Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2016-09-13T20:01:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Investigação bioquímica e eletrofisiológica da atividade neurotóxica da urease de Canavalia Ensiformis sobre o sistema nervoso de mamíferos.pdf: 4036702 bytes, checksum: 7c0fc1ca67b3af15c724790f838de2ed (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-13T20:01:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Investigação bioquímica e eletrofisiológica da atividade neurotóxica da urease de Canavalia Ensiformis sobre o sistema nervoso de mamíferos.pdf: 4036702 bytes, checksum: 7c0fc1ca67b3af15c724790f838de2ed (MD5) Previous issue date: 2016 / A urease de Canavalia ensiformis (Jack Bean Urease, JBU) possui uma cadeia polipeptídica de 90.770 kDa, com 840 resíduos de aminoácidos. Do ponto de vista biotecnológico, já foram caracterizadas suas ações fungicida e inseticida. Quando administrada na corrente sanguínea de mamíferos, esta, induz convulsões que culminam em morte dos animais, um efeito cujo mecanismo de ação ainda carece de investigação. O objetivo desse trabalho foi investigar os padrões eletrofisiológicos da JBU no sistema nervoso central e periférico de roedores in vivo e in vitro, e as correlações bioquímicas em termos de viabilidade celular e exocitose do L-glutamato. Nos ensaios bioquímicos, verificou-se aumento na liberação de L-glutamato em sinaptossomas corticais de ratos na concentração de 100 nM. Os ensaios de viabilidade celular por MTT em fatias de hipocampo de camundongos não demonstraram alterações. Nos ensaios eletrofisiológicos, verificou-se redução significativa na amplitude do potencial de ação composto (CAP) de nervo ciático de camundongo, nas doses de 1 e 10 nM. Nos ensaios eletroencefalográficos em ratos a injeção da urease (10nM) no hipocampo induziu um traçado de espícula-onda. A redução na amplitude do CAP provavelmente está relacionada a uma inibição dos canais de sódio voltagem-dependentes, já que a administração posterior de tetrodotoxina, não aumentou o nível de bloqueio da condução. Nossos resultados demonstram um efeito excitatório da JBU do tipo crise de ausência sobre o sistema nervoso central de mamíferos. Este resultado sugere o envolvimento dos canais de Ca2+ do tipo T nos efeitos excitatórios da JBU. O bloqueio da condução do nervo ciático de camundongos sugere o envolvimento de canais de Na+ voltagem dependentes, o qual corroboraria a atividade excitatória da urease sobre o sistema nervoso central de mamíferos. / The Canavalia ensiformis urease (Jack Bean Urease) has a 90,770 kDa, polypeptide containing 840 aminoacid residues. JBU is known to exhibit insecticidal and fungicidal activities. When administered endovenously in mammalians, it induces tonic clonic convulsions culminating in the death of the animals. This mechanisms involved in the excitatory activity of JBU has not been elucidated so far. In this work, we sought to investigate the central and peripheral electrophysiological patterns of Jack Bean Urease in rodents, in vivo and in vitro, as well as the biochemical correlation of cell viability and glutamate release. In the biochemical assays, JBU induced increase in L-Glutamate release in rat cortical sinaptossomes, with no alteration of mice hippocampal cell viability. The electrophysiological assays, showed that JBU induce a significant decrease on mice sciatic nerve compound action potentials (CAP), and spike-wave discharges (SWD) similar to “petit mal” seizures when injected directly in the hippocampus (10 nM). The decrease in CAP amplitude is related to a blockage of voltage-gated sodium channels, since it was not affected by the concomitant application of tetrodotoxin. Our results show that JBU exerts an effect of spike wave discharges-like activity over the mammalian central nervous system. This later result suggests an involvement of T-type voltage gated calcium channels in the excitatory activity of JBU. The blockade of mouse sciatic nerve compound action potential conduction corroborates the excitatory activity of the urease upon the mammalian central nervous system.

Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-07-04T18:18:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ImpactoRedesDistribuicao.pdf: 3740924 bytes, checksum: 3fc693c9e32013dada9cf9bf3be0bcd8 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-08-17T16:36:35Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ImpactoRedesDistribuicao.pdf: 3740924 bytes, checksum: 3fc693c9e32013dada9cf9bf3be0bcd8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-17T16:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ImpactoRedesDistribuicao.pdf: 3740924 bytes, checksum: 3fc693c9e32013dada9cf9bf3be0bcd8 (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Esta dissertação visa mostrar o impacto de geradores fotovoltaicos distribuídos, conectados nas redes de distribuição, na estabilidade de tensão de longo-prazo usando simulação completa no domínio do tempo. O efeito de diferentes níveis de penetração da geração fotovoltaica é investigado. Também são investigados diferentes modelos de redes de distribuição com geração distribuída: 1) Carga e GD representados por modelo ZIP e carga com potência ativa negativa do tipo corrente constante, respectivamente, na subestação (SE); 2) Carga e GD representados por modelo ZIP e equivalente dinâmico, respectivamente, na SE; 3) Carga e GD representados por modelo ZIP e modelo dinâmico, respectivamente, distribuídos ao longo de uma rede de distribuição de MT. Equipamentos como transformadores com comutação de tape sob carga (OLTC, do inglês, “On-Load Tap Changer”), limitadores de sobrecorrente de excitação (OEL, do inglês, “Overexcitation Limiter”), cargas estáticas e autotransformadores reguladores de tensão são levados em consideração nas análises, pois afetam significativamente a estabilidade de tensão de longo-prazo. As investigações são realizadas por meio do uso do software de análise de rede (ANAREDE) e do software de análise de transitórios eletromecânicos (ANATEM), desenvolvidos pelo Centro de Pesquisas de Energia Elétrica (CEPEL). A modelagem estática dos geradores fotovoltaicos é considerada como barras PQ, e a modelagem dinâmica é baseada no modelo PVD1 da WECC (Western Electricity Coordinating Council) implementada via Controle Definido pelo Usuário (CDU) no ANATEM. A proteção mandatória da geração fotovoltaica também é considerada. O sistema de potência estudado é uma junção de um sistema de transmissão de 11 barras com sistemas de distribuição da UKGDS (United Kingdom Generic Distribution System) de 76 barras cada. / This dissertation aims to show the impact of distributed photovoltaic generators connected to distribution networks on long term voltage stability using full time simulation. The effect of different penetration levels of photovoltaic generation is investigated. Different distribution network models considering distributed generation (DG) connections is also investigated: 1) Load and DG represented by ZIP model and negative active power loads, respectively, connected to the substation bus; 2) Load and DG represented by ZIP model and dynamic equivalent, respectively, connected to the substation bus; 3) Load and GD represented by ZIP model and dynamic model, respectively, distributed along a MV distribution network. Equipments such as On-Load Tap Changer (OLTC) transformers, Overexcitation Limiter (OEL), static loads and step voltage regulators are taken into account in the analyzes, since they significantly affect the long-term voltage stability. The investigations were conducted using both the power flow software ANAREDE and transient stability simulator ANATEM, developed by the Electrical Energy Research Center (CEPEL). For the purpose of power flow studies, photovoltaic generators are modeled as PQ buses with Q=0. The modelling of photovoltaic generators for dynamic studies is based on WECC (Western Electricity Coordinating Council) model, wich was inserted into file User Defined Controller (CDU) from ANATEM. The undervoltage protection of photovoltaic generator is also considered. The case studies were performed on a combined transmission and distribution model.

Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-07-06T18:12:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ControleLocalPotencia.pdf: 10794588 bytes, checksum: ce99108b1f950294c7c989156bcff73d (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-08-18T14:53:16Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ControleLocalPotencia.pdf: 10794588 bytes, checksum: ce99108b1f950294c7c989156bcff73d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-18T14:53:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ControleLocalPotencia.pdf: 10794588 bytes, checksum: ce99108b1f950294c7c989156bcff73d (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Esta dissertação aborda os principais problemas operacionais enfrentados pelos operadores de redes de distribuição devido à elevada integração de geradores fotovoltaicos (FV), tais como sobretensões, comutações excessivas de tape e a condição de runaway em reguladores de tensão. As sobretensões ao longo do alimentador podem ser causadas pela significativa injeção de potência ativa do gerador FV. Adicionalmente, as variações rápidas e significativas na potência ativa injetada pelo gerador FV, associadas com os transitórios de nuvens, resultam em aumento excessivo de comutações de tape no regulador de tensão, afetando negativamente a vida útil desse equipamento. Além disso, quando a direção do fluxo de potência é invertida no alimentador devido à significativa injeção de potência ativa do gerador FV, o regulador de tensão pode falhar no controle da tensão na barra sob regulação e o tape pode atingir seu limite inferior ou superior (condição de runaway). Esta dissertação propõe um controle local de potência reativa para inversores FV a fim de aliviar tais problemas mencionados. O controle proposto é avaliado usando dados de medição de um sistema fotovoltaico real instalado no telhado de uma residência localizada em Belém e simulações dinâmicas de um alimentador de média tensão com uma miniusina FV. / This dissertation addresses the major operational problems faced by distribution network operators due to the high integration of photovoltaic (PV) generators, such as overvoltages, excessive tap counts and voltage regulator runaway condition. The overvoltage problem in distribution networks may be caused by significant active power injection from PV generation. Additionally, the rapid and significant variations in PV generator active power associated with cloud transients result in an increase of voltage regulator tap counts, adversely affecting the useful life of that device. Also, when the direction of the power flow is reversed due to PV generator active power injection, the voltage regulator can fail to control voltage at the regulated bus and reach lowest or highest tap limit (runaway condition). This dissertation proposes a local reactive power control for PV inverters to alleviate such problems. The proposed control is evaluated using measurement data from the real rooftop PV system in the city of Belém and dynamic simulations on a single MV feeder with a PV solar plant.

Orientador: Teófilo Miguel de Souza / Resumo: Esta Tese de Doutorado apresentou o estudo dos problemas de tensão originados no ponto comum de conexão de uma rede experimental para fornecer até 1.000 kWh/mês de energia solar com a rede de baixa tensão da Universidade de Ibagué, na Colômbia. Inicialmente foi feita uma introdução, onde destacou-se a importância da geração distribuída, os problemas gerados e os objetivos propostos. Em seguida, foi realizado o estudo da qualidade da energia na rede de baixa tensão, conforme as normas NTC 5001. Foi dimensionada, montada e colocada em operação uma rede experimental, utilizando a metodologia proposta nesta Tese, composta de 30 painéis solares de 260 W marca IBC solar, um inversor marca Fronius de 7,6 kW e um contador bidirecional ligados diretamente à rede através com fio de seção transversal de 6,0 mm2. A energia máxima produzida pela rede experimental foi de 850 kWh/mês, equivalente a 72,65% do total da capacidade instalada. Os painéis solares apresentaram uma eficiência média de 15,7%, a eficiência do inversor foi obtida na faixa de 75 a 94% e o desempenho global, PR, entre 0,83 e 1,30. Depois de avaliar a rede experimental seguiu-se com a análise da qualidade da energia no ponto comum de ligação registrando, em relação às perturbações de longa duração, um aumento de 2%; o desequilíbrio da tensão diminuiu 3,5%, as harmônicas de tensão aumentaram 7% na linha U1, 0,8% na linha U2 e 3% na linha U3. Em relação à corrente harmônica foi evidenciado um incremento de 22% na linha U1.... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In recent years, the growth of the electrical system associated with non ideal conditions can compromise the normal operation devices. This fact is becoming extremely important, as much the consumers as for the electric utilities. In this way, the electrical agencies are more concerned about, for example, the distribution voltage levels. With this in mind, the voltage regulation device has been one of the more used equipment with the purpose of voltage levels correction or adequacy, either agricultural or urban site. This equipment, in its usual structure, is composed by an autotransformer with a tap automatic mechanism that presents a high time delay and does not apply to the shortduration voltage variations requirements, imposed by electrical standards. Aiming at adjusting the voltage regulator to the distribution requirements, that is, to minimize its time delay to any voltage variation, transitory studies of tap commutation must be elaborated. This work aims at modelling a single-phase 32 step voltage regulator in a computational simulator called ATP (EMTP). This modelling is based on the core magnetic characteristics and it is constituted of linear and non linear inductances representing the flux through the air and through the steel core. By considering the laboratory difficulties to make measurements in a voltage medium equipment (13.8 kV), a typical voltage regulator prototype was constructed (220 V) and a laboratory arrangement was used to validate the corresponding modelling. / O grande crescimento do setor elétrico associado ao fato de a qualidade da energia elétrica fornecida estar se tornando um fator de extrema importância, tanto para os consumidores como para as empresas concessionárias de energia, fez com que os órgãos regulamentadores do setor passassem a se preocupar mais com, por exemplo, os níveis de tensão de uma rede de distribuição. Sob esse ponto de vista, o regulador de tensão tem sido um dos equipamentos mais utilizados no sentido de correção, ou adequação dos níveis de tensão de uma rede de distribuição, seja ela rural ou urbana. Esse equipamento, na sua forma mais usual, é constituído de um autotransformador com um mecanismo automático comutador de tap´s que, por ser mecânico, é lento e não atende às exigências das variações de tensão de curta duração (VTCD) impostas pelas normas vigentes. Visando adequar o regulador de tensão às exigências do mercado, ou seja, minimizar o seu tempo de resposta a qualquer variação de tensão, estudos sobre situações transitórias de comutação de tap´s devem ser elaboradas. Neste sentido, surge esta dissertação, com o objetivo de desenvolver uma modelagem para representar um regulador de tensão monofásico com 32 degraus no programa ATP (EMTP). A modelagem é baseada nas características do circuito magnético do núcleo e é constituída de indutores lineares representando o fluxo através do ar e indutores não lineares representando o fluxo através do núcleo de ferro. Tendo-se em vista as dificuldades laboratoriais para fazer medições em um equipamento de média tensão (13,8 kV), foi construído um modelo reduzido do regulador de tensão, semelhante ao regulador comercial típico, em baixa tensão (220 V). Ensaios laboratoriais foram realizados com o intuito de validar o modelo computacional em baixa tensão. / Mestre em Ciências

Neste trabalho estudamos o movimento de cargas espaciais livres em sólidos dielétricos isolantes ou condutores, sub¬metidos à uma d.d.p. conhecida, admitindo uma distribuição qualquer de cargas que toca inicialmente um dos eletródios.Usando o método das características, reduzimos o problema à solução de uma equação diferencial de la. ordem. Como aplicações, resolvemos os casos de uma densidade linear, quadrática e exponencial, em sólidos com condutividade nula sob a condição de curto-circuito. Observamos que as distribuições tendem rapidamente para distribuições uniformes e, em certos casos, pode ocorrer inversão de corrente, dependendo do tipo de distribuição inicial / Free space charge motion is studied in solid dielectrics, insulators or conductors, under a given voltage. We assume an arbitrary charge distribution contact which is initially in contact with one of the electrodes. Using the \"Method of Characteristics\" we can reduce the problem to the resolution of a first order differential equation. Results are applied for linear, quadratic and exponential charge distributions in solids with zero conductivity under short¬circuit conditions. We saw that the charge profiles fall rapidly to uniform distributions and for cases dependent on initial distributions, current inversions are observed

Orientador: José Antonio Siqueira Dias / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-26T13:53:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tercariol_WalterLuis_D.pdf: 1322557 bytes, checksum: 4f45518a1a62907cd9a61afa627408c3 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Este trabalho visa compilar três contribuições na melhoria dos projetos de reguladores de tensão com unidades de bombeamento de carga embutidos (células elevadoras de tensão Dickson - BC). A primeira aborda uma técnica inovadora de arranque na partida deste módulo elevador quando habilitado. Este projeto se refere à aceleração da inicialização do modulo BC, tendo como objetivo a diminuição do intervalo de tempo da rampa ascendente da tensão de saída Vo até atingir o nível alvo de regulação. A técnica consiste em gerenciar o aumento da freqüência do relógio de bombeamento entregue as unidades de bombeamento durante a fase de subida, quando a regulação estiver estabelecida o sistema se regenera voltando ao estado original de freqüência de bombeamento natural. Uma segunda proposta inovadora de projeto é referente à homogeneização e redução da aleatoriedade da ondulação da tensão de saída Vo, referente ao regulador com o modulo BC embutido, baseado em comparadores com trava, com proposta de redução do erro de comparação devido ao efeito aleatório durante o estagio de comparação comumente encontrado neste tipo de abordagem, a técnica consiste em suprimir o acoplamento capacitivo nocivo durante a fase de isolamento elétrico no processo de comparação mantendo o espelho de corrente do comparador na região de saturação. Esta técnica visa proporcionar uma redução significativa da capacitância de desacoplamento utilizada para filtragem da tensão Vo. Uma terceira e última contribuição é referente a uma inovadora técnica de medição indireta da tensão de saída Vo do regulador com módulo BC baseada em uma medida simples e precisa dos pares tensão da porta e fonte (VPS) e corrente elétrica do dreno (Idreno) de um dispositivo NMOS de alta tensão adicionado de modo que duas tensões conhecidas (preestabelecidas) são aplicadas na porta do dispositivo e as respectivas correntes de dreno são mensuradas e uma terceira desconhecida (oriunda do regulador elevador BC) desconhecida pode ser extrapolada de forma simples. Esta técnica visa ser útil para medição de reguladores de baixa potencia pois o carregamento do regulador (Vo) é quase nulo.Todas as inovações e melhorias propostas foram analisadas em veículos de teste (silício) e com as provas de conceito, feitas em simulações elétricas / Abstract: This work aims to compile contributions in improving designs based on voltage regulators with voltage elevator with built-in charge pump CP. The first deals with an innovative technique rump-up this module when enabled. This project refers to the acceleration of startup the CP module, aiming at the reduction of the period of stabilization of the ramp output voltage Vo to the level of regulation target. The technique is to manage increasing the frequency of pumping clock during the phase of rump up and when the setting established the system regenerates back to the original state pumping frequency. A second innovative project proposal was made on the homogenization and reduction of the ripple of the output voltage Vo, referring to the regulator with the |CP module, based on latch comparators , alignment error reduction proposal because of the random effect during the stage comparison commonly found in this type of approach, the technique is to remove the harmful capacitive coupling during electrical isolation phase on the comparison keeping the comparator current mirror in saturation region. This technique aims to provide a significant reduction in the decoupling capacitance used for filtering the voltage Vo. A third and final contribution is related to an innovative technique of indirect measurement of the output voltage Vo of the regulator module CP, based on a simple and accurate measure of the gate voltage and couples the drain electric current of a high voltage NMOS device / Doutorado / Eletrônica, Microeletrônica e Optoeletrônica / Doutor em Engenharia Elétrica

A peçonha das anêmonas do mar é uma fonte de compostos bioativos, incluindo toxinas peptídicas que são ferramentas para o estudo da estrutura e função dos canais voltagem dependentes de K+ (KV). Neste trabalho, quatro neurotoxinas foram purificadas da peçonha das anêmonas do mar Actinia bermudenesis e Bunodosoma caissarum. AbeTx1 e BcsTx4 possuem um motivo estrutural semelhante à das \"kappa-toxinas\" e análises funcionais e estruturais permitiram concluir que são os primeiros membros de um novo (tipo 5) de neurotoxinas de anêmonas do mar que atuam em canais KV. Por sua vez, a similaridade estrutural das toxinas BcsTx 1 e BcsTx2 nos permitiu inferir que estas são membros do já descrito tipo 1 (subtipo 1b) de neurotoxinas de anêmona que também atuam em canais KV. A caracterização funcional foi realizada utilizando-se diferentes subtipos de canais KV, expressos em ovócitos de Xenopus laevis e as medidas eletrofisiológicas foram feitas empregando-se a técnica de \"voltage-clamp\" com dois microelétrodos. AbeTx1, BcsTx1 e BcsTx2 (3 μM) apresentaram uma seletividade de atividade para os subtipos de KV1.1-KV1.3, KV1.6 e Shaker IR, ao passo que a BcsTx4 (3 μM) é somente capaz de bloquear a corrente dos subtipos de KV1.1, KV1.2 e KV1.6. Os mecanismos de ação envolvidos na seletividade da atividade e na potência com que estas se ligam aos seus alvos biológicos foram discutidos com base nos resultados obtidos e análises fisiológicas permitiram propor que estas toxinas atuam como \"armas\" para defesa contra predadores e/ou para captura de presas / The sea anemones venom is a rich source of bioactive compounds, including peptide toxins which are tools for studying the structure and function of voltage-dependent channels K+ (KV). In this work, four neurotoxins were purified from the venom of the sea anemones Actinia bermudenesis and Bunodosoma caissarum. AbeTx1 and BcsTx4 have a structural motif similar to that of kappa-toxins and functional and structural analysis showed that they are the first members of a new type (type 5) of sea anemone neurotoxins acting on KV channels. Moreover, the structural analysis of BcsTx1 and BcsTx2 toxins allowed us to conclude that they are members of the previously described type 1 (subtype 1b) of sea anemone neurotoxins. Functional characterization was performed by means of a wide electrophysiological screening on different KV channels using oocytes of Xenopus laevis and electrophysiological measurements were performed employing the voltage-clamp technique. AbeTx1, BcsTx1 and BcsTx2 (μM) showed a selective activity for KV1.1-KV1.3, KV1.6 and Shaker IR, while BcsTx4 (3 μM) only blocks KV1.1, KV1.2 and KV1.6. The mechanisms involved in potency and selectivity were discussed based on the results obtained and physiological analyses have provided new insights on the role of these toxins in the physiology of the sea anemones

Receptores purinérgicos e canais de cálcio voltagem-dependentes estão envolvidos em diversos processos biológicos como na gastrulação, durante o desenvolvimento embrionário, e na diferenciação neural. Quando ativados, canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores purinérgicos do tipo P2, ativados por nucleotídeos, desencadeiam transientes de cálcio intracelulares controlando diversos processos biológicos. Neste trabalho, nós estudamos a participação de canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores do tipo P2 na geração de transientes de cálcio espontâneos e sua regulação na expressão de fatores de transcrição relacionados com a neurogênese utilizando como modelo células tronco (CTE) induzidas à diferenciação em células tronco neurais (NSC) com ácido retinóico. Descrevemos que CTE indiferenciadas podem ter a proliferação acelerada pela ativação de receptores P2X7, enquanto que a expressão e a atividade desse receptor precisam ser inibidas para o progresso da diferenciação em neuroblasto. Além disso, ao longo da diferenciação neural, por análise em tempo real dos níveis de cálcio intracelular livre identificamos 3 padrões de oscilações espontâneas de cálcio (onda, pico e unique), e mostramos que ondas e picos tiveram a frequência e amplitude aumentadas conforme o andamento da diferenciação. Células tratadas com o inibidor do receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), Xestospongin C, apresentaram picos mas não ondas, indicando que ondas dependem exclusivamente de cálcio oriundo do retículo endoplasmático pela ativação de IP3R. NSC de telencéfalo de embrião de camundongos transgênicos ou pré-diferenciadas de CTE tratadas com Bz-ATP, o agonista do receptor P2X7, e com 2SUTP, agonista de P2Y2 e P2Y4, aumentaram a frequência e a amplitude das oscilações espontâneas de cálcio do tipo pico. Dados, obtidos por microscopia de luminescência, da expressão em tempo real de gene repórter luciferase fusionado à Mash1 e Ngn2 revelou que a ativação dos receptores P2Y2/P2Y4 aumentou a expressão estável de Mash1 enquanto que ativação do receptor P2X7 levou ao aumento de Ngn2. Além disso, células na presença do quelante de cálcio extracelular (EGTA) ou do depletor dos estoques intracelulares de cálcio do retículo endoplasmático (thapsigargin) apresentaram redução na expressão de Mash1 e Ngn2, indicando que ambos são regulados pela sinalização de cálcio. A investigação dos canais de cálcio voltagem-dependentes demonstrou que o influxo de cálcio gerado por despolarização da membrana de NSC diferenciadas de CTE é decorrente da ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L. Além disso, esse influxo pode controlar o destino celular por estabilizar expressão de Mash1 e induzir a diferenciação neuronal por fosforilação e translocação do fator de transcrição CREB. Esses dados sugerem que os receptores P2X7, P2Y2, P2Y4 e canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L podem modular as oscilações espontâneas de cálcio durante a diferenciação neural e consequentemente alteram o padrão de expressão de Mash1 e Ngn2 favorecendo a decisão do destino celular neuronal. / Purinergic receptors and voltage gated Ca2+ channels have been attributed with developmental functions including gastrulation and neural differentiation. Upon activation, nucleotide-activated P2 purinergic receptor and voltage-gated Ca2+ channel subtypes trigger intracellular calcium transients controlling cellular processes. Here, we studied the participation of voltage-gated calcium channels and P2 receptor activity in spontaneous calcium transients and consequent regulation expression of transcription factors related to retinoic acid-induced neurogenesis of mouse neural stem and embryonic stem cells (ESC). In embryonic pluripotent stem cells, proliferation is accelerated by P2X7 receptor activation, while receptor expression / activity needs to be down-regulated for the progress of neuroblast differentiation. Moreover, along neural differentiation time lapse imaging with means of a cytosolic calcium-sensitive fluorescent probe provided different patterns of spontaneous calcium transients (waves and spikes) showing that both, frequency and amplitude increased along differentiation. Cells treated with the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP3R) inhibitor Xestospongin C showed spikes but not waves, indicating that waves exclusively depended on calcium release from endoplasmic reticulum by IP3R activation. Cells treated with the P2X7 receptor subtype agonist Bz-ATP and the P2Y2 and P2Y4 receptor 2-S-UTP increased frequency and amplitudes of calcium transients, mainly spikes, in embryonic telencephalon neural stem cells (NSC) and NSC pre-differentiated from ESC. Data obtained by luminescence time lapse imaging of stable transfected cells with Mash1 or Ngn2 promoter-protein fusion to luciferase reporter construct revealed increased Mash1 expression due to activation of P2Y2/P2Y4 receptor subtypes, while increased expression of Ngn2 was observed following P2X7 receptor activation. In addition, cells imaged in presence of the extracellular calcium chelator EGTA or following endoplasmic reticulum calcium store depletion by thapsigargin showed a decrease in Mash1 and Ngn2 expression, indicating that both are regulated by calcium signaling. Investigation of the roles of voltage gated Ca2+ channels in neural differentiation showed that Ca2+ influx in NSC pre-differentiated from ESC is due to membrane depolarization and L-type voltage gated Ca2+ channel activation, thereby controlling cell fate decision, by stabilizing the expression of MASH1 and inducing differentiation, by phosphorylation of the transcription factor CREB. Altogether these data suggest that P2X7, P2Y2, P2Y4 receptors and L-type voltage gated Ca2+ channels can modulate spontaneous calcium oscillations during neural differentiation and consequently change the Mash1 and Ngn2 expression patterns, thus favoring the cell fate decision to the neuronal phenotype.

Submitted by Clebson Anjos (clebson.leandro54@gmail.com) on 2016-03-29T17:44:52Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1922192 bytes, checksum: 6f50e098ac1e02adb9b434bdbc12154e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-29T17:44:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1922192 bytes, checksum: 6f50e098ac1e02adb9b434bdbc12154e (MD5) Previous issue date: 2014-08-25 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / TRP channels have been extensively studied in many physiological and pathological processes involved in blood pressure regulation. Carvacrol is well known to act on TRP channels in the vasculature, however there are no studies of its effects in hypertensive rats. Our aim was to evaluate the contribution of TRP channels in hypertension and evaluate the effects of carvacrol on TRP channels of SHR. In an electrophysiological approach, carvacrol (300 μM) inhibited the barium current, suggesting a reduction of calcium influx through L-type voltage-operated Ca2+ channels. We found that the mRNA expression of the following TRP channels: TRPV1 (p=0.0007), TRPV4 (p=0.0002), TRPM7 (p=0.0091) and TRPM8 (p=0.0008) are decreased and TRPC1 (p=0,02) are increased in SHR compared to control. In aortic rings preparations precontracted with 1 μM of phenylephrine, carvacrol (10-8 - 3x10-4 M) induced vasorelaxation in WKY (pD2 = 4.88  0.09, Emax = 100.73  2.24%, n = 6) and SHR (pD2 = 4.93  0.08, Emax= 110.06  2.07%, n = 6) in the presence of functional endothelium and that effect was not altered after endothelium removal in WKY (pD2 = 5.09  0.08, Emax = 99.60  0.88%, n = 6) and SHR (pD2 = 5.00  0.08, Emax = 101.23  1.96%, n = 6), proposing an endotheliumindependent mechanism. To assess the role of TRP channels, aortic rings were incubated with ruthenium red. In this assay, the vasorelaxant response was not changed in the WKY. On the other hand both potency (p<0.001) and efficacy (p<0.001) were reduced in SHR, suggesting that carvacrol could activate the subtypes TRPV in hypertensive animals. When using magnesium, equally potency (p<0.001) and pharmacological efficacy (p<0.01) were attenuated in both WKY and SHR, suggesting the involvement of TRPM7. In preparations with 2-APB, CPZ and BCTC, the vasorelaxant effect was potentiated (p<0.01) in both WKY and SHR, suggesting the participation of TRPV1, TRPM8 and TRPM7 channels in the vasorelaxant effect induced by carvacrol. Nevertheless, in the presence of capsaicin, the vasodilator effect was attenuated (p<0.001) in both WKY and SHR endorsing a possible action of carvacrol on TRPV1 and TRPV4 channel. In addition, in vivo studies showed that carvacrol produced hypotension and bradycardia in unanesthetized WKY and SHR. In order to address the cardiovascular responses in vivo, we performed experiments using ruthenium red and capsaicin to evaluate the contribution of TRP channels in this effect. Our results suggested an action of carvacrol on TRPV1 and TRPV4, confirming the in vitro assays. In conclusion, these results suggest that the expression of TRPV1, TRPV4, TRPM7 and TRPM8 was reduced and TRPC1 increased in SHR and carvacrol induced a vasorelaxant effect probably by acting on TRPV1, TRPV4, TRPC1, TRPM7 and TRPM8 in SHR. Furthermore, the in vivo effects induced by carvacrol exhibited a hypotensive and bradycardic activity and this effect, at least in part, is due to an activation of TRPV1 and TRPV4 channels in these responses. / Os canais TRP têm sido amplamente estudados, em diversos processos de regulação fisiológico e patológico no sistema cardiovascular. Carvacrol (5-isopropil-2metilfenol) é conhecido por agir na vasculatura ativando ou bloqueando canais TRP, entretanto não há relatos dos seus efeitos em ratos hipertensos. Nosso objetivo foi avaliar o envolvimento dos canais TRP na hipertensão e o papel do carvacrol nos efeitos cardiovasculares em ratos espontaneamente hipertensos. Em ensaios eletrofisiológicos carvacrol (300μM) promoveu inibição das correntes de bário, sugerindo uma inibição do influxo de cálcio por canais de Ca2+ tipo-L. Ao avaliar a expressão do RNAm dos canais TRP em SHR, observamos pela primeira vez que a expressão de TRPV1 (p=0,0007), TRPV4 (p=0,0002), TRPM7 (p=0,0091), TRPM8 (p=0,0008) foram diminuídas e TRPC1 (p=0,02) aumentada. Em anéis de aorta précontraídos com 1 μM de FEN, o carvacrol (10-8 - 3 ₓ 10-4 M) induziu vasorelaxamento em ratos wistar kyoto (WKY) (pD2 = 4,88  0,09, Emáx = 100,73  2,24%, n = 6; pD2 = 5,09 0,08, Emáx = 99,60  0,88%, n = 6) e em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) (pD2 = 4,93  0,08, Emáx = 110,06  2,07%, n = 6) na presença e na ausência do endotélio funcional, respectivamente. Para avaliar a participação dos canais TRP, na ausência do endotélio funcional as preparações foram incubadas com vermelho de rutênio, em WKY não houve alteração da resposta, mas em animais SHR tanto sua potência (p<0,001) como sua eficácia (p<0,001) foram diminuídas, sugerindo que carvacrol pode estar agindo em TRPV nos SHR. Ao utilizar magnésio, em WKY e SHR tanto sua potência (p<0,01) quanto sua eficácia (p<0,001) farmacológica foram atenuadas, sugerindo ação sobre o canal TRPM7. Nas preparações com 2-APB, CPZ e BCTC os seus efeitos foram potencializados (p<0,01), sugerindo ação sobre os canais TRPV1, TRPC1, TRPM7 e TRPM8. Já com capsaicina, um ativador de TRPV1, esse efeito foi atenuado (p<0,001) confirmando uma possível ação do carvacrol sobre TRPV1. Nos estudos in vivo, com WKY e SHR não anestesiados, carvacrol produziu hipotensão e bradicardia, onde ao avaliar a ação dos canais TRP em ensaios com vermelho de rutênio e capsaicina pode-se sugerir uma possível ação de carvacrol sobre TRPV1 e TRPV4, diminuindo a pressão arterial, corroborando com os ensaios in vitro. Em conclusão, esses resultados sugerem que os canais TRPV1, TRPV4, TRPM8 e TRPM7 têm sua expressão diminuída e TRPC1 a expressão aumentada em animais SHR e carvacrol induz efeito vasorelaxante provavelmente agindo em TRPV1, TRPV4, TRPC1, TRPM7 e TRPM8 em SHR. Além disso, os efeitos induzidos por carvacrol in vivo mostraram uma atividade hipotensora e bradicárdica e uma possível influencia dos canais TRPV1 e TRPV4 nessas respostas.