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In this thesis the optical method of Near-Infrared-Spectroscopy (NIRS) is evaluated with regards to its capability of non-invasive detection of Leão´s cortical spreading depression (CSD) and spontaneous peri-infarct-depolarizations (PID). With the NIR-spectrometer NIRO 500 (Hamamatsu, Japan) regional cerebral oxy-genation (rCBO) changes were measured during CSD in 9, and during PID in 10 barbiturate anesthatized rats. The method if NIRS that relies on oxygen-dependent absorption changes of hemo-globin and cytochrome oxydase as well as the high penetrability of biologic tissues for light in the range between 700 and 1000 nm proved suitable to detect and to distinguish both CSD and PID experimentally. This distinction relies on the robust decrease of deoxy- and increase of oxyhemo-globin concentrations (i.e. a relative hyperoxemia) during CSD while PID is cha-racterized by an initial increase of deoxy- and decrease of oxyhemoglobin (relative hypooxemia). Despite the profound anatomical differences between gyrencephalic humans and lyssencephalic rats, the observed patterns of rCBO changes may guide the inter-pretation of future NIRS measurements in patients with migraines with aura (CSD) or stroke (PID). However, for concentration changes of oxydized cytochrome aa3 with its low con-centration compared to the hemoglobins, the pathophysiological interpretation of the data obtained with NIRO 500 is confounded by the limits of attenuation mea-surements at only four wavelengths. A validation of the cytochrome oxydase signal and an improved quantification of all concentration changes is highly desirable and may be achieved by employment of a continuous-wavelength device measuring the full spectral range of the near infrared. It would also allow to measure the mean optical pathlength in the highly scattering tissue and to correct for its physiologically occuring changes e.g. by measurements at the water absorption peak. Similar improvements would enhance the value of the method for further physiolo-gical and pathophysiological studies because NIRS provides the unique opportu-nity to obtain simultaneous data on blood oxygenation as well as the redox state of the mitochondrial cytochrome oxydase.

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Unterschiedliche zerebrale Protektionssysteme zur Verhinderung neurologischer Ereignisse während einer Karotis-Angioplastie sind derzeit im Einsatz. Dennoch zeigen Studien, dass diese Systeme die distale Mikroembolisation während der Intervention nicht vollständig verhindern können. Die vorliegende Arbeit vergleicht die Effektivität von zwei verschiedenen Protektionssystemen unter Anwendung der Methode der transkraniellen Dopplersonographie (TCD). Es wurden 42 Patienten mit einer hochgradigen Stenose der A. carotis interna während der Karotisangioplastie mit Stentimplantation untersucht. Zur Neuroprotektion wurde entweder ein Filtersystem (E.P.I. FilterWireTM, Boston Scientific, USA) oder ein proximales Ballonokklusionssystem (MO.MA-System Invatec, Italien) verwendet. Bei jedem Patienten erfolgte während der Intervention mittels TCD die Detektion der mikroembolischen Signale (MES). Die Anzahl der MES wurde während fünf verschiedener Prozedurphasen gezählt und miteinander verglichen. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass die Karotis-Angioplastie unter Schutz des MO.MA-Systems vor allem in den Phasen der Passage der Stenose, der Stentimplantation und der Nachdilatation mit signifikant niedrigeren MES assoziiert war, verglichen zur Angioplastie der A. carotis interna unter einem Filtersystem.

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Alzheimer-Demenz als häufigste Demenzform wird vorrangig als eigenständige neurodegenerative Erkrankung gesehen, teilt jedoch mit dem akuten Schlaganfall einige Risikofaktoren. Das Alter scheint dabei der zentrale Faktor zu sein, der die Überlappung beider Erkrankungen erklärt, da sowohl kardiovaskuläre Risikofaktoren wie arterielle Hypertonie, Hypercholesterinämie und Diabetes als auch die Häufigkeit der Alzheimerschen Erkrankung und der zerebralen Ischämie mit steigender Lebenszeit zunehmen. Das steigende Interesse an der genauen Aufklärung der Pathomechanismen beider Erkrankungen, kann mit dem demografischen Wandel begründet werden, aus dem die erhebliche absolute Zunahme beider Erkrankungen resultiert und ein enormer volkswirtschaftlicher Kostenaufwand erwächst. \\Experimentelle Studien sowie klinische Beobachtungen lassen vermuten, dass es einen kausalen Zusammenhang zwischen der Alzheimerschen Erkrankung und dem Schlaganfall gibt. Es wurde gezeigt, dass Patienten mit einer zerebralen Ischämie in der Anamnese ein erhöhtes Risiko haben an der Alzheimerschen Demenz zu erkranken. Zudem wurde nachgewiesen, dass chronische Hypertonie und experimentelle Schlaganfall-Induktion Alzheimer-artige Veränderungen verursachen, wie z.B. höhere Konzentration von APP und Tau-Phosphorylierung. Gleichsinnig dazu haben Alzheimer-Patienten zum einen ein erhöhtes Risiko für ein ischämisches Ereignis, zum anderen ist das Auftreten eines Schlaganfalls bei Alzheimer-Patienten mit einer schlechteren Prognose vergesellschaftet. Es wurde postuliert, dass $\beta$-Amyloid und Ischämie bei gemeinsamem Auftreten schlechtere Konsequenzen hervorrufen, als wenn diese Faktoren einzeln vorkommen. \\Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass ischämische Ereignisse, insbesondere mildere Formen, in Anwesenheit von hohen Konzentrationen an $\beta$-Amyloid größere Infarktvolumina, eine fulminantere Entzündungsreaktion und einen schwereren Gedächtnisverlust verursachen im Vergleich zum alleinigen Auftreten von Ischämie oder $\beta$-Amyloid. Die offensichtliche wechselseitige Beeinflussung der pathologischen Veränderungen erschwert die Konzipierung erfolgreicher Behandlungsstrategien. Daher wandten sich verschiedene Forschungsgruppen ab von den Angriffspunkten an typischen Merkmalen der Alzheimerschen Erkrankung (wie $\beta$-Amyloid, Tau-Hyperphosphorylierung und cholinerge Dysfunktion) hin zu einem komplexeren Denkansatz mit Berücksichtigung von Neuronen in Assoziation mit Gefäßstrukturen sowie Astro- und Mikroglia, zusammengefasst als neurovaskuläre Einheit (NVU). Das Verstehen der komplexen neurovaskulären Pathologie im Alzheimer-Ischämie-Kontext sollte zur Entwicklung neuerer, spezifischer Behandlungsstrategien führen. \\Die vorliegende Studie fokussierte dabei auf cholinerge, Cholinazetyltransferase (ChAT)-immunpositive, und katecholaminerge, Tyrosinhydroxylase (TH)-immunpositive, Nervenfasern in Assoziation mit endothelialen Gefäßstrukturen, um die NVU im Alzheimer-Gehirn mit begleitendem Schlaganfall zu untersuchen. Ein Schwerpunkt lag dabei auf der Analyse der ChAT als dem Enzym, dessen Aktivitätsverlust in Zusammenhang mit der altersabhängigen Degeneration von cholinergen Neuronen im basalen Vorderhirn steht. Die Degeneration des cholinergen Systems ist nachweislich involviert in die Progression der Alzheimerschen Erkrankung sowie mitverantwortlich für einen kognitiven Funktionsverlust, bedingt durch Aβ-Vorkommen und Tau-Phosphorylierung. \\Für die vorliegende Studie wurde in Wildtyp-Mäusen und triple-transgenen (3xTg) Mäusen verschiedener Altersgruppen (3 und 12 Monate) eine unilaterale fokale zerebrale Ischämie induziert. Die 3xTg-Mäuse vereinigen zwei menschliche Transgene (Amyloid-Präkursorprotein und Tau) und sind homozygot für das Knock-in-Konstrukt Präsenilin. Zusätzlich wurden drei 2 Jahre alte 3xTg-Mäuse untersucht um altersabhängige Alzheimer-artige Merkmale nachzuweisen. \\Histochemische Analysen dienten zum Vergleich der neuronalen und vaskulären Komponenten der NVU sowie der Alzheimer-spezifischen Merkmale. Fluoreszenzmarkierungen bestätigten die Existenz Alzheimer-typischer Charakteristika wie $\beta$-Amyloid-Vorkommen und Phospho-Tau zusammen mit glialen Reaktionen und morphologisch verändertem Endothel, das mit \textit{Solanum tuberosum} Lektin (STL, Kartoffellektin) dargestellt wurde. Neben deutlichen morphologischen Veränderungen der Gefäßstrukturen kam es 24 Stunden nach Ischämie-Induktion zu einem drastischen Rückgang der Immunreaktivität für TH und ChAT als neuronalen Komponenten der NVU, vor allem im ischämie-betroffenen Striatum aber auch in ischämiefernen Arealen wie der ischämischen Grenzzone und dem ipsilateralen Neokortex. Aufgrund von Korrelationsanalysen, die eine gleichsinnige Degeneration des cholinergen Systems und des Endothels gezeigt haben, kann man von gleichzeitigen Veränderungen multipler Zelltypen innerhalb der NVU im Ischämie-betroffenen Gehirn mit Alzheimer-Phänotyp ausgehen. Ausgeprägter erschien der beschriebene Effekt auf cholinerge Komponenten jüngerer Mäusen zuzutreffen. Die vorgelegten Ergebnisse unterstreichen das komplexe Zusammenspiel der verschiedenen Zelltypen innerhalb der NVU im Alzheimer-Gehirn mit ischämischen Veränderungen, einschließlich der Veränderungen des cholinergen Systems in Verbindung mit vaskulären Pathologien. Daher sollten neue Behandlungsstrategien neben bereits etablierten Ansätzen gegen neuronale Degeneration und Tau-Phosphorylierung auch auf zellulärer Ebene eingreifen, z.B. durch Stabilisierung der Integrität von endothelialen und glialen Elementen, eingreifen. Derartige Strategien könnten die Krankheitsentwicklung verzögern und das Krankheitsbild mildern.

Es gibt zunehmend Hinweise, dass zerebrale Mikroangiopathie die Anzahl von Hirnmetastasen reduziert. Faktoren, die die Anzahl und Größe von Hirnmetastasen beeinflussen, sind bis heute nur unzureichend definiert. Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen, ob vaskuläre Risikofaktoren (arterielle Hypertension, Diabetes mellitus, Rauchen und Hypercholesterinämie) und dadurch entstehende Blutgefäßveränderungen wie die periphere arterielle Verschlusskrankheit (PAVK) die Anzahl von Hirnmetastasen beeinflussen können.:VORWORT 5 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 6 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 8 1. EINFÜHRUNG 9 1.1. Maligne Tumoren – Epidemiologie und Entstehung einer „Volkskrankheit“ 9 1.1.1. Epidemiologie 9 1.1.2. Maligne Tumoren - Entstehung 10 1.2. Zerebrale Metastasierung – Häufigkeit, Mechanismen, Prognose, Therapie 15 1.2.1. Hirnmetastasen - Häufigkeit 15 1.2.2. Mechanismen 16 1.2.3. Therapie und Prognose 17 1.3. Arteriosklerose und vaskuläre Risikofaktoren 18 1.3.1. Arteriosklerose 18 1.3.2. Vaskuläre Risikofaktoren 21 1.3.2.1. Diabetes mellitus 23 1.3.2.2. Hypercholesterinämie 25 1.3.2.3. Arterielle Hypertension 28 1.3.2.4. Rauchen 30 1.3.2.5. PAVK 31 1.4. Hirnmetastasen und Hirngefäße – besteht ein relevanter Zusammenhang? 33 1.4.1. Gefäßversorgung des Gehirns 33 1.4.2. Hirnmetastasen und Hirngefäße 35 1.5. Vaskuläre Risikofaktoren und maligne Tumorerkrankungen 36 1.5.1. Blutversorgung von Tumoren 36 1.5.2. Metastasierung 38 1.5.3. Wechselwirkungen zwischen vaskulären Risikofaktoren und Metastasen 41 1.6. Zielsetzung und Rationale der retrospektiven Studie 42 2 VORBEMERKUNG ZUR PUBLIKATION 44 3 PUBLIKATION 46 4 ZUSAMMENFASSUNG 51 5. LITERATURVERZEICHNIS 59 6. ANLAGEN 65 DARSTELLUNG DES EIGENEN BEITRAGS 65 SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 67 LEBENSLAUF 68 PUBLIKATIONEN 69 DANKSAGUNG 71 / There is increasing evidence that cerebral microangiopathy reduces number of brain metastases. Aim of this study was to analyse if vascular risk factors (arterial hypertension, diabetes mellitus, smoking and hypercholesterolemia) or the presence of peripheral arterial occlusive disease (PAOD) can have an impact on number or size of brain metastases.:VORWORT 5 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 6 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 8 1. EINFÜHRUNG 9 1.1. Maligne Tumoren – Epidemiologie und Entstehung einer „Volkskrankheit“ 9 1.1.1. Epidemiologie 9 1.1.2. Maligne Tumoren - Entstehung 10 1.2. Zerebrale Metastasierung – Häufigkeit, Mechanismen, Prognose, Therapie 15 1.2.1. Hirnmetastasen - Häufigkeit 15 1.2.2. Mechanismen 16 1.2.3. Therapie und Prognose 17 1.3. Arteriosklerose und vaskuläre Risikofaktoren 18 1.3.1. Arteriosklerose 18 1.3.2. Vaskuläre Risikofaktoren 21 1.3.2.1. Diabetes mellitus 23 1.3.2.2. Hypercholesterinämie 25 1.3.2.3. Arterielle Hypertension 28 1.3.2.4. Rauchen 30 1.3.2.5. PAVK 31 1.4. Hirnmetastasen und Hirngefäße – besteht ein relevanter Zusammenhang? 33 1.4.1. Gefäßversorgung des Gehirns 33 1.4.2. Hirnmetastasen und Hirngefäße 35 1.5. Vaskuläre Risikofaktoren und maligne Tumorerkrankungen 36 1.5.1. Blutversorgung von Tumoren 36 1.5.2. Metastasierung 38 1.5.3. Wechselwirkungen zwischen vaskulären Risikofaktoren und Metastasen 41 1.6. Zielsetzung und Rationale der retrospektiven Studie 42 2 VORBEMERKUNG ZUR PUBLIKATION 44 3 PUBLIKATION 46 4 ZUSAMMENFASSUNG 51 5. LITERATURVERZEICHNIS 59 6. ANLAGEN 65 DARSTELLUNG DES EIGENEN BEITRAGS 65 SELBSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 67 LEBENSLAUF 68 PUBLIKATIONEN 69 DANKSAGUNG 71

In der vorliegenden experimentell durchgeführten Dissertation wurden neue Mutationen im FOLR1-Gen molekular charakterisiert. Die untersuchten Mutationen führten zu Veränderungen im Folatrezeptor α, einem von Zellen des Plexus choroideus exprimierten Protein, welches den Haupttransporter von  5-MTHF über die Blut-Liquor-Schranke darstellt. Mutationen im FOLR1-Gen sind kürzlich als Ursache einer zerebralen Folattransport-Defizienz identifiziert worden. Diese Erkrankung gehört zu einer Gruppe neurologischer Störungen, die sich durch isoliert niedrige Liquorfolatwerte  auszeichnen und zusammenfassend als zerebrale Folatdefizienz bezeichnet werden. Die zerebrale Folattransportdefizienz manifestiert sich typischerweise im frühen Kleinkindesalter und äußert sich klinisch in Form einer chronisch-progredienten psychomotorischen Regression mit zerebralen Krampfanfällen und einer durch MRT nachweisbaren Myelinisierungsstörung. Eine Substitution mit  5‘-Formyltetrahydrofolat konnte bei der Mehrzahl der identifizierten Patienten eine partielle Remission der Symptome bewirken.  Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier Mutationen im FOLR1-Gen hinsichtlich ihrer molekularen Auswirkungen auf die Proteinxpression, die Funktionalität bzw. Rezeptor-Bindungsfähigkeit und die Lokalisation des Proteins untersucht. Bei den Mutationen handelt es sich um zwei neue, aus Patienten-DNS identifizierte Punktmutationen, p.C169Y und p.N222S, sowie die bereits beschriebenen FRα-Mutanten p.C105R und FRα p.K44_P49dup.  Die heterologe Expression der mutanten Folatrezeptoren zeigte in Westernblot-Analysen keine signifikanten Veränderungen der Protein-Expressionsrate, verglichen mit dem Wildtyp-Protein. Allerdings bestand eine stark verminderte Rezeptor-Folsäurebindung in radioaktiven Bindungsassays. Ein funktioneller Unterschied zwischen den einzelnen Mutanten konnte im Verlauf der Experimente identifiziert werden. Die FRα-Proteinmutanten p.N222S und p.K44_P49dup zeigten verglichen mit den anderen Mutanten eine höhere Folsäure-Restbindung von ca. 20 % des Wildtypproteins. Im Rahmen von Immunfluoreszenzmikroskopien konnte gezeigt werden, dass die FRα-Mutante p.K44_P49dup partiell zellmembranständig, entsprechend dem FRα-Wildtyp, exprimiert wurde. Die übrigen untersuchten Proteinmutanten zeigten in intrazellulären Kompartimenten zumindest teilweise eine Kolokalisation mit dem Marker des endoplasmatischen Retikulums. Alle Untersuchungen wurden mit transfizierten CHO-K1-Zellen durchgeführt und konnten in zwei polaren Zelllinien, immortalisierten Epithelzellen des Plexus choroideus (Z310) und humanen Leberzellkarzinomzellen (HepG2) bestätigt werden. Die Ergebnisse dieser Dissertation sind Bestandteil einer kürzlich in BRAIN veröffentlichten Arbeit (Grapp et al. 2012) und tragen zum besseren Verständnis der molekularen Grundlagen der zerebralen Folattransport-Defizienz, einer neuerkannten, behandelbaren neuropädiatrischen Erkrankung, bei. Die  Pathogenität der untersuchten FOLR1-Mutationen wird auf molekularer Ebene belegt. Die Bedeutung dieser molekulargenetischen Untersuchungen besteht darin, dass eine frühzeitige Folat-Behandlung erkrankter Kinder zu einer deutlichen Verbesserung der Symptome führt.

Ziel der vorliegenden Arbeit war, die pathogenetische Bedeutung von dynamischen Zellzyklusveränderungen nach transienter fokaler Ischämie zu analysieren. Als in-vivo-Modell des humanen Schlaganfalls wurde eine 30-minütige Fadenokklusion der A. cerebri media (MCAo) in der Maus gewählt. In diesem Modell findet ein zeitlich verzögerter selektiver Zelluntergang von striatalen Projektionsneuronen bei relativer Aussparung von Gliazellen und Interneuronen statt. Somit entspricht dieses Modell dem humanpathologischen Konzept der "elektiven Parenchymnekrose". Als in-vitro-Modell wurde eine 90-minütige Sauerstoff-Glukose-Deprivation (OGD) der primären neuronalen Zellkultur eingesetzt. Die Experimente wurden parallel in vivo und in vitro durchgeführt. Wir konnten zeigen, daß alle adulten striatalen Neurone den zellzyklushemmenden CDK4-Inhibitor p16INK4a in vivo exprimierten. Die spezifische Herunterregulierung dieses Inhibitors nach 30-minütiger "milder" zerebraler Ischämie war ein frühzeitiger und zuverlässiger Indikator des verzögerten neuronalen Zellunterganges. Der Verlust von p27Kip1, eines weiteren CDK-Inhibitors, ging dem Zelluntergang in der primären neuronalen Zellkultur nach OGD voraus. Der Verlust von CDK-Inhibitoren wurde von der Hochregulierung des Cyclin D1 begleitet. Cyclin D1 wurde in den Zellkern transloziert. Dieser Translokation folgte eine Aktivierung der Cyclin-abhängigen Kinase 2 (CDK2). Wir postulieren, daß die Herunterregulierung der CDK-Inhibitoren das initiierende Ereignis für die Zellzyklusaktivierung darstellt. Die Mehrzahl der Neurone wurde noch vor dem Eintritt in die S-Phase apoptotisch, wenngleich eine kleine Fraktion noch vor ihrem Untergang DNA synthetisierte. Die Behandlung mit dem synthetischen CDK-Inhibitor Olomoucine schützte die primäre neuronale Zellkultur signifikant vor OGD. In der Zusammenschau weisen diese Ergebnisse darauf hin, daß die Zellzyklusaktivierung nach fokaler transienter Ischämie kausal mit der Schadensprogression verknüpft ist. Die pharmakologische Inhibition dieser Vorgänge könnte -unter Berücksichtigung der Nebenwirkungen der jeweiligen Pharmaka- einen therapeutischen Ansatz im Rahmen der akuten Schlaganfallbehandlung liefern. / Following mild ischemic insults many neurons undergo delayed neuronal death. Aberrant activation of the cell cycle machinery is thought to contribute to apoptosis in a variety of conditions including ischemia. We demonstrate that loss of endogenous cyclin dependent kinase (Cdk) inhibitor p16INK4a is an early and reliable indicator of delayed neuronal death in striatal neurons after mild cerebral ischemia in vivo. Loss of p27Kip1, another Cdk inhibitor, precedes cell death in neocortical neurons subjected to oxygen glucose deprivation in vitro. The loss of Cdk inhibitors is followed by upregulation of cyclin D1, activation of Cdk2, and subsequent cytoskeletal disintegration. The majority of neurons undergoes cell death prior to entering S-phase; albeit a small number (~1%) do progress to the S-phase prior to their death. Treatment with Cdk inhibitors significantly reduces cell death in vitro. These results show that alteration of cell cycle regulatory mechanisms is a prelude to delayed neuronal death in focal cerebral ischemia and that pharmacological interventions aimed at neuroprotection may be usefully directed at cell cycle regulatory mechanisms.

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