Orientador: Heloiza Ferreira Alves do Prado / Coorientador: Miguel Luiz Menezes Freitas / Banca: Paulo Cezar Ceresini / Banca: Rodrigo Simões Ribeiro Leite / Resumo: Celulose e hemicelulose são os polissacarídeos mais encontrados em todo o mundo. Em plantas, a celulose e a hemicelulose estão situados entre a lignina formando as fibras de celulose. As enzimas hemicelulolíticas produzidas por micro-organismos têm atraído uma grande atenção desde a década passada, particularidade devida as suas características biotecnológicas em vários processos industriais como indústrias de alimentos, ração animal, etanol e papel e celulose. Assim neste trabalho foram isoladas linhagens fungicas de duas regiões de Cerrado, na qual oito linhagens fúngicas foram analisadas quanto ao perfil de produção enzimática sob fermentação em estado sólido, utilizando resíduo agroindustrial como substrato. Foram determinadas atividade enzimática para xilanase e CMCase. A melhor atividade enzimática para xilanase obteve-se a partir do fungo mesofílico Neosartorya spinosa P2D19 com 20,6 U ml-1 (133,0 U/g), após 72 horas de cultivo sob fermentação em estado sólido. A enzima mostrou-se mais ativa em pH 5,0, porém cerca de 85% da atividade foi mantida em pH 7,5. A temperatura ótima dessa xilanase foi em 60° C / Abstract: Cellulose and hemicellulose are polysaccharides found all over the world. In plants, the cellulose and hemicellulose are localed between the lignin forming the cellulose fibers. Hemicellulolytic enzymes produced by microorganisms has attracted great attention over the past decade due to its special features in several biotechnological industrial processes such as food industries, animal feed, ethanol and pulp and paper. In this study, fungal strains were isolated from two Cerrado areas, from which eight fungal strains were analyzed for enzyme production profile in solid fermentation state using agro industrial residue as substrate. Enzyme activity was determined for xylanase and CMCase. The highest xylanase enzyme activity was obtained with fungi mesophilic Neosartorya spinosa strain P2D16 with 20.6 U.ml-1 (133 U/g) after 72 hours of cultivation under solid fermentation state. The enzyme was more active at pH 5.0, although of its 85% activit was maintained at pH 7.5. The optimum temperature for xylanase activity was 60° C / Mestre

As celulases e as xilanases são enzimas que hidrolisam a celulose e a xilana, respectivamente, contidas nos resíduos lignocelulósicos. A possibilidade de aplicar estas enzimas na produção de etanol vem sendo objeto de diversos estudos. No entanto, ainda não há uma tecnologia economicamente viável para a produção deste biocombustível a partir da biomassa lignocelulósica. Entre os microrganismos que apresentam altos títulos para estas enzimas, incluem-se linhagens de Penicillium echinulatum; porém, ainda faltam dados de sua fisiologia e estudos da produção de enzimas em biorreator. Neste trabalho, empregou-se a linhagem mutante celulolítica desreprimida S1M29 de P. echinulatum e o meio de cultivo foi composto por celulose, sacarose, solução de sais, Tween 80, farelo trigo e farelo de soja. Avaliou-se o efeito de diferentes temperaturas e pHs na produção das enzimas. O efeito da concentração da celulose sobre as atividades enzimáticas foi avaliada em regime descontínuo (RD) e regime descontínuo alimentado (RDA). Verificou-se que a temperatura mais apropriada para a produção de celulases e xilanases é de 28ºC e dentre os valores de pHs avaliados, o pH 6,0 apresentou a maior produção das enzimas. O aumento da concentração da celulose no RD proporcionou maiores atividades para endoglicanases, porém o mesmo não foi obtido para xilanases. Para FPA (Filter Paper Activity), aumentos proporcionais nas atividades foram obtidos somente com concentrações de até 3% de celulose em RD, condição que também proporcionou as maiores atividades de - glicosidases. O RDA incrementou as atividades de FPA, endoglicanases e xilanases, mas não de -glicosidases. Estes resultados contribuem para a otimização de processos e para a produção econômica de enzimas por P. echinulatum, visando o desenvolvimento de tecnologias economicamente viáveis para produção de etanol a partir de materiais lignocelulósicos. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cellulases and xylanases are enzymes that hydrolyze cellulose and xylan respectively, which are found in lignocellulosic residues. Although the applicability of these enzymes in the ethanol production has been the subject of several studies, an economically viable technology for the production of biofuel from lignocellulosic biomass is currently not available. Strains of Penicillium echinulatum are among the microorganisms that have high titers of these enzymes. However, data related to physiology and enzyme production in bioreactor for such strains are still missing. A cellulolytic mutant strain of P. echinulatum S1M29 and a culture medium composed of cellulose, sucrose, salt solution, Tween 80, wheat bran and soybean meal were used in this study. The effect of different temperatures and pHs during the enzymes production was evaluated. The effect of cellulose concentration in the enzymatic activity was evaluated in batch cultivation (BC) and fed-batch cultivation (FBC). It was found that the appropriate temperature for the production of cellulases and xylanases is 28°C, while the higher enzyme production occurred at pH 6.0. The high cellulose concentration in BC provided the greatest activities for endoglicanases, but the same result was not obtained for xylanases. For Filter Paper Activity (FPA), proportional increases in activity were obtained only with concentrations up to 3% of cellulose in BC, which is also linked to the highest activities for -glucosidases. FBC increased the activities of FPA, endoglucanases and xylanases, but it did not increase the -glucosidases activities. Such results contribute towards the optimization of enzyme production using P. echinulatum and the development of economically viable technologies for the production of ethanol from lignocellulosic materials.

A produção de enzimas do complexo celulases e de xilanases se destaca no cenário mundial, pois estas são importantes para a geração de biocombustíveis, resinas, álcoois, xilitol, sorbitol, e para a indústria de detergentes e ração animal e processos de biobranqueamento, extração de óleos, pigmentos e essências a partir de biomassa lignocelulósica. A secreção e produção destas enzimas são afetadas pela repressão catabólica, devido à presença da glicose liberada. O objetivo do presente estudo foi verificar o efeito sobre a produção enzimática de Penicillium echinulatum de metabólitos e açúcares durante o cultivo submerso. As estratégias utilizadas para a remoção de substâncias do meio de cultivo incluíram filtração e uso de pellets com adsorventes e uso de filmes adsorventes. O preparo de membranas de suporte cerâmico e polimérico, impregnadas com os polímeros poli(fluoreto de vinilideno) (PVDF) e poliamida (PA), foi realizado por inversão de fases, sendo que a membrana cerâmica impregnada com solução 10% (m/v) de PVDF (C1) reteve 88% da proteínas totais da solução enzimática. A remoção de 10 ou 20% do permeado durante a filtração com membranas planas, em períodos de tempo entre 8h e 24h, resultou em aumento da atividade de β- glicosidase e endoglicanase em frascos Erlenmeyer. Com relação à atividade de xilanases, os títulos observados no 4º dia foram entre 40% e 30% superiores quando houve a filtração em 42 e 44 h, respectivamente. Quando adsorventes foram utilizados em biorreator, a atividade de endoglicanase, CBH e xilanase apresentaram um aumento de 50%, 43% e 12%, respectivamente, em meio concentrado utilizando carvão ativado quando comparado ao padrão. Os ensaios com membranas de nanofiltração permitiram retenção de 95% das enzimas do complexo e, quando utilizadas na remoção de 10% e 20% da fase líquida em frascos, resultaram em aumento na atividade enzimática. Os ensaios 18/20, 24/10, 24/20, 44/10 e 44/20 (tempo de processo, em horas, em que foi feita a filtração / volume percentual de permeado removido) apresentaram, em média, em 72 h, um incremento de 33% na atividade de endoglicanase, enquanto o ensaio 44/20, em 96h, apresentou atividade superior a 40% do padrão. Para os cultivos com Trichoderma reesei Rut C30, os ensaios com filtração de 10 % do volume dos frascos, em 12 h e 20 h apresentaram aumento da atividade de FPA, em 60 h de cultivo, de 15% e 11%, respectivamente. Nos mesmos ensaios, a atividade de endoglicanase apresentou incremento de 40,7% e 52,2%, respectivamente, demonstrando o efeito positivo da remoção de 10% de permeado sobre a produção enzimática. Já para FPA, o aumento representou 15% e 11 % para as mesmas condições / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. / Cellulases and xylanases enzymes complex production stands out in the world because these enzymes are important for the generation of biofuels, resins, alcohols, xylitol, sorbitol, and for the detergents industry, animal feed, pulp bleaching, and in the extraction of oils, pigments and essences from lignocellulose biomass. Secretion and production of cellulases and xylanases are affected under catabolic repression conditions due to glucose release. The purpose of the present study was to verify the effect on enzymatic production of Penicillium echinulatum compared to metabolites and sugars during submerged cultivation. The strategies used for the substances removal from the medium included filtration application, the use of pellets with adsorbents, and the use of adsorbents films. Membranes preparation from both ceramic and polymeric supports impregnated with polymers PVDF and PA were performed by phase inversion method, and eventually the ceramic membrane impregnated with solution 10% (w/v) of PVDF (C1) held 88% of the total proteins from the enzymatic solution. The removal consisting in 10% or 20% from the permeate during filtration with flat membranes, in periods between 8h and 24h resulted in a rise in the activity regarding β-glucosidase and endoglucanase in Erlenmeyer flasks. In relation to xylanases activity, the titles observed on the fourth day were between 40% and 30% superiors when filtration was made in 42 and 44h, respectively. Subsequently, when adsorbents were used in the bioreactor, activity involving endoglucanase, CBH and xylonase increased 50%, 43% and 12% respectively, in concentration applying activated charcoal comparable to standard source. Moreover, tests performed with nanofiltration membranes allowed 95% retention of the enzymes from the complex, and when they were used in the removal consisted of 10% and 20% in liquid phase in flasks, results showed a rise on the enzymatic activity. The tests 18/20, 24/10, 24/20, 44/10 and 44/20 ( in relation to filtration day and volume permeated) presented, on average, in 72 hours, a 33% increment in the endoglucanase activity and, in 96 hours, the test 44/20 presented activity superior to 40% from standard value. Therefore, for tests with Trichoderma reesei Rut C30, filtration experiments with 10% of the volume of the flasks in 12h and 20 h presented an increase in FPA activity, and in 60 h, the amount found was 15% and 11%, respectively. Subsequently, for endoglucanase enzyme, the activity presented increment levels evaluated in 40,7% and 52, 2% respectively for the mentioned tests, demonstrating the positive factor of the permeate 10% removal from the enzymatic production. Lastly, for FPA the rise represented 15% and 11% in the same test conditions.

Orientador: Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T01:20:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Schneider_DilaineRoseSilva_D.pdf: 11263694 bytes, checksum: 808a3a965f6f47fb9c2108a4c971b122 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A brusone do arroz (rice blast disease) causada pelo ascomiceto fitopatógeno Magnaporthe grisea continua a ter um enorme impacto nas culturas de arroz (Oryza sativa) no Brasil e no mundo. PWL2, uma proteína efetora, é um conhecido produto de um gene AVR (avirulência). O gene PWL2 impede que o fungo infecte weeping lovegrass (Eragrostis curvula). Neste trabalho nós identificamos em uma linhagem de M. grisea um gene que produz uma proteína diferente de PWL2, denominada PWL2D. A seqüência do gene PWL2D tem duas bases que diferem do gene PWL2, as quais produzem alterações nos resíduos de 90 e 142 da proteína. A alteração do resíduo 90 (de D90 para N90) é fundamental para a avirulência. Neste trabalho foram efetuadas a clonagem do gene PWL2D no vetor pET32-Xa/LIC, a expressão em Escherichia coli e a avaliação da estrutura de PWL2D por técnicas espectroscópicas. A proteína PWL2D fusionada à cauda TRX é propensa a agregação, e sua solubilidade é melhorada quando super-expressa sem o seu peptídeo-sinal original. Os resultados estruturais obtidos indicam que a proteína PWL2D possivelmente é intrinsecamente desordenada. Foi elaborado um modelo para a resistência/susceptibilidade do hospedeiro à M. grisea considerando a atuação de PWL2D como uma proteína intrinsecamente desordenada. Os resultados obtidos deverão facilitar a análise estrutural de PWL2D e podem contribuir para a compreensão da função do gene nas interações fungo / planta. Oito diferentes genes de M. grisea, além de PWL2D, foram também estudados neste trabalho. Dentre estes, destacam-se o gene que produz a xilanase XYL5 e seu domínio catalítico, o gene que codifica a chaperona ABC1 e seus dois domínios funcionais, e o gene que codifica a trealase PTH9, sendo todos estes relacionados à patogenicidade do fungo M. grisea. A xilanase XYL5 (EC 3.2.1.8) e seu domínio catalítico conservado (XYL5/DOM) foram fusionados à Maltose Binding Protein (MBP) ou à tiorredoxina (TRX) e expressas em E. coli. A produção de proteína solúvel e ativa foi influenciada pelo tipo de fusão. Os extratos solúveis contendo as proteínas de fusão MBP-XYL5 e MBP-XYL5/DOM apresentaram atividade xilanolítica em relação ao controle. Entretanto, durante o processo de purificação, a atividade foi perdida. Assim, obteve-se pela primeira vez o gene de patogenicidade XYL5 de M. grisea expresso com sucesso em E. coli e sua atividade enzimática xilanolítica foi demonstrada. Não foi possível expressar a chaperona ABC1 na forma solúvel nos sistemas de expressão utilizados, e a sequência gênica referente à trealase PTH9 - por mostrar a presença de introns após o seqüenciamento do gene amplificado na linhagem de M. grisea em estudo, mostrou-se inadequado para a sua expressão protéica no sistema de expressão procariótico utilizado durante a realização deste trabalho / Abstract: The rice blast disease caused by the ascomycete phytopathogen Magnaporthe grisea continues to have a huge impact on crops of rice (Oryza sativa) in Brazil and worldwide. PWL2, an effector protein, is a product of an AVR (avirulence) gene . The gene PWL2 prevents fungus from infecting weeping lovegrass (Eragrostis curvula). In this work we identified in a strain of M. grisea a gene that produces a protein different from PWL2, called PWL2D. The gene sequence PWL2D has two bases that differ from PWL2 gene, which produce changes in residues 90 and 142 of the protein. The change of residue 90 (from D90 to N90) is critical to avirulence. In this work it was realized the cloning of the gene in the vector PWL2D pET32-Xa/LIC, the expression in Escherichia coli and the assessment of PWL2D structure by spectroscopic techniques. The protein fused to the tag PWL2D TRX is prone to aggregation, and its solubility is improved when overexpressed without its original signal peptide. The structural results obtained indicate that possibly the protein PWL2D is intrinsically disordered. A model for the resistance/susceptibility of the host to M. grisea was developed considering the performance of PWL2D as an intrinsically disordered protein. The results should facilitate structural analysis of PWL2D and may contribute to the understanding of gene function in the interactions fungus/plant. Eight different genes of M. grisea, besides PWL2D, were also studied in this work. Among these, stands out the gene that produces xylanase XYL5 and its catalytic domain, the gene that codify the chaperone ABC1 and its two functional domains, and the gene that codify the trehalase PTH9, all them being related to the pathogenicity of the fungus M. grisea. The xylanase XYL5 (EC 3.2.1.8) and its retained catalytic domain (XYL5/DOM) were fused to the solubilizing proteins (MBP) or thioredoxin (TRX) and expressed into E. coli. The production of soluble and active protein was influenced by the type of fusion. The soluble extracts containing the fusion proteins MBP- XYL5 and MBP-XYL5/DOM showed xylanolytic activity compared to the control. However, during the purification process, the activity was lost. Thus, we obtained for the first time the gene pathogenicity XYL5 M. grisea expressed successfully in E. coli and its enzymatic xylanolytic activity was demonstrated. It was not possible to express the chaperone ABC1 in soluble form in the expression systems used, and the gene sequence related to trehalase PTH9 - by showing the presence of introns after the sequencing of the gene amplified in the strain of M. grisea under study, rendered inadequate for its protein expression in the prokaryotic system used during the realization of this work / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Francisco Maugeri Filho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-15T18:37:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Motta_FernandaLopes_M.pdf: 741375 bytes, checksum: 2dd5dcca312294d6118957b0bf359271 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O interesse no estudo dos sistemas das xilanases vem sendo estimulado pela sua utilidade em uma variedade de processos biotecnológicos. Estas enzimas podem ser aplicadas em indústrias de panificação, melhorando a textura, o volume da massa e o tempo de prateleira dos produtos; em vinícolas e cervejarias, favorecendo a etapa de filtração e a clarificação, além de ser adicionada à ração animal de aves e suínos para aumentar a digestibilidade. Diante da importância da aplicação das xilanases e da necessidade desenvolver condições que otimizem a produção dessas enzimas a fim de tornar sua utilização comercial menos restrita, estudos têm sido realizados visando obter maior produtividade e substratos de baixo custo. O objetivo deste trabalho foi otimizar a produção de xilanase a partir de uma cepa de levedura silvestre isolada da Mata Atlântica utilizada em estudo anterior, indicando potencial para produção de uma enzima estável. Duas cepas foram testadas inicialmente a fim de selecionar a mais adequada para este estudo. Uma vez selecionada, a cepa foi utilizada para testar a influência do tampão fosfato sobre a produção de xilanase e os resultados mostraram que a adição de tampão fosfato ao meio de cultura exerce um efeito negativo tanto em relação à biomassa da levedura quanto à produção e atividade da enzima. A partir desses resultados optou-se pela exclusão do tampão do meio e foi aplicado um planejamento experimental variando as condições de fermentação visando a otimização da produção da xilanase. Primeiramente, realizou-se um delineamento Plackett & Burman (PB) para determinar os efeitos principais das sete variáveis estudadas em relação à atividade enzimática, onde a temperatura e a concentração de xilanase foram consideradas estatisticamente significativas. Em seguida, realizou-se um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) de 11 ensaios onde as variáveis independentes foram aquelas consideradas significativas pelo PB. Os resultados obtidos pelos DCCR foram analisados por ferramentas estatísticas que confirmaram a confiabilidade do modelo preditivo para a atividade da enzima xilanase. De acordo com este modelo, a máxima atividade enzimática (67,45 UI) foi encontrada para os pontos centrais do planejamento, onde a concentração de xilana foi de 20 g.L-1 e a temperatura de 30°C / Abstract: The interest in the study of systems of xylanases has been stimulated by its usefulness in a variety of biotechnological processes. These enzymes could be applied to bakery, improving texture, volume and mass of the shelf life of products, wineries and breweries, supporting the step of filtration and clarification; also it could be added in poultry and pigs feed to increase digestibility. Due to this importance of application of xylanases and the necessity to develop conditions that optimize the production of these enzymes in order to make its commercial use less restricted, studies have been done to achieve higher productivity with low cost substrates. The objective of this work was to optimize the production of xylanase from a wild yeast strain isolated from Mata Atlântica. Two strains were tested initially in order to select the most appropriated one for this study. Once selected, it was tested the influence of phosphate buffer on the production of xylanase and the results showed that the addition of phosphate buffer to the culture medium has a negative effect on yeast biomass and activity enzyme produced. From these results it was decided to exclude the buffer used in medium and it was applied an experimental design aimed to optimize the conditions for xylanase production. At first, a design Plackett & Burman (PB) was done to determine the main effects of each variable studied in relation to enzymatic activity, where the temperature and the concentration of xylanase were considered statistically significant. Then, a central composite rotational design (DCCR) of 11 trials was carried out, where the independent variables were those considered significant by the PB. The results obtained by DCCR were analyzed by statistical tools that confirmed the reliability of the predict model to the xylanse activity enzyme. According to this model, the maximum enzyme activity (67,45 UI) was found at the central points of planning, where the concentration of xylan was 20 gL-1 and temperature of 30 ° C / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

As xilanases (EC 3.2.1.8), enzimas produzidas por diversos organismos, são capazes de hidrolisar as ligações -1,4 da cadeia principal da xilana, o mais abundante polissacarídeo hemicelulósico da natureza. O grande potencial biotecnológico das xilanases consiste na sua aplicação nas etapas de branqueamento do papel, nas quais a xilana é hidrolisada sob condição de temperatura elevada para facilitar a remoção da lignina (substância responsável pela coloração), diminuindo a quantidade de compostos clorados utilizados nestas etapas. A termoestabilidade e a especificidade pela xilana são as propriedades responsáveis pelo grande interesse biotecnológico e comercial que as xilanases têm atraído. As xilanases mesofílica, XBC, de temperatura ótima 55ºC (produzida pela bactéria Bacillus circulans) e termofílica, XTL, de temperatura ótima 70ºC (produxida pelo fungo Thermomyces lanuginosus) foram estudadas comparativamente por simulação de dinâmica. Os sistemas foram modelados pelo campo de força GROMOS-96(43A1) e as simulações realizadas pelo programa GROMACS 3.2. O objetivo do trabalho é relacionar as diferenças estruturais, energéticas e dinâmicas com as diferentes termostabilidades exibidas por estas enzimas. Os estudos por simulação sugerem claramente a existência de dois grandes tipos de regiões nas enzimas xilanases XBC e XTL: uma conservada e de grande estabilidade, que é o domínio palma, e a outra que pode sofrer grande movimentação, no caso o domínio polegar. Uma movimentação do tipo abre-fecha de dobradiça foi identificada. O monitoramento das ligações de hidrogênio inter/intramoleculares e pontes salinas ao longo do tempo e em função da temperatura permitem explicar clara e detalhadamente as diferentes termoestabilidades exibidas por duas proteínas da mesma família que compartilham de uma estrutura tridimensional altamente semelhante. Foi possível identificar 14 resíduos carregados que estão presentes na XTL e ausentes na XBC, tais resíduos devem ser considerados sítios potenciais de mutação na XBC. De uma maneira geral, tanto na XBC quanto na XTL, a presença do substrato não altera as características de cada domínio/região mas confere estabilidade para o domínio polegar. Nenhuma diferença clara na afinidade pelo substrato foi detectada pelas interações intermoleculares proteína-substrato. / The enzymes xylanases (EC 3.2.1.8) are produced by several microorganisms and used to hydrolyze the -1,4 bonds of the xylan main chain, the most abundant hemicellulose in nature. The great biotechnological potential of the xylanases is due to its application in the pulp-bleaching processes when the xylan is hydrolyzed under high temperature condition to optimize the lignin removal. This procedure presents the advantage to reduce the amount of chlorine chemicals used in the pulp-bleaching process. The required properties of a biotechnologically useful xylanase include thermostability and high affinity for xylan. The mesophilic, XBC, (from Bacillus circulans) and thermophilic, XTL, (from Thermomyces lanuginosus) xylanases were studied by molecular dynamics simulations. The primary structures of these enzymes are almost completely different while the tertiary structures are identical. The objective of the study is to get some insight on the factors that are responsible for the xylanase thermostability. The systems were modeled by the GROMOS96-(43A1) force field and the molecular dynamic simulations were performed by the GROMACS 3.2 package in the temperature range from 25 to 80ºC. The results obtained with both xylanases were compared. The existence of two kinds of regions was identified in XBC and XTL: the first one conserved and highly stable is formed by the so-called palm and fingers domains. The second region exhibits large movements: this is the thumb domain. A kind of open-close motion was identified that maybe can facilitate the access of the xylane to the active center. The inter/intramolecular hydrogen bonds and salt bridges allow to explain at great length the thermostability differences between the two enzymes. It was possible to identify 14 charged residues present in the XTL with no similar in the XBC: such residues must be considered outstanding mutation sites in XBC. In the presence of the substrate, the characteristics of each domain/region are not modified but the stability of the thumb domain is increased. No difference in the affinity for the substrate was detected between the xylanases and it can be suggested that the activation energies are similar. Two water molecules were found in the active site supporting the hydrolysis mechanisms proposed in the literature.

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Eduardo da Silva Martins / Resumo: Xilanases são enzimas que agem na despolimerização da cadeia de xilana, principal componente da hemicelulose. Elas possuem diversas aplicações industriais tais como, na indústria de alimentos, do papel e de bioenergia. Neste contexto, há destaque para a produção de xilo-oligossacarídeos (XOS), que são considerados prebióticos. Estes possibilitam que probióticos sejam capazes de modular positivamente a microbiota intestinal, causando benefícios ao indivíduo hospedeiro. Nesse sentido, a busca de xilanases microbianas destaca-se como uma estratégia sustentável para a produção de prebióticos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar uma xilanase do fungo Myceliophthora heterothallica F.2.1.4 e aplicar esta e duas xilanases recombinantes GH11 do referido fungo para obtenção de XOS. A enzima nativa purificada, com massa molecular estimada em 27 kDa, apresentou atividade máxima em pH 4,5 e 65 °C, e manteve média maior que 90% de sua atividade residual quando exposta a temperaturas entre 30 e 60 °C por 1 hora. Essa enzima pode ser caracterizada como uma endoxilanase pertencente à família GH11. Foram produzidos XOS do bagaço pré-tratado com ozonólise seguida de extração alcalina, xilana extraída do bagaço in natura e xilana beechwood. Os produtos da hidrólise enzimática dos diferentes substratos foram identificados por eletroforese capilar e/ou HPAE-PAD, sendo que o hidrolisado de xilana beechwood pela xilanase nativa purificada, após 12 horas de hidrólise,... / Abstract: Xylanases are enzymes that act in depolymerization of the xylan chain, the main component of hemicellulose. They have various industrial applications such as, food, paper and bioenergy industries. In this context, highlight the production of xylooligosaccharides (XOS), which are considered prebiotics. The XOS can be used with probiotic microorganisms to be able to positively modulate an intestinal microbiota, presenting benefits to the individual host. In this sense, a search for microbial xylanases stands out as a sustainable strategy for a production of prebiotics. Therefore, the objective of this work was to purify and characterize an xylanase of the fungus Myceliophthora heterothallica F.2.1.4 and to apply two recombinant enzymes of the same fungus to produce XOS. The enzyme, with the molecular weight estimated at 27 kDa, is at the maximum temperature of 4.5 and 65 °C, and continues more than 90% of its residual activity when exposed to temperatures between 30 and 60 °C for 1 hour. The purified native enzyme is presented as an endoxylanase for the GH11 family. XOS was produced from pretreated bagasse with ozonolysis followed by alkaline extraction, xylan extracted from the bagasse in natura and beeechwood xylan. The products of the enzymatic hydrolysis of the different substrates were identified by capillary electrophoresis and/or HPAE-PAD, being that the beechwood Xylan hydrolysate by xylanase purified native, after 12 hours of hydrolysis, showed 234.2 mg/g of xylan. Evaluated enzymes have potential for applications in the production of xylooligosaccharides for use as prebiotics / Mestre

Orientador: Lara Durães Sette / Banca: André Rodrigues / Banca: Rafaella Costa Bonugli Santos / Resumo: As coleções de culturas de micro-organismos apresentam importante contribuição para a preservação, manutenção e disponibilização de material microbiológico para uso acadêmico e em pesquisa. A Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP) tem como missão dar suporte ao conhecimento da biodiversidade microbiana, bem como ao desenvolvimento científico e tecnológico, apoiando projetos de relevância. A CRM-UNESP possui um acervo associado de fungos filamentosos e leveduras de ambientes incomuns e/ou extremos. Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo reorganizar o acervo de fungos marinhos da costa brasileira, marinhos e terrestres da Antártica e prospectar as enzimas xilanase e L-asparaginase. Para tanto, cerca de 696 fungos marinhos oriundos da costa brasileira e 185 fungos isolados de ambientes antárticos foram avaliados quanto à viabilidade e pureza, fotografados e preservados por dois métodos distintos: criopreservação e Castellani. Destes, 71% dos isolados foram considerados puros e viáveis e submetidos às triagens quantitavas e qualitativas para enzima xilanase e L-asparaginase. Na triagem qualitativa (meio sólido) 112 fungos produtores de xilanase foram isolados de ambiente marinho da costa brasileira e 19 de ambiente antártico. Estes foram submetidos à triagem quantitativa (meio liquído), na qual, o fungo LAMAI 31 identificado como Aspergillus tubingensis apresentou o melhor resultado de produção enzimática (49,41 U/mL). Para a enzima L-asparaginase além dos 622 isolados, 17 fungos filamentosos adicionais foram analisados na triagem qualitativa, totalizando 510 de origem marinha da costa brasileira e 129 de origem Antártica. Dentre estes, 407 fungos foram positivos para L-asparaginase em meio sólido e foram submetidos à triagem em meio liquido. A L-asparaginase foi produzida na faixa de 0,02 a 1,65 U/mL por 103 isolados. Delineamentos experimentais foram aplicados aos isolados que... / Abstract: Microbial culture collections have an important contribution to the preservation, maintenance, and availability of the microbial material for academic and research pourpose. The mission of the Central of Microbial Resources of the UNESP (CRM-UNESP) is to provide support for the knowledge of the microbial biodiversity, as well as for the scientific and technological development, supporting relevant projects. CRM-UNESP has an associated collection of filamentous fungi and yeast from uncommon and/or extreme environments. In this context, the present study aims to reorganize the marine-derived fungal collection from brasilian coast and the marine and terrestrial collection from Antarctica and to prospect the enzymes xylanase and L-asparaginase. For that end, about 696 marine fungi originating from brasilian coast and 185 isolated from antarctic environments had their viability and purity assessed and were photographed and preserved by two different methods: criopreservation and Castellani. Among them, 71% isolated were considered pure and viable and were submitted to the quantitative and qualitative screening for the production of xylanase and L-asparaginase. In the qualitative quantitative screening (solid medium) 112 filamentous fungi able to produce xilanases were isolated from marine environment (brasilian coast) and 19 from the antartic environment. These isolates were submitted to quantitative screening (liquid medium), in which, the fungus LAMAI 31 indentified as Aspergillus tubingensis presented the best result of enzymatic production (49.41 U/mL). For L-asparaginase besides the 622 isolates, 17 additional filamentous fungi were analysed, being 510 originated from the brasilian marine coast and 129 from Antarctica. Among them, 407 fungi were positive for L-asparaginase in solid medium and were submitted to the screening in liquid medium. L-asparaginase was produced in a range of 0.02 to 1.65 U/mL by 103 isolated. Experimental designs ... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO DE MESTRADO FINAL.pdf: 1117246 bytes, checksum: 91bcbcfc247218ffb970c121596f7b0c (MD5) Previous issue date: 2010-08-30 / The vegetal biomass consists mainly of cellulose, hemicellulose and lignin. Cellulose is the most abundant polymer and xylan is the main component of hemicellulose. The conversion of cellulose and xylan to glucose and xylose can be realized by an enzymatic complex found in secretions of microorganisms such as fungi and bacteria. Enzymatic hydrolysis is an important step to the bioconversion of cellulosic and hemicellulosic fraction from lignocellulosic wastes. The thermophilic fungus Humicola grisea var thermoidea produces an efficient complex of cellulolytic enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases and β-glucosidase) and xylanolytic (endoxylanase and β-xylosidase) with high thermostability when grown on different lignocellulosic substrates. The aim of this study was to analyze the kinetics of production of cellulases and xylanase by the fungus H. grisea cultivated on medium containing rice straw (RS), corncob (CC), crushed cane sugar bagasse (CSB) and wheat bran (WB) as carbon source and subsequently analyze the profile of proteins with cellulolytic and xylanolytic activity secreted by the fungus when grown in minimal medium, by liquid fermentation, containing the substrates at concentrations of 1, 2 and 3% and maintained at 42 ° C, 120 rpm for different times. The best results were obtained when the fungus was grown in 3% BCA and FT, the peaks of FPase (0.17 U / mL) and CMCase (3.54 U / mL) were observed after 192 h of growth with 3% BCA , peak avicelase (0,195 U / mL) after 48 h with 3% FT and peak xylanase (23.75 U / mL) after 216 h with 3% FT. The results showed that the best inducer of enzyme production with FPase and CMCase activity was the CSB and the best inducer of enzymes production with xylanase and avicelase activity was the WB. In profile analysis of proteins secreted by H. grisea by SDS-PAGE (216 h) and zymogram (144 h), no band was seen when the fungus was grown in the presence of glucose, suggesting catabolite repression. However, two very strong protein bands corresponding to HXYN2 (23 kDa) and CBH1.2 (47 kDa) were visualized in the gels containing CSB (2 to 3%) and WB (2 and 3%). These enzymes are the main xylanolytic and cellulolytic systems of the fungus, respectively. Were monitored by recombinant enzymes from H. grisea (in gels), an endoxylanase HXYN2r (23 kDa), an cellobiohydrolase CBH1.2r (47 kDa). The masses full profile of H. grisea can be seen in Figures 13, 14, 15, 16, 18 and 19. / A biomassa vegetal é constituída principalmente de celulose, hemicelulose e lignina. A celulose é o polímero mais abundante e a xilana o principal componente hemicelulósico. A conversão da celulose e da xilana à glicose e xilose pode ser realizada por um complexo enzimático encontrado nas secreções de microrganismos tais como fungos e bactérias. A hidrólise enzimática é um importante passo para a bioconversão da fração celulósica e hemicelulósica de resíduos lignocelulósicos. O fungo termofílico Humicola grisea var thermoidea produz um eficiente complexo de enzimas celulolíticas (endoglicanases, celobiohidrolases e β-glicosidases) e xilanolíticas (endoxilanases e β-xilosidase) com alta termoestabilidade quando cultivado em diferentes substratos lignocelulósicos. O objetivo desse trabalho foi analisar a cinética de produção de celulases e xilanases pelo fungo H. grisea cultivado em meio contendo palha de arroz (PA), sabugo de milho (SM), bagaço de cana-de-açúcar (BCA) e farelo de trigo (FT) como fonte de carbono e posteriormente analisar o perfil de proteínas com atividade celulolítica e xilanolítica secretadas pelo fungo quando cultivado em meio mínimo, por fermentação líquida, contendo os substratos nas concentrações de 1, 2 e 3%, e mantidos a 42 °C, 120 rpm por diferentes tempos. Os melhores resultados foram obtidos quando o fungo foi cultivado em 3% de BCA e FT, sendo que os picos de FPase (0.17 U/mL) e CMCase (3.54 U/mL) foram observados após 192 e 240 h respectivamente de crescimento com 3% de BCA, o pico de Avicelase (0.195 U/mL) após 48 h com 3% de FT e o pico de xilanase (23.75 U/mL) após 216 h com 3% de FT. Os resultados demonstraram que o melhor indutor da produção de enzimas com atividade de FPAse e CMCase foi o BCA e o melhor indutor da produção de enzimas com atividade de Avicelase e xilanase foi o FT. Na análise do perfil de proteínas secretadas pelo H. grisea por SDS-PAGE (216 h) e zimograma (144 h), nenhuma banda foi visualizada quando o fungo foi cultivado na presença de glicose, sugerindo repressão catabólica. Entretanto, duas bandas protéicas muito fortes, correspondentes à HXYN2 (23 kDa) e CBH1.2 (47 kDa) foram visualizadas nos géis contendo BCA (2 e 3%) e FT (2 e 3%); e representam as principais enzimas dos sistemas xilanolítico e celulolítico do fungo, respectivamente. Estas foram monitoradas pelas enzimas recombinantes do H. grisea (nos geis): uma endoxilanase HXYN2r (23 kDa) e uma celobiohidrolase CBH1.2r (47 kDa). As massas do perfil completo do H. grisea podem ser vistas nas Figuras 13-19.

Proteínas tipicamente são capazes de manter a sua conformação funcional somente dentro de um intervalo limitado de temperaturas. A despeito do maquinário sofisticado de manutenção da homeostase celular, é sabido que uma variedade de fenômenos moleculares são capazes de induzir desequilíbrios localizados de energia vibracional, e que a eficiência com que cada proteína dissipa estas perturbações pode estar relacionada com a sua tolerância a altas temperaturas. No entanto, a transferência de energia térmica entre diferentes segmentos de uma cadeia proteica é difícil de caracterizar experimentalmente. Uma alternativa teórica para a investigação destes mecanismos é o emprego de simulações de Dinâmica Molecular, particularmente associadas à técnica de Difusão Térmica Anisotrópica (ATD). Aqui, verificamos a possibilidade de empregar conceitos da teoria de Redes Complexas para construir modelos para estruturas de proteínas, e por meio destes identificar resíduos com capacidade significativa de dissipar perturbações térmicas. Investigamos os diversos protocolos de construção de modelos de rede para proteínas encontrados na literatura, e utilizamos dados experimentais representativos da base SCOP para calcular com rigor os parâmetros numéricos necessários. Produzimos uma definição precisa para o conceito de contato entre resíduos de aminoácidos, e a partir desta calculamos a centralidade de cada resíduo. Com isto, demonstramos que, em um conjunto de Xilanases para as quais dispomos de dados de ATD, a capacidade de difundir perturbações térmicas é fortemente correlacionada com a centralidade de proximidade de cada resíduo, fornecendo argumentos para o uso de modelos de rede para estudar a termoestabilidade de proteínas. / Proteins are typically able to mantain a functional conformation only within a narrow range of temperatures. In spite of the complex cellular homeostatic machinery, it is known that a variety of molecular phenomena can induce localized vibrational imbalances, and that the efficiency with which each protein dissipates these perturbations may be related to its tolerance of higher temperatures. The transference of thermal energy among different sections of a protein chain is, however, hard to characterize experimentally. A theoretical alternative for the investigation of these mechanisms is the use of Molecular Dynamics simulations, particularly when associated with the Anisotropic Thermal Diffusion (ATD) technique. In this work, we verify the possibility of using concepts from Network Theory to construct models for protein structures, and using those to reveal residues with significant ability to dissipate thermal perturbations. We investigate several protocols of network model construction for proteins present in the literature, and we study representative experimental data from the SCOP database to rigorously calculate the necessary parameters. We produce a precise definition for the concept of contact between amino acid residues, and from this we calculate the centrality of each residue. We then show that, in a set of Xylanases for which we have data from ATD experiments, the ability to dissipate thermal perturbations is highly correlated to the closeness centrality of each residue, providing arguments for the use of network models to study protein thermal stability.