Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας προϋποθέτει τη σωστή διαδοχή
των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Σημαντικό μηχανισμό ελέγχου αποτελεί η
αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, η οποία εξασφαλίζει την πλήρη αντιγραφή του
γονιδιώματος μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Η διαδικασία
αυτή λαμβάνει χώρα στο τέλος της μίτωσης και κατά τη φάση G1 και περιλαμβάνει τη
συγκρότηση των προ-αντιγραφικών συμπλόκων στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA.
Τα σύμπλοκα αυτά απαρτίζονται από τις πρωτεΐνες MCM2-7 οι οποίες έχουν ενεργότητα
ελικάσης. Σημαντικό παράγοντα αδειοδότησης αποτελεί η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία
συσσωρεύεται κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και απαιτείται για τη
στρατολόγηση των ελικασών MCM2-7 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Στα
μετάζωα, η πρωτεΐνη Geminin, η οποία εκφράζεται κατά τις φάσεις S, G2 και Μ, αποτελεί
αναστολέα του παράγοντα Cdt1 και προσδένεται σε αυτόν παρεμποδίζοντας την
αδειοδότηση της αντιγραφής.
Αρκετές μελέτες έχουν καταδείξει ότι η εκτοπική υπερέκφραση της πρωτεΐνης
Cdt1 επάγει την επανέναρξη της αντιγραφής του DNA και τον υπερδιπλασιασμό του
γονιδιώματος συμβάλλοντας στην ογκογένεση. Στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας
μελετήθηκε η έκφραση του παράγοντα Cdt1 σε κλινικά δείγματα όγκων μαστού. Από την
ανάλυση διαπιστώθηκε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 υπερεκφράζεται στατιστικώς σημαντικά στην
περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό, γεγονός που
καταδεικνύει την πιθανή αξία του παράγοντα ως διαγνωστικού βιοδείκτη. Επιπλέον, η
υπερέκφραση του συγκεκριμένου παράγοντα δείχθηκε ότι συσχετίζεται αντίστροφα με την
παρουσία ή μη οιστρογονικών (ER) και προγεστερονικών υποδοχέων (PR). Επίσης,
διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του παράγοντα
Cdt1 και της έκφρασης του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 καθώς και του υποδοχέα
HER2/neu. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδηλώνουν ότι ο παράγοντας Cdt1 ενδέχεται να
αποτελεί δείκτη άσχημης πρόγνωσης στον όγκο μαστού. Επιπλέον η ανάλυση κατέδειξε
σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 σε όγκους θετικούς για τον υποδοχέα
HER2/neu σε σύγκριση με τα περιστατικά που δεν εξέφραζαν τον υποδοχέα. Δεδομένου
ότι στο 95% των περιπτώσεων όγκων μαστού όπου διαπιστώνεται υπερέκφραση του
υποδοχέα HER2/neu, αυτή οφείλεται σε ενίσχυση του αντίστοιχου γονιδίου, διερευνήθηκε
κατά πόσο η γονιδιακή ενίσχυση θα μπορούσε να αποτελεί λειτουργική επίπτωση της
ογκογόνου δράσης του παράγοντα Cdt1 στον όγκο μαστού. Η υπερέκφραση των
παραγόντων αδειοδότησης Cdt1 και Cdc6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa και
MCF7 είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ανθεκτικών αποικιών στη μεθοτρεξάτη. Έχει
δειχθεί ότι η ανθεκτικότητα στο φάρμακο αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στη γονιδιακή
ενίσχυση του ενζύμου διυδροφολική αναγωγάση (DHFR). Συνεπώς, είναι πιθανό η
υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 να συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης.
Στο δεύτερο μέρος της εργασίας μελετήθηκε η κινητική συμπεριφορά των
πρωτεϊνών MCM2-7 με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας. Αρχικά αναπτύχθηκε ένα
σύστημα μελέτης το οποίο βασίζεται στις μεθόδους FRAP και FLIP και επιτρέπει τη
μελέτη της δυναμικής συμπεριφοράς των πρωτεϊνών MCM και κατ’ επέκταση τη
χωροχρονική ποσοτική εκτίμηση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε ζωντανά
ανθρώπινα κύτταρα. Η ανάλυση της κινητικής των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4
7. Περίληψη - Abstract
- 212 -
αποκάλυψε σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την αντίστοιχη του παράγοντα Cdt1,
καθώς οι πρωτεΐνες MCM παρουσιάζουν πιο σταθερή αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη.
Επίσης, διαπιστώθηκε σταδιακή πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη με την
πρόοδο της φάσης G1, περαιτέρω πρόσδεση μορίων MCM στο τέλος της φάσης αυτής και
σταδιακή αποδέσμευση αυτών από τη χρωματίνη καθώς εξελίσσεται η φάση S. Πειράματα
FLIP αποκάλυψαν ότι η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη λαμβάνει
χώρα σε συγκεκριμένες υποπυρηνικές περιοχές. Οι περιοχές αυτές αυξάνονται σε αριθμό
με την πρόοδο της φάσης G1 και ελαττώνονται με την εξέλιξη της φάσης S. Η
παρατήρηση των υποπεριοχών αυτών κατά τη φάση S κατέδειξε ότι δεν συμπίπτουν με τις
υποδομές της πρωτεΐνης PCNA, γεγονός που υποδεικνύει ότι οι πρωτεΐνες MCM2-7 δεν
εντοπίζονται στις περιοχές σύνθεσης του DNA. Επιπλέον, διερευνήθηκε η πιθανή
επίδραση της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MCM.
Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin είχαν ως αποτέλεσμα τη
μείωση του δεσμευμένου κλάσματος των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 κατά τη διάρκεια
της φάσης G1, καθώς και την αποσταθεροποίηση των ήδη δεσμευμένων μορίων στο τέλος
της φάσης αυτής. Επίσης, η απουσία της πρωτεΐνης Geminin είχε ως αποτέλεσμα την
αδυναμία των κυττάρων να εισέλθουν στη φάση S.
Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της παρούσας εργασίας καταδείχθηκε η πιθανή
αξία του παράγοντα Cdt1 ως διαγνωστικού και προγνωστικού βιοδείκτη στον όγκο
μαστού. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 πιθανώς
συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης, παρατήρηση που προτείνει ένα νέο
μηχανισμό ογκογόνου δράσης του παράγοντα αυτού. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας
διαπιστώθηκε ότι η κινητική των πρωτεϊνών MCM2 και MCM4 αλλάζει κατά τη διάρκεια
των φάσεων G1 και S. Επίσης, η πρωτεΐνη Geminin δείχθηκε ότι απαιτείται για την
πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη και για την πρόοδο των κυττάρων από τη
φάση G1 στη φάση S, παρατήρηση που καταδεικνύει ένα πιθανό θετικό ρόλο της
πρωτεΐνης Geminin στην αντιγραφή του DNA. / Tight regulation of the DNA replication initiation is crucial for the maintenance of
genomic integrity. Faithful replication in time and space is ensured by a process called
DNA licensing, which takes place in late mitosis and during G1 phase. Licensing involves
the stepwise assembly of pre-replicative complexes at origins of replication. These
complexes render DNA origins competent to initiate replication. Cdt1 is an essential
regulator of DNA licensing that accumulates only in G1 phase of the cell cycle and is
required for the recruitment of MCM2-7 helicases onto replication origins. In metazoans,
Cdt1 is negatively regulated by a protein called Geminin, which is expressed from S to M
phases. Geminin binds to Cdt1 preventing replication licensing.
Several lines of evidence suggest that Cdt1 overexpression in cell lines and animals
drives rereplication and contributes to genomic instability. In the first part of this thesis,
Cdt1 expression levels were analyzed in breast cancer specimens. Cdt1 protein expression
was correlated to clinicopathological parameters of the disease, proliferation index and
HER2/neu status. Analysis revealed that Cdt1 was statistically significantly overexpressed
in the invasive tumor areas compared to adjacent non-neoplastic tissue. Moreover, a
significant inverse correlation was established between Cdt1 expression levels and
oestrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) status. A significant positive
correlation of Cdt1 expression with the proliferation index Ki67 was demonstrated. These
observations imply that Cdt1 may constitute a useful prognostic and diagnostic biomarker
for breast cancer. Additionally, Cdt1 expression levels were significantly higher in
HER2/neu score 3+ tumors (known to show HER2/neu gene amplification by FISH in 95%
of cases) compared to HER2/neu negative tumors (known to show HER2/neu gene
amplification by FISH in only 0-7% of cases). This observation prompted us to investigate
whether gene amplification is a direct consequence of Cdt1 overexperssion. To this end,
Cdt1 and Cdc6 were overexpressed in HeLa and MCF7 cell lines. The overexperssion of
these licensing factors resulted in the generation of methotrexate resistance colonies. Given
that the major cause of resistance to methotrexate is the increased expression levels of the
enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) due to gene amplification, it is probable that Cdt1
overexpression may lead to this type of genomic instability.
In the second part of this thesis, live cell imaging techniques were used to assess
dynamics of licensing within the cell nucleus. In particular, we established an in vivo
licensing assay, which is based on FRAP and FLIP techniques and permits the
investigation of the kinetics of MCM helicases within live human cells. FRAP analysis of
GFP-MCM2 and GFP-MCM4 kinetics revealed that MCMs maintain stable association
with chromatin during G1 phase in contrast to Cdt1, which exhibits transient interaction
with chromatin throughout G1 phase. Moreover it was shown that MCMs are gradually
bound to chromatin as G1 phase progresses, being maximally bound in late G1, before the
onset of DNA replication and are displaced from chromatin during the course of S phase.
Fluorescence-Loss-In-Photobleaching (FLIP) experiments indicated that MCM-chromatin
association is not homogenous throughout the nucleus but shows subnuclear
concentrations which differ as cells progress through G1 and are adjacent to sites of
ongoing DNA synthesis in S phase cells. Moreover, it was shown that Geminin is required
for MCM proteins being stably bound to chromatin as well as for proper progression of
7. Περίληψη - Abstract
- 214 -
cells from G1 to S phase. Taken together our results suggest additional levels of regulation
of MCM chromatin association during G1 and S phases. Furthermore, Geminin appears to
have a positive regulatory role in DNA replication.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/6477 |
| Date | 06 December 2013 |
| Creators | Συμεωνίδου, Ιωάννα Ελένη |
| Contributors | Λυγερού, Ζωή, Symeonidou, Ioanna Eleni, Ταραβήρας, Σταύρος, Παπαδάκη - Πέτρου, Ελένη, Καλόφωνος, Χαράλαμπος, Μακατσώρης, Θωμάς, Μπράβου, Βασιλική, Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 12 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0039 seconds