No description available.

In dieser Arbeit wurde die Expression von XCR1 in B6XCR1lacZ+/+ Reporter Mäusen charakterisiert, die β-Galaktosidase unter der Kontrolle des XCR1-Promotors exprimieren. In Gewebeschnitten konnten wir zeigen, dass eine starke XCR1-Expression nur in lymphatischen Organen wie Milz, Lymphknoten und Thymus nachweisbar ist. In der Milz fanden sich XCR1+ Zellen vor allem in der Marginal Zone, aber auch in der roten Pulpa und der T-Zell-Zone. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass XCR1 in der Milz ausschließlich von dendritischen Zellen DZ exprimiert wird, hauptsächlich von der CD8+DZ Subpopulation aber auch von einer Minderheit der CD4−CD8−DZ. In vivo migrierten diese XCR1+ Zellen nach Applikation von chemotaktischen oder inflammatorischen Substanzen: Die Injektion sowohl einer ATAC-sezernierenden Zelllinie als auch von LPS lösten nach 3-9 h eine Translokation der XCR1+Zellen in die T-Zell-Zone der Milz aus. Untersuchungen der Phagozytose-Aktivität ergaben, dass nur XCR1+CD8+DZ, aber keine anderen DZ Subpopulationen, injizierte allogene Zellen aufnahmen, und dass eine Transfektion dieser Zellen mit ATAC diese Phagozytose signifikant verstärkte. Daher konnten wir allogene Zellen, die intrazellulär Ovalbumin OVA exprimierten, für die selektive Applikation von Antigen auf XCR1+DZ verwenden. Diese selektive Antigen-Applikation induzierte eine starke antigenspezifische zytotoxische Antwort von endogenen T-Zellen, ohne dass es zur Produktion von OVA-spezifischen Antikörpern kam. In Abwesenheit von ATAC war diese endogene zytotoxische Aktivität verringert. Durch adoptivem Transfer und Aktivierung von Wildtyp- oder ATAC-defizienten OVA-spezifischen transgenen CD8+TZellen konnten wir bestätigen, dass ATAC für die Erzeugung einer optimalen zytotoxischen Antwort benötigt wird. Die selektive Applikation von Antigen auf CD8+DZ stellt daher eine vielversprechende Strategie dar, um optimierte Vakzinierungs-Ansätze für die Auslösung einer zytotoxischen Immunantwort zu entwickeln / The G protein-coupled receptor XCR1 has been described as the sole receptor for the chemokine ATAC. As contradictory data were published on the expression pattern of XCR1, its role in the immune system has not yet been defined. In this work, expression of XCR1 was characterized in B6.XCR1 lacZ+/+ reporter mice which express β galactosidase under the control of the XCR1 promoter. In tissue sections, strong expression of XCR1 was only detected in lymphoid organs like spleen, lymph nodes and thymus. In the spleen, XCR1+ cells were mainly found in the marginal zones, but also in the red pulp and the T cell zones. Flow cytometric analysis demonstrated exclusive expression of XCR1 on DC, mainly on the CD8+ DC subset, but also on a minority of CD4− CD8− DC. In vivo, these XCR1+ cells migrated in response to chemotactic or inflammatory stimuli: application of either an ATAC-expressing cell line or LPS induced within 3 9 h the translocation of XCR1+ cells to the T cell area of the spleen. When tested for phagocytic capacity, XCR1+ CD8+ DC, but not other DC subsets, specifically took up injected allogeneic cells, and transfection of these cells with ATAC significantly enhanced their endocytosis by XCR1+ CD8+ DC. Thus, we could employ allogeneic cells expressing OVA intracellularly to target antigen selectively to XCR1+ DC. This antigen targeting induced a strong antigen-specific cytotoxic response by endogenous T cells without a generation of OVA-specific antibodies. In the absence of ATAC, the endogenous cytotoxic activity was markedly diminished. Adoptive transfer and activation of wild type or ATAC-deficient OVA-specific CD8+ transgenic T cells confirmed that ATAC is required for the generation of an optimal cytotoxic response. Targeting of antigen to CD8+ DC via XCR1 may thus be a promising strategy for the development of new vaccination approaches aimed at optimizing the induction of cytotoxic T cells.

T Zellen können in zwei Hauptpopulationen mit unterschiedlichen Aufgaben unterschieden werden. CD4+ T Zellen exprimieren im Zuge ihrer Aktivierung CD40L, welches ein zentraler kostimulatorischer Rezeptor zur Induktion von B-Zell basierter humoraler Immunität, APC Aktivierung und einer effizienten Effektor CD8+ T Zell Entwicklung ist („Helfer-Funktion“). Im Gegensatz dazu sind die zytotoxischen CD8+ T Zellen dazu vorbestimmt, infizierte oder maligne Zellen direkt abzutöten. Jedoch wurde eine Fraktion von CD8+ T Zellen identifiziert, die nach Aktivierung CD40L exprimiert. Bisher ist nicht verstanden, wie in solchen CD8+ T Zellen a) die CD40L Expression reguliert ist, b) wann und wie die Fähigkeit CD40L zu exprimieren implementiert wird und c) was die Folgen für das Immunsystem sind. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass sowohl in CD4+ als auch in CD8+ T Zellen die CD40L Expression durch DNA-Methylierung regulatorischer Regionen des CD40LG Lokus reguliert wird. Die Demethylierung zentraler Elemente wird im Thymus implementiert, manifestiert sich mit der T-Zell Reifung und geht mit einer zunehmenden Stabilität der CD40L Expression einher. Erhöhte Expression von CD5 und NUR77 in CD40L+ CD8+ SP Thymozyten weisen auf eine positive Selektion mit hoher Affinität gegen Selbst-peptide während der Reifung im Thymus hin, welche das weitere Schicksal der CD40L exprimierenden CD8+ T Zellen beeinflusst. Naive CD40L+ CD8+ T Zellen besitzen ein anderes TCR Repertoire als CD40L- CD8+ T Zellen und reifen im Zuge ihrer Aktivierung bevorzugt zu Gedächtniszellen mit Zytokin- und Chemokinrezeptorprofilen von Tc2, Tc17 und Tc22 Zellen heran. Mit ihrem nicht-zytotoxischen Phänotyp und ihrer Genexpressionsignatur ähneln diese Zellen stark Helfer-CD4+ T Zellen und können von den klassisch zytotoxischen Tc1 und Tc17+1 Zellen durch ihre IL-6R und fehlende SLAMF7 Expression sowie der Expression von Markern die auf eine Fähigkeit in die Haut zu wandern schließen lassen, unterschieden werden. Zusammenfassend zeigen wir hier, dass naive CD8+ T Zellen von den frühsten Entwicklungsstadien im Thymus an nicht homogen sind und die Fähigkeiten über CD40L Expression eine Helferfunktion auszuüben beziehungsweise über die Sekretion zytolytischer Moleküle Zielzellen abzutöten unabhängig vom CD4+ or CD8+ T-Zell Status sind. Zellen mit Zytokin- und Genexpressionsignaturen, die mit denen der CD8+ Helfer-T Zellen übereinstimmen, wurden von uns und anderen in Geweben (Haut, Lunge) identifiziert und tragen zu den verschiedensten autoinflammatorischen Erkrankungen bei. Diese Arbeit insinuiert daher die Notwendigkeit einer grundlegenen Neubewertung der CD8+ T Zell Fähigkeiten und Funktionen in Immunantworten. / The T cell compartment consists of two major subsets with diverse assignments. CD4+ T cells express CD40L upon activation, a central co-stimulatory receptor to induce B cell mediated humoral immunity, activate APCs and prime efficient effector CD8+ T cell development (“helper function”). In contrast, cytotoxic CD8+ T cells are predetermined to kill infected or malignant cells directly. However, a fraction of CD8+ T cells expressing CD40L upon activation was identified. So far, it is not understood in CD8+ T cells a) how CD40L expression is regulated, b) when and how the ability of CD40L expression is implemented and c) what are the implications for the immune system. In this thesis, we found that CD40L expression is regulated by DNA-methylation of regulatory regions of the CD40LG locus in CD4+ as well as CD8+ T cells. The de-methylation of central elements is implemented in the thymus and increases with T cell maturation reflected by enhanced stability of CD40L expression. Elevated CD5 and NUR77 expression of CD40L+ CD8+ SP thymocytes suggests that high affine detection of self-peptides during positive selection in the thymus implements CD40L expression ability and predetermines the fate of the CD40L imprinted CD8+ T cells. CD40L+ naïve CD8+ T cells differ in their TCR repertoire from their CD40L- counterparts and preferentially mature into memory cell subsets with cytokine and chemokine receptor profiles of Tc2, Tc17 and Tc22 cells. With their non-cytotoxic phenotype and gene expression signatures, the CD40L+ memory CD8+ T cell subsets Tc2, Tc17 and Tc22 widely resemble helper CD4+ T cells and can be distinguished from classical cytotoxic Tc1 and Tc17+1 cells by their IL-6R and absent SLAMF7 expression and their skin migratory phenotype. Altogether, we demonstrate that from the earliest developmental stages in thymus onwards naive CD8+ T cells are not homogenous and the abilites to provide “CD40L based help” or “cytotoxicity mediated killing” are independent of the CD4+ or CD8+ T cell status. Cells with helper-type CD8+ T cell cytokine and gene-expression signatures were found at barrier sites (skin, lung) by us and others where they contribute to multiple autoinflammatory diseases. Therefore, this work insinuates the need to revisite CD8+ T cell capablities and function in immune responses.

Zytotoxische Chemotherapien, die zur Behandlung gastrointestinaler Karzinome eingesetzt werden, sind mit unerwünschten Wirkungen und insbesondere mit Hämatotoxizität verbunden. Diese können Behandlungsverzögerungen zur Folge haben, welche die Wirksamkeit der Tumortherapie und damit die Überlebenschancen verschlechtern. Chemotherapie-bedingte Nebenwirkungen sind variabel und das individuelle Risiko ist auf Grundlage klinischer Merkmale eines Patienten schwer vorherzusagen. Aus diesem Grund werden hierfür biomathematische Modelle der Hämatopoese unter Chemotherapie als modellbasierter Ansatz der Präzisionsmedizin vorgeschlagen. Bisher wurde die Leistung dieser Modelle nur in geringem Umfang für Therapien solider Tumore untersucht. In die vorliegende prospektive klinische multizentrische Beobachtungsstudie wurden 28 Patienten mit lokal fortgeschrittenem Adenokarzinom des Magens (n= 9, 32.1%), Ösophagus, ösophago-gastralen Übergangs (Typ I-III nach Siewert) (n=14, 50.0%) und Pankreaskarzinom (n=5, 17.9%) eingeschlossen, bei denen eine neoadjuvante oder adjuvante Chemotherapie mit dem FLO(T)- (5-Fluorouracil, Folinsäure, Oxaliplatin, Docetaxel) (n=23, 82.1%) oder FOLFIRINOX- (5-Fluorouracil, Folinsäure, Oxaliplatin und Irinotecan) Schema (n=5, 17.9%) geplant war. Während der Therapiezyklen wurden engmaschige Blutbildkontrollen durchgeführt. Darüber hinaus wurden die aufgetretenen Nebenwirkungen zu jedem Zyklus gemäß CTCAE v5.0 dokumentiert. Es wurde ein mechanistisches biomathematisches integriertes Modell der Hämatopoese, der Chemotherapie sowie der Wirkung hämatopoetischer Wachstumsfaktoren verwendet, um die individuelle, Chemotherapie-bedingte Hämatotoxizität eines Patienten vorherzusagen. Bei 21 Studienpatienten (75%) trat eine höhergradige hämatologische Toxizität (Grad 3 oder 4 nach CTCAE) auf, wobei es sich am häufigsten um eine Neutropenie handelte (n= 19, 67.9%). Für die Zyklen zwei, drei und sechs konnten die Neutropenie-Grade mit durchschnittlich weniger als einem Toxizitätsgrad Abweichung prognostiziert werden, die Leukopenie-Grade hingegen bis einschließlich Zyklus 6, die Thrombopenie-Grade sogar bis Zyklus 8. Somit unterschied sich die Vorhersagegenauigkeit für die verschiedenen hämatologischen Zelllinien. Die Übereinstimmung der Prognosen für die frühen Therapiezyklen (Zyklus 2 und 3) war für alle betrachteten Blutzelllinien und Therapie-Schemata ausgezeichnet. Bei den Prognosen für die späteren Therapiezyklen traten erwartungsgemäß größere Abweichungen zwischen den vorhergesagten und den klinisch beobachteten Toxizitätsgraden auf. Die Anwendung dieses biomathematischen Modells zur Vorhersage der individuellen hämatologischen Toxizität von Patienten mit gastrointestinalem Karzinom, die mit einem FLO(T)- oder FOLFIRINOX-Schema behandelt werden, führt selbst bei dieser heterogenen Population zu zuverlässigen Ergebnissen. Die Vorhersageleistung dieses Modells erwies sich für Kurzzeitprognosen als ausgezeichnet und für Langzeitprognosen als annehmbar. Der klinische Nutzen dieses präzisionsmedizinischen Ansatzes sollte in einer größeren prospektiven Kohorte weiter untersucht und validiert werden.

Charakterisierung des Zytokinprofils in Erwachsenen mit einer latenten oder aktiven Tuberkulose in einem hoch endemischen Gebiet Die Tuberkulose (TB) stellt mit rund 2 Milliarden Infizierten weltweit ein globales gesundheitliches Problem dar. Während die große Mehrheit der infizierten Personen in der Lage sind die Krankheit zu kontrollieren, entwickelt sich bei ungefähr 10 % die aktive Form der TB aus. Der zugrunde liegende immunologische Prozess für diese Verteilung ist bis heute nicht bekannt und im Fokus dieser Arbeit. Das adaptive Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle in der Immunabwehr gegen Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), dem Erreger der TB. Hierbei sind besonders CD4+ T-Zellen für die erfolgreiche Eingrenzung der Erkrankung verantwortlich. Im Vorfeld konnte bereits mehrmals eine Assoziation zwischen polyfunktionalen CD4+ T-Zellen und einem Schutz gegen verschiedenste Krankheitserreger gezeigt werden. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wird versucht die Frage zu beantworten, ob eine erhöhte Frequenz von polyfunktionalen CD4+ T-Zellen auch gegen die Ausbildung einer aktiven TB schützen kann. Zur Bearbeitung dieser Fragestellung wurde das TH1 Zytokinprofil von Patienten mit aktiver TB untersucht und mit dem von gesunden latent infizierten Probanden (LTBI) verglichen. Desweiteren wurden die TB Patienten während der antimikrobiellen Therapie begleitet um Änderungen im Zytokinprofil von CD4+ T-Zellen beobachten zu können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zum ersten Mal die simultane Expression der vier TH1 Zytokine IFNg, TNFa, IL-2 und GM-CSF mit Hilfe der multifarben Durchflusszytometrie untersucht. Nach antigenspezifischer Stimulation konnten sowohl in unbehandelten und behandelten Patienten mit aktiver TB ein großer Anteil an multifunktionale Gedächtnis-T-Zellen nachgewiesen werden, die alle vier Zytokine gleichzeitig exprimierten. Bemerkenswerterweise konnte diese Population ebenfalls in LTBI gezeigt werden. Nach den ersten zwei Monaten der Therapie war der Anteil an multifunktionalen T-Zellen signifikant erhöht welches auf einen positiven Einfluss dieser Zellen auf die Behandlung hinweist. Um detaillierte Information über das Expressionspotential von CD4+ T-Zellen zu gewinnen wurden PBMCs mit einem Superantigen inkubiert. Hierbei unterschied sich das Zytokinprofil zwischen den beiden Studiengruppen signifikant und veränderte sich ebenfalls unter Therapie. Während die Expression von IFNg in TB Patienten niedriger war als in LTBI, war die Frequenz von TNFa, IL-2 und GM-CSF-positiver CD4+ T-Zellen signifikant höher in Patienten mit aktiver TB. Zusammenfassend ist zu sagen, dass sowohl in TB Patienten vor und nach Therapie, als auch in LTBI, multifunktionale CD4+ T-Zellen nachgewiesen werden können. Ein Unterschied in der Frequenz konnte dabei nicht festgestellt werden. Daher kann ein Zusammenhang zwischen der Existenz von multifunktionellen CD4+ T-Zellen und einem Schutz gegen eine mögliche Reaktivierung von der latenten zu der aktiven TB nicht beschrieben werden. / Characterization of the cytokine profile in adults with latent and active tuberculosis from a high endemic country Tuberculosis (TB) is a global health problem with ~2 billion infected people worldwide. The vast majority of infected individuals is able to control TB, while only ~10% develop active disease. The immunologic correlates determining the protection against reactivation of the latent form of active TB remain elusive. The adaptive immune system plays an important role in the response against Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), especially CD4+ T cells are crucial for efficient containment of the pathogen. Since polyfunctional CD4+ T cells have been associated with protection against various pathogens, the question was raised if higher frequencies of polyfunctional CD4+ T cells can be linked to protection against reactivation of active TB. To address this the TH1 T cell cytokine profile of active TB patients was analyzed and compared with healthy latently infected individuals (LTBI). Furthermore TB patients were followed up under anti-microbial therapy to monitor changes in the cytokine pattern expressed by CD4+ T cells. Hereby, for the first time, the simultaneous expression of four TH1 cytokines, IFNg, TNFa, IL-2 and GM-CSF, was investigated using multi color flow cytometry. After antigen-specific stimulation multifunctional memory T cells (CD45RO+) co-expressing IFNg, TNFa, IL-2 and GM-CSF were strongly represented in both treated and untreated TB patients. Interestingly, this proportion of polyfunctional memory T cells was also found in LTBI. After the first two months of drug treatment the proportion of antigen-specific polyfunctional T cells was significantly increased, indicating a positive impact of these cells during therapy. To gain detailed information about the potential of CD4+ T cells to produce cytokines we incubated PBMCs with a superantigen. In this case the profile was significantly different between these two groups and it changed during therapy. While the expression of IFNg was significantly lower in CD4+ T cell of TB patients in comparison to LTBI, the expression of TNFa, IL2 and GM-CSF showed significant higher frequencies in memory T cells of TB patients. To conclude, upon antigen stimulation, polyfunctional memory T cells are found in TB patients pre- and post therapy as well as in LTBI. A difference in the frequency between active TB patients and LTBI could not be detected and therefore a correlation with protection against reactivation from the latent to the active form of TB cannot be drawn.

No description available.

This study aims at the development of materials for biodegradable fiducial markers for X-ray based medical imaging and their anchorage in soft tissue. Towards this goal a degradable polymer matrix of poly(L-lactide-co-ε-caprolactone) (P[LAcoCL]) was combined with barium sulfate (BaSO₄) and hydroxyapatite (HAp) as radio-opaque fillers. Low pressure plasma treatment was applied to the composite materials to improve cell adhesion and subsequent tissue integration. In particular, the effects of oxygen and ammonia plasmas were evaluated and compared using X-ray photoelectron spectroscopy, atomic force microscopy and dynamic water contact angle measurements as well as in vitro studies using the murine fibroblast cell line L929. To exclude the cytotoxic effects of degradation products of P[LAcoCL] and released BaSO₄ or HAp cytotoxicity assays with the degradation products of the composite materials were conducted. The results obtained by this broad range of analytical techniques suggest the application of composites of P[LAcoCL] with BaSO₄ and HAp as promising material systems for innovative fiducial markers for soft tissue in X-ray based medical imaging.

Neutrophile sind die häufigsten weißen Blutkörperchen im menschlichen Blut. Sie bilden die erste Verteidigungslinie und töten eindringende Krankheitserreger ab. Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind netzartige Strukturen, die aus dekondensiertem Chromatin bestehen und mit zytotoxischen Proteinen dekoriert sind. NETs können Mikroben in vitro und in vivo einfangen und abtöten, sind aber auch für verschiedene Krankheiten verantwortlich. Frühere Studien haben eine spezifische Gruppe von 20-50 Neutrophilenproteinen identifiziert, die an NETs gebunden sind und von denen einige eine mikrobizide Wirkung haben. Wie diese Proteine an die NETs binden, wie sie interagieren und wie die Bindung ihre antimikrobielle Aktivität beeinflusst, ist noch nicht bekannt. In dieser Dissertation habe ich die Verteilung von acht neutrophilen Proteinen und Nukleosomen auf NETs mit Hilfe der Superauflösungsmikroskopie untersucht. Es wurden drei unabhängige Techniken mit Auflösungen von mehr als 90 nm verwendet. Die Nukleosomen bildeten auf den NETs periodische Cluster mit deutlich größeren Abständen im Vergleich zum kondensierten Chromatin. Drei NET-Proteine waren ebenfalls in periodischen Clustern auf den NETs lokalisiert und zwei von ihnen waren stark mit Nukleosomen kolokalisiert. Alle anderen analysierten Proteine zeigten keine Muster der Bindung an NETs. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Bindung von Proteinen an NETs zumindest teilweise spezifisch ist und teilweise durch Wechselwirkungen mit Nukleosomen vermittelt wird. Die erfolgreiche Einführung der superauflösenden Mikroskopie für schwierige NET-Proben in Kombination mit einem vorgeschlagenen rekonstituierten NET-System eröffnet neue Möglichkeiten für das Verständnis der molekularen Mechanismen der NET-Bildung und der Protein-Protein-Interaktion bei der NET-vermittelten Abtötung. / Neutrophils are the most abundant human white blood cell in circulation. They are the first line of defense and kill invading pathogens. Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are weblike structures composed of decondensed chromatin decorated with cytotoxic proteins. NETs can trap and kill microbes in vitro and in vivo, but also mediate several diseases. Previous studies identified a specific set of 20-50 neutrophil proteins bound to NETs, several with microbicidal activity. It remains unknown how these proteins bind to NETs, how they interact and how binding influences their anti-microbial activity. In this dissertation, I studied the distribution of eight neutrophil proteins and nucleosomes on NETs using super-resolution microscopy. Three independent techniques with resolutions larger than 90nm were used. Nucleosomes formed periodic clusters on NETs, with significantly larger spacing compared to condensed chromatin. Three NET proteins also localized in periodic clusters on NETs and two of them strongly co-localized with nucleosomes. All other proteins analyzed showed no patterns binding to NETs. Taken together, these findings demonstrate that, at least some, protein binding to NETs is specific and in part mediated by interactions with nucleosomes. The successful introduction of super-resolution microscopy to the challenging NET samples in combination with a proposed reconstituted NET system opens new possibilities to understand the molecular mechanisms behind NET formation and protein-protein interaction in NET mediated killing.