de prolifération, une résistance à l'anoikose, un dérèglement du cycle cellulaire, de l'instabilité chromosomique (CIN), de la tétra/aneuploïdie sont observés. La caractérisation des mécanismes responsables de cette localisation aberrante de MEK1/2 phosphorylés, a permis d'identifier la protéine Sef, un régulateur de la localisation cytoplasmique de MEK/ERK1/2. Nous avons démontré que l'expression d'une forme oncogénique de Ras (H-RasV12) inhibe l'expression de Sef, engendrant alors une accumulation nucléaire de MEK1/2 activés. Plus encore, la réexpression de Sef restaure la localisation cytoplasmique de MEK1/2 et renverse les propriétés tumorigéniques ainsi que l'aneuploïdie induite par Ras activé. Un troisième projet, visant la caractérisation des mécanismes associés à la CIN et à l'aneuploïde engendrés par l'activation aberrante de la voie de Ras-ERK1/2, a permis d'observer que l'hyperactivation de ERK1/2 induit des anomalies mitotiques menant à la binucléation. Une localisation erronée et une surexpression de la kinase Aurora A, de même que des protéines de passage du complexe chromosomique (CPC), Aurora B, Survivine et INCENP, sont observées. L'inhibition partielle de l'activation de ERK1/2 par de faible dose de PD184352, un inhibiteur de MEK1/2, est suffisante pour renverser la surexpression de ces régulateurs mitotiques, de même que corriger les anomalies de la mitose et réduire la tétra/aneuploïdie engendrée par Ras oncogénique. Ainsi, nous avons démontré, pour la première fois, que la voie des MAP kinases ERK1/2 est impliquée dans la CIN, la tétraploïdie et l'aneuploïdie. Nos résultats suggèrent que la perte de Sef est un événement oncogénique précoce, qui contribue à la localisation nucléaire aberrante de MEK1/2 qui est observée dans les tumeurs colorectales. Cette localisation anormale de MEK1/2 est associée à l'initiation de la transformation, la progression tumorale et la CIN, via l'activité soutenue de ERK1/2. Ces informations sont capitales et démontrent l’importance de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 dans le processus de tumorigénèse colorectale. / The Ras-dependent Raf/MEK/ERK1/2 signaling pathway is frequently hyperactivated in human cancer as a result of receptor tyrosine kinase overexpression or gain-of-function mutations in RAS or RAF genes. More specificaly, activating mutation in RAS genes are found in ~ 30-50% of colorectal adenomas and phosphorylation of ERK1/2 is frequently observed in human colorectal cancer cells and tumor specimens. In a large TMA analysis, we found that MEK1/MEK2 are aberrantly activated in 44% of human colorectal cancers. In addition, our analysis revealed that 79% of colorectal cancers exhibit aberrant phospho-MEK1/2 staining in the nucleus, as compared to 4% of normal tissue. How dysregulation and mislocalization of MEK1/2 contribute to tumor initiation and progression is not well understood. In order to determine the exact contribution of MEK1 and MEK2 to the pathogenesis of colorectal cancer, wild type and constitutively active forms of MEK1 and MEK2 were ectopically expressed by retroviral gene transfer in the normal intestinal epithelial cell line IEC-6. We found that the expression of activated MEK1 or MEK2 is sufficient to morphologically transform intestinal epithelial cells, dysregulate cell proliferation and induce the formation of high-grade adenocarcinomas after orthotopic transplantation in mice. A large proportion of these intestinal tumors metastasize to the liver and lung. Importantly, we show that silencing of MEK2 expression completely suppresses the proliferation of human colon carcinoma cell lines, whereas inactivation of MEK1 has a much weaker effect. In a second project, we have investigated the impact of the nuclear mislocalization of phosphorylated MEK1/2 observed in colorectal tumors. We show that oncogenic activation of Ras is sufficient to induce the nuclear accumulation of phosphorylated MEK1/2 and ERK1/2 in intestinal epithelial cells. To evaluate the biological impact of the mislocalization of MEK1/2, we have forced the localization of MEK1 in the nucleus of epithelial cells. We found that sustained nuclear MEK1 signaling leads to hyperactivation of ERK1/2 and to enhanced cell proliferation. Nuclear localization of MEK1 also leads to tetraploidization, chromosomal instability (CIN) and tumorigenesis. Importantly, we show that oncogenic Ras downregulates the spatial regulator Sef, concomitant to nuclear accumulation of activated MEK1/2. Moreover, re-expression of Sef is sufficient to restore the normal localization of MEK1/2 and to revert the cell cycle defects and tumorigenesis induced by oncogenic Ras. Another project was initiated to characterize the tetraploidy and CIN observed upon hyperactivation of the Ras-ERK1/2 pathway. Aneuploidy and CIN are observed in the majority of colorectal cancers and are associated with a poorer prognosis. We show that hyperactivation of ERK1/2 by oncogenic Ras or sustained nuclear MEK-ERK1/2 signaling induces mitotic defects that lead to tetraploidy, aneuploidy and CIN. We also found that dysregulation of Ras-ERK1/2 signaling alters the expression and localization of Aurora A and the Chromosomal passenger complex proteins. In conclusion, we show for the first time that the MEK/ERK1/2 signaling pathway is implicated in aneuploidy and CIN. Our results suggest that sustained nuclear ERK1/2 signaling may contribute to the initiation and progression of colorectal cancer by rapidly inducing aneuploidy and CIN. We suggest that loss of Sef is an early oncogenic event that contributes to genetic instability and tumor progression by sustaining nuclear ERK1/2 signaling. These observations are significant and highlight the importance of the Ras-ERK1/2 signaling pathway in colorectal tumorigenesis.

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Les soins pulpaires en denture lactéale sont les soins fréquemment réalisés en odontologie pédiatrique et la réaction pulpaire ainsi que les mécanismes de réparation tissulaire lors d’un traumatisme ne sont pas très bien connus ou investigués. En se référant à la littérature dentaire, on constate que les recherches sont souvent focalisées sur la denture définitive.<p>Objectifs<p>1) Etudier l’influence du traitement avec divers matériaux sur la formation dentinaire, la structure tissulaire et le degré d’inflammation.<p>2) Acquérir des connaissances sur l’interaction à l’interface matériau/tissu.<p>3) Etudier le rôle de la voie de signalisation Notch (1 et 2) dans le processus de remaniement et réparation du tissu pulpaire en cas de traumatisme.<p>Matériels et méthodes<p>Deux types de soins pulpaires, la pulpotomie et le coiffage direct, sont réalisés sur les dents lactéales porcines et les résultats sont étudiés après 3 périodes :7 jours, 21-28 jours et 90 jours.<p>La pulpotomie :8 matériaux, 10 dents par matériau, 2 matériaux par cochon et par période pour un total de 240 dents.<p>Le coiffage direct :10 matériaux, 10 dents par matériau, 2 matériaux par cochon et par période pour un total de 300 dents.<p>Par la suite, différentes techniques ont été utilisées :<p>1. La microscopie optique :étude des coupes histologiques après coloration.<p>2. La microscopie électronique à transmission :observer les caractéristiques morphologiques du tissu pulpaire et analyser les structures cellulaires en détail. L’objectif principal de cette recherche était centré sur les biomatériaux pour la période de 21-28 jours afin d’examiner l’interaction entre le biomatériau et le complexe dentino-pulpaire après leur placement.<p>12<p>3. La voie de signalisation Notch (1 et 2): investiguer l’intervention éventuelle de cette voie dans le processus de régénération tissulaire par différenciation des cellules pour les deux périodes de 7 et 21-28 jours pour tous les matériaux utilisés.<p>Résultats<p>A. Microscopie optique :<p>1. La pulpotomie :les biomatériaux provoquent moins d’infiltrat de cellules inflammatoires au niveau du tissu pulpaire et favorisent la déposition dentinaire.<p>2. Le coiffage direct :on obtient les mêmes résultats que dans le cadre de la pulpotomie.<p>B. Microscopie électronique en transmission :<p>1. L’induction du tissu calcifié ou la formation de néo-dentine s’est seulement produite au niveau du site de l’exposition après le placement des biomatériaux dans les 2 types du traitement (pulpotomie & coiffage direct). En revanche aucune formation du tissu calcifié n’a été observée dans le parenchyme pulpaire à distance du site de l’exposition.<p>2. Cet examen montre que les cellules en contact des biomatériaux ou même à proximité de ces derniers présentent un réticulum endoplasmique élargi parallèle à la longueur de la cellule. Des mitochondries, plusieurs appareils de Golgi et des éléments denses sont observés dans le cytoplasme cellulaire.<p>3. Cet examen a également montré que le MTA et le WPC, considérés par la littérature dentaire comme non-résorbables, sont phagocytés par les cellules histiocytaires.<p>C. Voie de signalisation de Notch :<p>Nos recherches n’ont pas montré de marquage concluant pour aucun de matériaux sauf dans le cadre de coiffage direct pour les dents traitées au MTA et Ca(OH)2 pour la période de 7 jours. Par contre, aucun marquage n’est observé après 21-28 jours. / Doctorat en Sciences dentaires / info:eu-repo/semantics/nonPublished