Background: To assess acute effects of bevacizumab (anti-VEGF therapy) on cerebral microvessels and systemic cardiovascular regulation. Design and subjects: 20 consecutive patients with colorectal cancer (median age: 60.4 years, range 45.5-73.9 years) received bevacizumab intravenously (5 mg/kg) uncoupled of chemotherapy. Prior to and within the first 24 hours after bevacizumab infusion, patients were investigated for retinal endothelial function. A series of a triple 24-hour ambulatory blood pressure measurement was conducted. Retinal endothelial function was determined as flicker light-induced vasodilation. The integrity of baroreflex arc and autonomic cardiovascular control was examined by stimulatory manoeuvres. Results: Bevacizumab therapy significantly reduced the vasodilatory capacity of retinal arterioles in response to flicker light. A slight decrease in diastolic pressure and heart rate was observed after bevacizumab infusion but this was unrelated to changes in retinal function. The pressure response upon nitroglycerin was largely preserved after bevacizumab infusion. The proportion of patients with abnormal nocturnal blood pressure regulation increased under anti-angiogenic therapy. Autonomic blood pressure control was not affected by bevacizumab treatment. Conclusions: Bevacizumab acutely impairs microvascular function independent of blood pressure changes. Imaging of the retinal microcirculation seems a valuable tool for monitoring pharmacodynamic effects of bevacizumab.

Hintergrund: Die menschliche Stimme wird in der Fachliteratur als “auditorisches Gesicht” bezeichnet (Belin et al., 2004), weil sie neben der Sprache auch Informationen zu Identität und Emotionen des Sprechers vermittelt, die wir in der alltäglichen Kommunikation mühelos wahrnehmen und verarbeiten. Zerebrale Pathologien, beispielsweise ischämische Hirninfarkte oder Hämorrhagien, können in der Folge verschiedene Kommunikationsdefizite verursachen. Ein bedeutsames Kommunikationsdefizit auf sprachlicher Ebene ist die Aphasie. Defizite der Stimmerkennung als eine Entität der nicht-sprachlichen Ebene werden durch den Begriff Phonagnosie definiert. Phonagnosie beschreibt ein Defizit der Stimmidentifizierung einschließlich der Analyse akustischer vokaler Signale, dem Wiedererkennen bekannter Stimmen und der semantischen Assoziation einer erkannten Stimme (Roswandowitz C, Maguinness C, von Kriegstein K., in rev.). Klinische Studien wiesen die Existenz von Stimmerkennungsdefiziten als eine mögliche Folge zerebraler Läsionen nach (Van Lancker and Canter, 1982; Van Lancker et al., 1989; Neuner and Schweinberger, 2000; Lang et al., 2009; Hailstone et al., 2011). Hierbei wurden insbesondere Läsionen der rechten Hemisphäre als zugrundeliegende neuronale Repräsentationen hervorgehoben, allerdings gelang bisher keine exakte Lokalisierung der betroffenen Hirnregionen bei isolierten Stimmerkennungsdefiziten. In funktionellen MRT-Studien an gesunden Probanden zeigten sich stimmspezifische Areale entlang des rechten superioren temporalen Gyrus und Sulcus (STG/S) (Belin et al., 2000; von Kriegstein et al., 2003; Kriegstein and Giraud, 2004). Zielsetzung: Ziel der vorliegenden Patientenstudie war es, mögliche isolierte Stimmerkennungsdefizite als Folge einer zerebralen Läsion nachzuweisen und zu charakterisieren. In einem zweiten Schritt widmete sich die Studie der Frage nach den neuronalen Korrelaten von Stimmerkennungsdefiziten. Wir stellten die Hypothesen auf, dass Stimmerkennungsdefizite (i) häufiger bei Patienten mit rechtshemisphärischen Läsionen und (ii) darüber hinaus als isoliertes Stimmerkennungsdefizit gegenüber kombinierten Defiziten von Stimm- und Gesichtererkennung auftreten können. Die Untersuchung von neuronalen Korrelaten dieser Defizite wurde in einer weiterführenden Analyse mittels Voxel-based lesion symptom mapping (VLSM) vorgenommen (Roswandowitz, C., Kappes, C., Obrig, H., von Kriegstein K., accepted, Brain). Material und Methoden: 40 Patienten der Tagesklinik für kognitive Neurologie der Universität Leipzig nahmen an der Studie teil. Alle Patienten wiesen unilaterale Hirnläsionen (n = 14 links, 24 rechts) auf, die entweder Folge eines cerebrovaskulären Ereignisses oder einer Tumorextraktion waren. Wir führten eine umfangreiche experimentelle Testreihe durch, die insbesondere der Stimmerkennung (Stimmlerntests und Tests zur Erkennung bekannter Stimmen) galt. Außerdem wurde die Kontrollmodalität der Gesichtererkennung und die Verarbeitung akustischer vokaler Signale (Pitch und Timbre) überprüft. Die individuelle Patientenwahrnehmung zur Stimm- und Gesichtererkennung erhoben wir in einem Fragebogen. Wir analysierten die Daten in IBM SPSS 22, für die Gruppenvergleiche wendeten wir sowohl parametrische als auch nicht-parametrische Tests, Varianzanalysen und bivariate Korrelationen an. In einem weiterführenden Teil der Studie wurden die behavioralen Daten und strukturelle MRTs anhand von Voxel-based lesion symptom mapping (VLSM) analysiert. Ergebnisse: In der Datenanalyse fanden sich im Gruppenvergleich der Patientien mit rechts- bzw. linkshemisphärischen Läsionen keine signifikanten Unterschiede in den Tests zur Stimmerkennung. Allerdings wiesen 9 Patienten, deren Läsionen ausschließlich rechtshemisphärisch lokalisiert waren, Stimmererkennungsdefizite auf. Die Lokalisation der Läsionen innerhalb der rechten Hemisphäre war heterogen. Während sechs Patienten dieser Gruppe ein kombiniertes Defizit der Gesichter- und Stimmerkennung zeigten, fand sich bei drei Patienten ein isoliertes Defizit der Stimmerkennung. Wir charakterisieren in der vorliegenden Arbeit das spezifische Verhaltensmuster und die Lokalisation der Läsionen dieser drei Patienten, die alle eine Beteiligung des rechten Temporallappens aufwiesen. Im Hinblick auf grundlegende Mechanismen der Stimmverarbeitung konnte insbesondere Timbre als relevantes akustisches Stimmsignal zur Erkennung neu erlernter Stimmen identifiziert werden. In der weiterführenden Analyse mittels VLSM wurden Assoziationen von (i) selektiven Defiziten der Stimmerkennung mit Läsionen im rechten Temporallappen sowie (ii) der Stimm-Gesichter-Integration im rechten inferioren Parietallappen nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Die vorliegende Studie hebt auf der Grundlage des untersuchten Patientenkollektivs die bedeutsame Rolle der rechten Hemisphäre bei der Stimmerkennung hervor. Wir identifizierten drei Patienten mit isolierten Stimmerkennungsdefiziten, deren Läsionen sich im rechten Temporallappen befanden. Dieses Ergebnis stützt bisherige Evidenz zur Stimmverarbeitung an gesunden Probanden (Belin et al., 2000; Kriegstein and Giraud, 2004). Die weiterführende VLSM-Analyse, auf der Grundlage des vorliegenden Patientenkollektivs, charakterisiert spezifische Areale des rechten Temporallappens und inferioren Parietallappens als neuronale Korrelate defizitärer Stimmerkennung. In Erweiterung bisheriger klinischer Evidenz liefert die vorliegende Studie neue Erkenntnisse zu neuronalen Korrelaten von isolierten Stimmerkennungsdefiziten und Defiziten der Stimm- Gesichter -Integration (Roswandowitz, C., Kappes, C., Obrig, H. von Kriegstein K., in prep.). Im klinischen Kontext erlaubt die Studie einen weiteren Schritt zum besseren Verständnis von nonverbalen Kommunikationsdefiziten, insbesondere Stimmerkennungsschwierigkeiten, nach zerebralen Läsionen. Literatur: Belin P, Fecteau S, Bedard C (2004) Thinking the voice: neural correlates of voice perception. Trends Cogn Sci 8:129–135. Belin P, Zatorre RJ, Lafaille P, Ahad P, Pike B (2000) Voice-selective areas in human auditory cortex. Nature 403:309–312. Hailstone JC, Ridgway GR, Bartlett JW, Goll JC, Buckley AH, Crutch SJ, Warren JD (2011) Voice processing in dementia: a neuropsychological and neuroanatomical analysis. Brain 134:2535–2547. Kriegstein K V, Giraud AL (2004) Distinct functional substrates along the right superior temporal sulcus for the processing of voices. Neuroimage 22:948–955. Lang CJ, Kneidl O, Hielscher-Fastabend M, Heckmann JG (2009) Voice recognition in aphasic and non-aphasic stroke patients. J Neurol 256:1303–1306. Neuner F, Schweinberger SR (2000) Neuropsychological impairments in the recognition of faces, voices, and personal names. Brain Cogn 44:342–366. Roswandowitz, C., Kappes, C., Obrig, H. von Kriegstein K (2017) Voice-identity recognition deficits are induced by lesions in the temporal and inferior parietal lobe. Prep. Roswandowitz C., Maguinness C., von Kriegstein K., Deficits in voice-identity processing: acquired and developmental phonagnosia. Oxford Handb Voice Perception, under Rev. Van Lancker DR, Canter GJ (1982) Impairment of voice and face recognition in patients with hemispheric damage. Brain Cogn 1:185–195. Van Lancker DR, Kreiman J, Cummings J (1989) Voice perception deficits: neuroanatomical correlates of phonagnosia. J Clin Exp Neuropsychol 11:665–674. von Kriegstein K, Eger E, Kleinschmidt A, Giraud AL (2003) Modulation of neural responses to speech by directing attention to voices or verbal content. Brain Res Cogn Brain Res 17:48–55. von Kriegstein K, Smith DR, Patterson RD, Kiebel SJ, Griffiths TD (2010) How the human brain recognizes speech in the context of changing speakers. J Neurosci 30:629–638. Hintergrund: Die menschliche Stimme wird in der Fachliteratur als “auditorisches Gesicht” bezeichnet (Belin et al., 2004), weil sie neben der Sprache auch Informationen zu Identität und Emotionen des Sprechers vermittelt, die wir in der alltäglichen Kommunikation mühelos wahrnehmen und verarbeiten. Zerebrale Pathologien, beispielsweise ischämische Hirninfarkte oder Hämorrhagien, können in der Folge verschiedene Kommunikationsdefizite verursachen. Ein bedeutsames Kommunikationsdefizit auf sprachlicher Ebene ist die Aphasie. Defizite der Stimmerkennung als eine Entität der nicht-sprachlichen Ebene werden durch den Begriff Phonagnosie definiert. Phonagnosie beschreibt ein Defizit der Stimmidentifizierung einschließlich der Analyse akustischer vokaler Signale, dem Wiedererkennen bekannter Stimmen und der semantischen Assoziation einer erkannten Stimme (Roswandowitz C, Maguinness C, von Kriegstein K., in rev.). Klinische Studien wiesen die Existenz von Stimmerkennungsdefiziten als eine mögliche Folge zerebraler Läsionen nach (Van Lancker and Canter, 1982; Van Lancker et al., 1989; Neuner and Schweinberger, 2000; Lang et al., 2009; Hailstone et al., 2011). Hierbei wurden insbesondere Läsionen der rechten Hemisphäre als zugrundeliegende neuronale Repräsentationen hervorgehoben, allerdings gelang bisher keine exakte Lokalisierung der betroffenen Hirnregionen bei isolierten Stimmerkennungsdefiziten. In funktionellen MRT-Studien an gesunden Probanden zeigten sich stimmspezifische Areale entlang des rechten superioren temporalen Gyrus und Sulcus (STG/S) (Belin et al., 2000; von Kriegstein et al., 2003; Kriegstein and Giraud, 2004). Zielsetzung: Ziel der vorliegenden Patientenstudie war es, mögliche isolierte Stimmerkennungsdefizite als Folge einer zerebralen Läsion nachzuweisen und zu charakterisieren. In einem zweiten Schritt widmete sich die Studie der Frage nach den neuronalen Korrelaten von Stimmerkennungsdefiziten. Wir stellten die Hypothesen auf, dass Stimmerkennungsdefizite (i) häufiger bei Patienten mit rechtshemisphärischen Läsionen und (ii) darüber hinaus als isoliertes Stimmerkennungsdefizit gegenüber kombinierten Defiziten von Stimm- und Gesichtererkennung auftreten können. Die Untersuchung von neuronalen Korrelaten dieser Defizite wurde in einer weiterführenden Analyse mittels Voxel-based lesion symptom mapping (VLSM) vorgenommen (Roswandowitz, C., Kappes, C., Obrig, H., von Kriegstein K., in prep.). Material und Methoden: 40 Patienten der Tagesklinik für kognitive Neurologie der Universität Leipzig nahmen an der Studie teil. Alle Patienten wiesen unilaterale Hirnläsionen (n = 14 links, 24 rechts) auf, die entweder Folge eines cerebrovaskulären Ereignisses oder einer Tumorextraktion waren. Wir führten eine umfangreiche experimentelle Testreihe durch, die insbesondere der Stimmerkennung (Stimmlerntests und Tests zur Erkennung bekannter Stimmen) galt. Außerdem wurde die Kontrollmodalität der Gesichtererkennung und die Verarbeitung akustischer vokaler Signale (Pitch und Timbre) überprüft. Die individuelle Patientenwahrnehmung zur Stimm- und Gesichtererkennung erhoben wir in einem Fragebogen. Wir analysierten die Daten in IBM SPSS 22, für die Gruppenvergleiche wendeten wir sowohl parametrische als auch nicht-parametrische Tests, Varianzanalysen und bivariate Korrelationen an. In einem weiterführenden Teil der Studie wurden die behavioralen Daten und strukturelle MRTs anhand von Voxel-based lesion symptom mapping (VLSM) analysiert. Ergebnisse: In der Datenanalyse fanden sich im Gruppenvergleich der Patientien mit rechts- bzw. linkshemisphärischen Läsionen keine signifikanten Unterschiede in den Tests zur Stimmerkennung. Allerdings wiesen 9 Patienten, deren Läsionen ausschließlich rechtshemisphärisch lokalisiert waren, Stimmererkennungsdefizite auf. Die Lokalisation der Läsionen innerhalb der rechten Hemisphäre war heterogen. Während sechs Patienten dieser Gruppe ein kombiniertes Defizit der Gesichter- und Stimmerkennung zeigten, fand sich bei drei Patienten ein isoliertes Defizit der Stimmerkennung. Wir charakterisieren in der vorliegenden Arbeit das spezifische Verhaltensmuster und die Lokalisation der Läsionen dieser drei Patienten, die alle eine Beteiligung des rechten Temporallappens aufwiesen. Im Hinblick auf grundlegende Mechanismen der Stimmverarbeitung konnte insbesondere Timbre als relevantes akustisches Stimmsignal zur Erkennung neu erlernter Stimmen identifiziert werden. In der weiterführenden Analyse mittels VLSM wurden Assoziationen von (i) selektiven Defiziten der Stimmerkennung mit Läsionen im rechten Temporallappen sowie (ii) der Stimm-Gesichter-Integration im rechten inferioren Parietallappen nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Die vorliegende Studie hebt auf der Grundlage des untersuchten Patientenkollektivs die bedeutsame Rolle der rechten Hemisphäre bei der Stimmerkennung hervor. Wir identifizierten drei Patienten mit isolierten Stimmerkennungsdefiziten, deren Läsionen sich im rechten Temporallappen befanden. Dieses Ergebnis stützt bisherige Evidenz zur Stimmverarbeitung an gesunden Probanden (Belin et al., 2000; Kriegstein and Giraud, 2004). Die weiterführende VLSM-Analyse, auf der Grundlage des vorliegenden Patientenkollektivs, charakterisiert spezifische Areale des rechten Temporallappens und inferioren Parietallappens als neuronale Korrelate defizitärer Stimmerkennung. In Erweiterung bisheriger klinischer Evidenz liefert die vorliegende Studie neue Erkenntnisse zu neuronalen Korrelaten von isolierten Stimmerkennungsdefiziten und Defiziten der Stimm- Gesichter -Integration (Roswandowitz, C., Kappes, C., Obrig, H. von Kriegstein K., in prep.). Im klinischen Kontext erlaubt die Studie einen weiteren Schritt zum besseren Verständnis von nonverbalen Kommunikationsdefiziten, insbesondere Stimmerkennungsschwierigkeiten, nach zerebralen Läsionen. Literatur: Belin P, Fecteau S, Bedard C (2004) Thinking the voice: neural correlates of voice perception. Trends Cogn Sci 8:129–135. Belin P, Zatorre RJ, Lafaille P, Ahad P, Pike B (2000) Voice-selective areas in human auditory cortex. Nature 403:309–312. Hailstone JC, Ridgway GR, Bartlett JW, Goll JC, Buckley AH, Crutch SJ, Warren JD (2011) Voice processing in dementia: a neuropsychological and neuroanatomical analysis. Brain 134:2535–2547. Kriegstein K V, Giraud AL (2004) Distinct functional substrates along the right superior temporal sulcus for the processing of voices. Neuroimage 22:948–955. Lang CJ, Kneidl O, Hielscher-Fastabend M, Heckmann JG (2009) Voice recognition in aphasic and non-aphasic stroke patients. J Neurol 256:1303–1306. Neuner F, Schweinberger SR (2000) Neuropsychological impairments in the recognition of faces, voices, and personal names. Brain Cogn 44:342–366. Roswandowitz, C., Kappes, C., Obrig, H. von Kriegstein K (2017) , accepted, Obligatory and facultative brain regions for voice-identity recognition, Brain Roswandowitz C., Maguinness C., von Kriegstein K., Deficits in voice-identity processing: acquired and developmental phonagnosia. Oxford Handb Voice Perception, under Rev. Van Lancker DR, Canter GJ (1982) Impairment of voice and face recognition in patients with hemispheric damage. Brain Cogn 1:185–195. Van Lancker DR, Kreiman J, Cummings J (1989) Voice perception deficits: neuroanatomical correlates of phonagnosia. J Clin Exp Neuropsychol 11:665–674. von Kriegstein K, Eger E, Kleinschmidt A, Giraud AL (2003) Modulation of neural responses to speech by directing attention to voices or verbal content. Brain Res Cogn Brain Res 17:48–55. von Kriegstein K, Smith DR, Patterson RD, Kiebel SJ, Griffiths TD (2010) How the human brain recognizes speech in the context of changing speakers. J Neurosci 30:629–638.

Der ATP-getriggerte Ionenkanal P2X7 ist als purinerger Oberflächenrezeptor besonders auf Zellen des Immunsystems und auf Gliazellen im Nervensystem exprimiert. Seine Aktivierung führt zur Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies sowie zu einer Beeinflussung des Zellzyklus. Zwar konnte eine Beteiligung des Rezeptors an verschiedenen entzündlichen und degenerativen Erkrankungen nachgewiesen werden, allerdings bestehen nach wie vor viele Unstimmigkeiten darüber, ob P2X7 im Einzelfall protektiv oder schadend wirkt. Eine therapeutische Modulation des Rezeptors gestaltet sich daher bis heute schwierig. Weiterhin wurde trotz intensiver Bemühungen um selektive, potente P2X7-Modulatoren bisher kein Wirkstoff über Phase-II-Studien hinaus entwickelt. Der erste Teil der Arbeit beschreibt eine Studie zur Identifikation neuer P2X7-Modulatoren und deren Charakterisierung hinsichtlich Potenz, Bindeverhalten und Speziesspezifität. Ziel dieser Studie war es, die Basis für die Entwicklung möglicher neuer Therapeutika zu legen, für die ein hoher Bedarf besteht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Beteiligung des P2X7-Rezeptors an den pathophysiologischen Vorgängen nach einem Hirninfarkt untersucht. Besondere Aufmerksamkeit lag dabei auf dem Einfluss, den der Rezeptor auf die Bildung eines begleitenden, oftmals fatalen Hirnödems ausübt. In einer Wirkstoffbibliothek enthaltene zugelassene Pharmaka und Naturstoffe wurden auf ihre Wirksamkeit am rekombinant exprimierten humanen P2X7-Rezeptor (hP2X7) getestet. Dazu wurde gemessen, inwiefern diese Wirkstoffe den P2X7-vermittelten Ca2+-Einstrom modulieren können. Für potenziell selektive Substanzen wurden Konzentrations-Wirkungs-Kurven erstellt. Für den potenten Inhibitor Tanshinon II A-Sulfonat (TIIAS) und den chemisch verwandten Wirkstoff Tanshinon II A (TIIA) erfolgte diese Untersuchung auch an den rekombinant exprimierten P2X7-Rezeptoren von Maus (mP2X7) und Ratte (rP2X7). Weiterhin erfolgte eine detaillierte, auf elektrophysiologischen Untersuchungen basierende Darstellung der pharmakodynamischen Eigenschaften von TIIAS. Die Selektivität der Wirkung gegenüber P2X2 und P2X4 wurde mithilfe entsprechender Zelllinien geprüft. Die Wirkung modulierender Pharmaka am nativen Rezeptor wurde in humanen, aus peripheren Blutmonozyten gereiften Makrophagen überprüft, wozu neben der Darstellung des Ca2+-Einstroms auch ein IL-1β-ELISA eingesetzt wurde. In allen Experimenten wurde die Beteiligung von P2X7 über bekannte Antagonisten verifiziert. Um zu klären, inwiefern P2X7 die pathophysiologischen Abläufe nach Hirninfarkt beeinflusst, wurde bei 20 P2X7-defizienten Mäusen (P2X7-/-) und bei 22 zugehörigen Wildtyp-Mäusen (WT) eine zerebrale Ischämie induziert, indem die mittlere Zerebralarterie mit einem dünnen Faden für 60 Minuten transient verschlossen wurde (middle cerebral artery occlusion, MCAO). In den folgenden 72 Stunden wurde über klinische Methoden und Magnetresonanzuntersuchungen die Entwicklung neurologischer Defizite, der Infarktgröße und des begleitenden Hirnödems evaluiert. Nach schmerzloser Tötung und Hirnentnahme wurden immunhistologisch die Aktivierung und Verteilung von Mikroglia und Astrozyten sowie der Zustand des Gefäßendothels untersucht. Sham-operierte Tiere dienten in allen Experimenten als Kontrollen. TIIAS hemmte hP2X7 mit einer IC50 von 4.3 μM, während die Potenz an mP2X7 geringer war und rP2X7 kaum geblockt wurde. TIIA modulierte P2X7 nicht. TIIAS hemmte als allosterischer Antagonist die Öffnung des Ionenkanals und band vermutlich an eine intrazelluläre Bindestelle. Die Wirkung von TIIAS wurde in humanen Makrophagen bestätigt, in denen der Wirkstoff den Ioneneinstrom und die IL-1β-Freisetzung hemmte. Obwohl die neurologische Untersuchung von P2X7-/-- und WT-Mäusen nach MCAO keine signifikanten Unterschiede ergab, zeigte sich in der bildgebenden Diagnostik, dass P2X7-/--Mäuse binnen 24 Stunden nach der OP ein signifikant stärkeres Hirnödem entwickelten, welches nicht durch Unterschiede in der Infarktgröße bedingt war. Der Infarkt führte in beiden Gruppen zu einer Gliaaktivierung, die im Fall der Mikroglia in Abwesenheit von P2X7 allerdings reduziert war. Differenzen hinsichtlich der Aktivierung von Astrozyten und der Expression von Laminin im Kapillarendothel wurden nicht festgestellt. Im Gegensatz zu TIIA, das häufig als gleichwertiger Wirkstoff eingesetzt wird, blockt TIIAS hP2X7 speziesspezifisch mit einer hohen Potenz. Maus und Ratte scheiden aufgrund der geringen Wirkung von TIIAS leider als Tiermodelle aus, um die Wirkung von TIIAS in vivo zu prüfen. Weitere Arbeiten sind notwendig, um die Potenz von TIIAS in anderen Spezies zu evaluieren oder Alternativen zum Tierversuch zu finden und eine mögliche therapeutische Anwendung bei Erkrankungen mit P2X7-Beteiligung zu testen. P2X7 beeinflusst die pathophysiologischen Vorgänge nach einem Hirninfarkt und begrenzt die Entwicklung eines zytotoxischen Hirnödems, nicht aber die des vasogenen Hirnödems, das sich zeitversetzt einstellt. Eine mögliche Erklärung für diesen Sachverhalt bieten die unterschiedlichen Funktionen, die Gliazellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach zerebraler Ischämie übernehmen. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass verschiedene Tiermodelle des zerebralen Infarkts nicht in allen Punkten vergleichbar sind.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung........................................................................................................... 1 1.1 Purinerge Signaltransduktion.......................................................................... 1 1.2 P2X-Rezeptoren.............................................................................................. 2 1.3 Pharmakologie des P2X7-Rezeptors............................................................... 3 1.4 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung des P2X7-Rezeptor...... 5 1.5 Gegenstand dieser Arbeit............................................................................... 7 2 Veröffentlichungen............................................................................................. 9 2.1 Erste Publikation............................................................................................. 9 2.1.1 Tanshinone II A sulfonate, but not tanshinone II A, acts as potent negative allosteric modulator of the human purinergic receptor P2X7................................. 9 2.1.2 Ergänzende Materialien zur ersten Publikation.......................................... 22 2.2 Zweite Publikation......................................................................................... 30 2.2.1 Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery................................................................................. 30 2.2.2 Ergänzende Materialien zur zweiten Publikation......................................... 42 2.2.3 Erratum to: Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery occlusion............................................ 46 3 Diskussion........................................................................................................ 49 4 Zusammenfassung........................................................................................... 55 5 Summary.......................................................................................................... 57 6 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 59 7 Danksagung..................................................................................................... 66 / ATP-gated ion channel P2X7 is a purinergic cell surface receptor which is mainly expressed on immune and glia cell. Upon activation of P2X7, proinflammatory cytokines are released, reactive oxygen species are generated and the cell cycle may be altered. In this regard, it has been shown that P2X7 plays a role in diseases such as rheumatoid arthritis, Alzheimer’s disease and multiple sclerosis. However, results regarding protective or detrimental effects mediated by P2X7 under particular conditions are often inconsistent. Thus, up to now, any therapeutic modulation of the receptor remains a challenge. Although intensive research has been conducted to find selective, potent P2X7-modulators, no active compound has been developed beyond phase II clinical trials. The first part of this work describes a study realized to identify new P2X7 modulators and to characterize them in terms of pharmacodynamic properties like potency and species specificity. This study was aimed at providing a basis for the development of new therapeutic agents, which are urgently needed. During the second part of this work, the involvement of P2X7 in pathophysiological processes after cerebral infarction was examined. Particular attention was paid to the influence of the receptor on the development of an accompanying and often fatal brain edema. A compound library containing approved drugs and natural compounds was screened for modulators of the recombinantly expressed human P2X7 receptor (hP2X7). Therefor, their effect on P2X7-mediated Ca2+ influx was evaluated. Concentration-response-curves were established for potentially selective compounds. Tanshinone II A sulfonate (TIIAS) turned out to be a potent inhibitor of P2X7. Both TIIAS and tanshinone II A (TIIA), the natural compound TIIAS has been derived from, were also tested on recombinantly expressed mouse and rat P2X7 (mP2X7 and rP2X7, respectively). Furthermore, electrophysiological assays were conducted for a detailed characterization of mechanisms of P2X7 inhibition. Antagonist selectivity was revised using cell lines expressing purinergic receptors P2X2 and P2X4. Human monocyte-derived macrophages were used in fluorometric calcium and dye-uptake assays as well as an IL-1ß ELISA to evaluate the effects of modulating compounds on native P2X7. In all experiments, involvement of P2X7 was verified using established P2X7 antagonists. In order to evaluate whether modulation of P2X7 may affect the outcome after cerebral infarction, cerebral ischemia was induced in 20 P2X7-deficient mice (P2X7-/-) and 22 mice of their corresponding wild type (WT) by transiently occluding their middle cerebral artery for 60 minutes with a thin filament (middle cerebral artery occlusion, MCAO). During 72 hours following surgery, neurological deficits, infarct size and edema development were monitored, applying clinical examinations and magnetic resonance measurements. After humane killing and brain removal, different antibodies were used in order to evaluate the distribution and activation state of microglia and astrocytes as well as the condition of the vascular endothelium. Sham-operated animals were used as negative controls in all experiments. TIIAS blocked hP2X7 with an IC50 of 4.3 μM, whereas it proved to be less potent at mP2X7 and poorly modulated rP2X7. TIIA did not modulate P2X7. TIIAS acted as an allosteric antagonist and reduced the opening of the ion channel; it presumably bound to an intracellular binding site. The effect of TIIAS could be confirmed in human macrophages. In these cells, TIIAS inhibited the ATP-induced Ca2+ entry, dye-uptake and release of IL-1β. Although neurological examinations did not reveal significant differences between P2X7-/- and WT mice that underwent MCAO, diagnostic imaging revealed that P2X7-/- mice developed significantly more severe brain edema within 24 hours after surgery, a development that was not due to differences in infarct sizes. Both groups displayed clear signs of activation of glia cells, but only microglia activation was attenuated in the absence of P2X7. Differences regarding the activation state of astrocytes or the expression of laminin by capillary endothelial cells could not be detected. TIIAS species specifically blocks hP2X7 with a high potency. TIIA does not convey this effect although both compounds are frequently used interchangeably. Due to the low potency TIIAS displays at mP2X7 and rP2X7, these species unfortunately cannot be used as animal models to evaluate the drug’s effect in vivo. Further research is necessary to evaluate the potency of TIIAS at other species’ P2X7 receptors or to find alternativespurinerge Signaltransduktion, P2X7, Tanshinon II A-Sulfonat, zerebrale Ischämie, Hirnödem to animal testing in order to study possible therapeutic applications of TIIAS in P2X7-related diseases. P2X7 does affect pathophysiological events following cerebral ischemia and restricts cytotoxic brain edema development, but does not limit vasogenic cerebral edema formation, which develops at a later stage of the disease. The different functions fulfilled by glia cells at distinct points in time after infarction may provide an explanation for this interesting fact. The results presented also imply that diverse animal models of cerebral ischemia may not be entirely comparable due to differences regarding the pathogenesis of brain edema.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung........................................................................................................... 1 1.1 Purinerge Signaltransduktion.......................................................................... 1 1.2 P2X-Rezeptoren.............................................................................................. 2 1.3 Pharmakologie des P2X7-Rezeptors............................................................... 3 1.4 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung des P2X7-Rezeptor...... 5 1.5 Gegenstand dieser Arbeit............................................................................... 7 2 Veröffentlichungen............................................................................................. 9 2.1 Erste Publikation............................................................................................. 9 2.1.1 Tanshinone II A sulfonate, but not tanshinone II A, acts as potent negative allosteric modulator of the human purinergic receptor P2X7................................. 9 2.1.2 Ergänzende Materialien zur ersten Publikation.......................................... 22 2.2 Zweite Publikation......................................................................................... 30 2.2.1 Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery................................................................................. 30 2.2.2 Ergänzende Materialien zur zweiten Publikation......................................... 42 2.2.3 Erratum to: Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery occlusion............................................ 46 3 Diskussion........................................................................................................ 49 4 Zusammenfassung........................................................................................... 55 5 Summary.......................................................................................................... 57 6 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 59 7 Danksagung..................................................................................................... 66

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Die bakterielle Meningitis ist trotz der Anwendung modernster Antibiotika mit einer hohen Letalität und neurologischen Spätkomplikationen verbunden. Ein entscheidendes Ereignis ist dabei der Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke (BHS). Die genauen Mechanismen, die zu ihrer Schädigung führen, sind bis heute unklar. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob lebende Pneumokokken in einem Zellkulturmodell der BHS zu einer apoptotischen Zellschädigung von zerebralen Endothelzellen, als wichtigstem zellulären Bestandteil der BHS, führen und damit zu ihrer strukturellen Schädigung beitragen. Mittels verschiedener Detektionsmethoden (TUNEL, Fluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie) konnte nachgewiesen werden, daß Streptococcus pneumoniae zu einem apoptotischen endothelialen Zelltod führt. Eine Beteiligung von Caspasen konnte weder mit direkter Aktivitätsmessung noch mittels Inhibitionsexperimenten oder dem Nachweis von Caspase-spezifischen Substraten gezeigt werden. Insgesamt sind die Morphologie der Zellkerne und die spezifische Degradation der endothelialen DNS hinweisend für einen Apoptosis-Inducing-Factor-vermittelten Zelltod ohne Caspasenbeteiligung. Diese Form des Zelltodes ist bereits in anderen Zellmodellen, bisher jedoch nicht bei zerebralen Endothelzellen beschrieben worden. Auf Seiten des Bakteriums konnten Wasserstoffperoxid und Pneumolysin als Auslöser der Apoptose identifiziert werden. Die zytotoxische Potenz des Pneumolysins ist dabei an dessen Poren-formende Aktivität gebunden. Die Ergebnisse sind von potentieller klinischer Relevanz, da es bei einer Bakteriämie und während der Invasion der Pneumokokken in das ZNS zu einem direkten Kontakt zwischen Bakterien und zerebralen Endothelzellen kommt und sich daraus eine Möglichkeit zur Entwicklung adjuvanter Therapien ergeben könnte. / Despite sufficient antibiotic treatment, pneumococcal meningitis has remained a disease associated with high mortality and neurological sequelae. The disruption of the blood brain barrier (BBB) is regarded a key event in the initial phase of pneumococcal meningitis. However, the exact molecular mechanisms involved in this process are still unknown. The aim of this study was to determine if living pneumococci are able to induce apoptosis in cerebral endothelial cells - the main cellular component of BBB - and therefore might contribute to its damage. Using several different detection methods (TUNEL, fluorescence and electron microscopy), induction of apoptotic cell death of endothelial cells by pneumococci could be verified. An accompanying activation of caspases was not detectable, despite the use of specific detection techniques such as inhibition experiments, direct enzyme measurements and detection of caspase-specific protein cleavage. These results as well as the specific nuclear morphology and degradation of endothelial DNA suggest an involvement of the mitochondrial protein Apoptosis inducing factor (AIF). This is the first time this specific form of apoptotic, AIF-driven cell death has been described to be engaged in endothelial cells. On the part of the bacterium, pneumolysin and hydrogen peroxide were identified as the two main inducers of apoptosis. The cytotoxic potency of pneumolysin is related to its pore-forming activity. These results are of clinical relevance since pneumococci are known to reside in close proximity to cerebral endothelial cells during bacteriemia and their entry into the CNS. These findings could contribute to the development of adjuvant treatment of bacterial meningitis.

Nach einer Läsion im Gehirn kommt es trotz der Bildung autoreaktiver T-Zellen zu keiner autoimmunen Neuropathologie. Foxp3+ regulatorische T-Zellen (Tregs) vermitteln möglicherweise Immuntoleranz nach zerebraler Läsion. Deswegen wurde in dieser Studie die Rolle der Tregs 7, 14 und 30 Tage nach einem transienten Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO), einem Modell für ischämischen Schlaganfall, und nach entorhinaler Kortexläsion (ECL) in der Maus untersucht. Durchflusszytometrisch wurde in beiden Modellen 14 und 30 Tage nach Läsion eine Akkumulation der Tregs in der ipsilateralen Hemisphäre beobachtet. Mikroskopisch wurden an der Läsion Zellkontakte der Tregs mit antigenpräsentierenden Zellen beobachtet. Weitere Experimente wurden ausschließlich nach MCAO durchgeführt. Am Tag 14 und 30 war in der ipsilateralen Hemisphäre eine Akkumulation der Mikroglia zu beobachten. Makrophagen und dendritische Zellen wurden an den Tagen 7, 14 und 30 detektiert. Am Tag 7 und 14 waren ipsilateral im Gehirn ca. 60 % der Tregs positiv für den Proliferationsmarker Ki-67. In zwei Versuchsansätzen wurden naive CD45RBhigh/CD4+ Zellen aus lymphatischen Organen von Foxp3EGFP Mäusen, mit Wildtyp T-Zellrezeptor (TCR), oder 2D2.Foxp3EGFP Mäusen, mit TCR spezifisch gegen Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein, isoliert. Die Zellen wurden einen Tag vor MCAO in RAG1-/- Mäuse, welche keine adulten T- und B-Zellen besitzen, transferiert. Am Tag 14 nach MCAO war in den RAG1-/- Mäusen keine de novo Induktion Foxp3EGFP+ Tregs zu beobachten. CD25+ Tregs wurden durch die Injektion eines Antikörpers gegen CD25 depletiert, um deren Wirkung nach MCAO zu untersuchen. Nach Depletion konnte bis zu 27 Tage nach MCAO keine Veränderung des Läsionsvolumen und des Gangverhaltens beobachtet werden. In dieser Studie wurde im Gehirn eine späte Präsenz und Proliferation Foxp3+ Tregs nach Läsion nachgewiesen. Mikroglia und periphere Immunzellen sind langfristig an Immunvorgängen im lädierten Gehirn beteiligt. / After brain lesion autoreactive T cells specific against brain antigens are expanded, but no delayed autoimmune neuropathology evolves. Immune suppressive CD4+/Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) could have an important role in maintaining immune tolerance in the lesioned brain. Therefore, this study sought to analyse the role of Tregs in mice 7, 14 and 30 days after transient middle cerebral artery occlusion (MCAO), a model for ischemic stroke, and entorhinal cortex lesion (ECL). An accumulation of Tregs was detected in the brain by flow cytometry in both models at days 14 and 30 after lesion. Using immunohistochemistry Tregs were found in close cell-cell contact with antigen presenting cells at the lesion site. Further experiments were performed solely with MCAO. On days 14 and 30 after MCAO a strong accumulation of microglia occurred in the ipsilesional hemisphere. Macrophages and dendritic cells were found ipsilesionally on days 7, 14 and 30. On days 7 and 14 about 60% of Tregs were positive for the proliferation marker Ki-67 in the lesioned hemisphere. In two different setups naïve CD45RBhigh/CD4+ cells were isolated from lymphatic organs of Foxp3EGFP mice, carrying a wild type T cell receptor (TCR), or 2D2.Foxp3EGFP mice, carrying a TCR specific for myelin oligodendrocyte glycoprotein. One day before MCAO naïve CD45RBhigh/CD4+ cells depleted of Foxp3EGFP+ Tregs were transferred into RAG1-/- mice, which lack adult B and T cells. At day 14 after MCAO no de novo generation of Foxp3EGFP+ Tregs was observed. The effects of Tregs on stroke outcome were tested by depleting CD25+/Foxp3EGFP+ Tregs with an antibody against CD25. After depletion no effects on lesion volumes and gait parameters were detected up to 27 days following MCAO. The present study demonstrates for the first time a sustained presence and proliferation of Tregs in the lesioned brain. Local microglia and peripheral immune cells are involved in long-lasting immune processes following brain lesion.

In unseren Studien haben wir uns unter Verwendung von in vitro und in vivo Modellen des neuronalen Zelltodes mit verschiedenen neuroprotektiven Mechanismen beschäftigt. Uns interessierten Faktoren aus drei verschiedenen Komplexen, die an zellulärer Vitalität teilhaben. Im Mittelpunkt unserer Untersuchung stand ein antioxidatives Enzym und dessen Rolle bezüglich des neuronalen Zelltodes - die NAD(P)H-Quinonoxidoreduktase1. In den Sudien haben wir die Aktivität, Expression und die Lokalisation dieses Enzyms nach neuronalem Schaden untersucht. Wir konnten zeigen, dass die Quinonoxidoreduktase den neuronalen Schaden exazerbieren kann. Ein anderer Schwerpunkt unserer Arbeit bildete das Steroidhormon 17-beta-Estradiol und sein neuroprotektiver Einfluss auf neurodegenerative Prozesse. Wir deckten verschiedene Expressionen der beiden Estradiolrezeptoren alpha und beta in kortikalen, septalen und hippokampalen Nervenzellen auf und das daraus folgende unterschiedliche neuroprotektive Potenzial des Hormons. Im dritten Teil der Studien konnten wir den Einfluss des zytoskelettmodulierenden Proteins Gelsolin auf die Progression des neuronalen Zelltodes nach zellulärem Schaden charakterisieren. / In our studies we characterized different neuroprotective mechanism by in vitro and in vivo models of neuronal cell death. We were interested in factors of three different complexes wich play a role in cellulare vitality. In the centre of our studies there was an antioxidative enzyme and his role in the neuronal cell death-the NAD(P)H:quinone oxidoreductase1. We have investigated in the activity, expression and localisation of this enzyme after neuronal damage. We could show that this enzyme can exacerbate neuronal cell death. Another point of our work were the steroid hormon 17-beta-Estradiol and the neuroprotective character in neurodegeneration. We discovered different expression of the two estradiol- receptors alpha and beta in brain caused in different protective potential to cortical, septal and hippocampal structures by the hormon. The cytoskeletal structures modulate by the protein gelsolin was the third part of the studies. We could show that the modulation of the cytoskeleton were involved in the progression of neuronal cell death after cellulare damage.

Ziele der hier vorliegenden Arbeit waren eine immunhistochemische Analyse von GFAP (‚glial fibrillary acidic protein’) und GLUT-1 (Glukosetransporter-1) nach fokaler zerebraler Ischämie sowie deren mögliche Beeinflussung durch eine intravenöse Transplantation autologer mononukleärer Knochenmarkzellen (mKMZ) im Schafmodell. Eine differenzierte Analyse der Zielstrukturen in grauer und weißer Substanz (GS bzw. WS) sollte Aufschluss über eventuell unterschiedliche Reaktionsmuster liefern. Das Gehirnmaterial von zehn Tieren der bereits 2006/2007 stattgefundenen Studie, welche mit PET und MRT-Untersuchungen sowie der Durchführung von Verhaltenstests einherging, wurde retrospektiv im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht. Je fünf gehörten zu einer Kontroll- bzw. Therapiegruppe (KG bzw. TG). Bei allen Versuchstieren wurde durch die permanente Okklusion der linken mittleren Zerebralarterie (pMCAO) eine fokale zerebrale Ischämie im Bereich des Neokortex hervorgerufen. Die Tiere der Therapiegruppe erhielten 24 Stunden nach dem Eingriff eine Transplantation autologer mKMZ (4x106/kg KGew). Nach sieben Wochen wurden die Versuchstiere getötet, ihre Schädel perfundiert und ihre Gehirne fixiert. Eine Lamelle der Gehirne wurde für die anschließende histologische Untersuchung in 30% Saccharose konserviert. Nach der Etablierung der Antikörper GFAP und GLUT-1 wurden vier Regionen der Gehirn-lamellen immunhistochemisch markiert und abschließend qualitativ und quantitativ analysiert. Die Regionen I (infarktnah) und III (infarktfern) lagen in der ipsilateralen Hemisphäre, die Regionen II (korrespondierend zu Region I) und IV (korrespondierend zu Region III) in der kontralateralen Hemisphäre. Durch den höheren Substanzverlust an Gehirnmasse in der ipsi-lateralen Hemisphäre der KG, wurden in dieser Tiergruppe die Regionen III und IV nicht ausgewertet. Vor der Analyse sind die physiologischen Markierungsmuster der vier Regionen in grauer und weißer Substanz an zwei gesunden Tieren (Prozesskontrolle) aufgezeigt worden. Durch die elektronenmikroskopische Untersuchung von Präparaten und anhand von GFAP/GLUT-1 doppelmarkierten Präparaten konnte festgestellt werden, dass die Astrozytenendfüßchen durch den hier verwendeten GLUT-1 Antikörper nicht markiert wur-den, sondern dass alleinig die gefäßständige, 55 kDa schwere Isoform detektiert worden ist. Die fokale zerebrale Ischämie führte in beiden Gruppen zu einer hochgradigen reaktiven Astrogliose mit Ausprägung einer Glianarbe in Region I. Protoplasmatische Astrozyten der grauen und fibrilläre Astrozyten der weißen Substanz zeigten hypertrophe Veränderungen. Die reaktive Astrogliose von Region I spiegelte sich in einer erhöhten GFAP-Dichte wider (p<0,05 in der Therapiegruppe). Region III hatte die gleiche GFAP-Dichte wie die Regionen II und IV. Der direkte Vergleich zwischen den Regionen I der beiden Gruppen zeigte Veränderungen der GFAP-Dichte durch die Zelltherapie auf: In der GS der Therapiegruppe lag eine geringere GFAP-Dichte vor, in der WS eine höhere (≠ p<0,05; GS und WS). Die Ergebnisse der GLUT-1-Analyse sind denen der GFAP-Analyse sehr ähnlich. Durch den Schlaganfall ist es zu einer erhöhten GLUT-1-Expression in GS und WS (p<0,05 WS) von Region I der Kontrollgruppe gekommen. Auch in Region I der Therapiegruppe konnten er-höhte GLUT-1-Dichten in GS und WS (p<0,05 WS) detektiert werden, zusätzlich dazu lag in der GS von Region III der Therapiegruppe eine erhöhte GLUT-1-Dichte vor (p<0,05). Der Vergleich zwischen beiden Gruppen zeigte Veränderungen durch die Therapie für die Regio-nen I und II auf. Die GLUT-1-Dichte der WS war in beiden Regionen in der TG erhöht (p<0,05), die GS von Region I zeigte in der Therapiegruppe eine geringere GLUT-1-Dichte. Ein Schlaganfall führt zu einer Erhöhung der GFAP sowie GLUT-1-Dichten in WS und GS im infarktnahen Gebiet. Durch die Transplantation von 4x106 autologen mononukleären Knochenmarkzellen pro kg KGew 24 Stunden nach dem Schlaganfall können diese Strukturen in ihren Expressionsmustern beeinflusst werden, dabei reagieren graue und weiße Substanz unterschiedlich: Die GS mit einer Verringerung, die WS mit einer Erhöhung der GFAP- bzw. GLUT-1-Dichte (p<0,05 WS, GLUT-1). Die Funktionskreisläufe in infarktfernen Regionen sind sieben Wochen nach dem Schlaganfall auf Astrozytenebene normalisiert (vgl. Region III). Die erhöhte GLUT-1-Dichte (p<0,05) in der GS der infarktfernen Region ist möglicherweise mit einem erhöhten Glukosemetabolismus in Verbindung zu setzen. Dies kann jedoch erst durch die Auswertung der FDG-PET-Daten beantwortet werden. Ob die durch Transplantation autologer mKMZ festgestellten Veränderungen der GFAP- und GLUT-1-Dichte in der Therapiegruppe zusätzlich mit einer verbesserten motorischen Leistung der Tiere einhergingen, wird erst durch die Analyse der Daten aus den Verhaltenstests festgestellt werden können.

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