Le suppresseur de tumeurs BAP1 est la déubiquitinase la plus fréquemment mutée dans le cancer humain. Ce dernier est impliqué dans la régulation des gènes cibles des facteurs de transcription E2Fs, qui sont des régulateurs centraux de la prolifération cellulaire en contrôlant, les points de contrôle du cycle cellulaire, la mitose, la réparation de l'ADN et l'apoptose. Dans le complexe BAP1, nous notons plusieurs protéines liant la chromatine, telles que les facteurs de transcription FOXKs (FOXK1 et FOXK2), qui sont connues pour recruter BAP1 sur ses gènes cibles. En effet, le complexe BAP1 est recruté à la chromatine pour assurer sa fonction de déubiquitination de la marque d’histone répressive H2AK119ub, et ainsi, réguler l'expression des gènes. Dans cette étude, nous avons cherché à étudier l'axe BAP1-FOXKs dans la régulation des fonctions cellulaires associées à ce complexe. Fait intéressant, FOXK1, mais pas FOXK2, est connue pour avoir des propriétés oncogéniques, car des niveaux d'expression plus élevés de FOXK1 ont été observés dans une variété de cancers et sont corrélés avec la progression tumorale, l'invasion et les métastases. Ce fait soulève de nombreuses questions sur la nature de la régulation entre ces protéines dont la question suivante : s’agit-il d’une relation de coopération ou antagonisme, entre le suppresseur de tumeurs BAP1 et l’oncogène FOXK1 ?
De façon intéressante, nous avons découvert que les protéines FOXK1 et FOXK2 forment deux complexes mutuellement exclusifs avec le complexe BAP1, ce qui suggère qu'elles ont des fonctions moléculaires et cellulaires distinctes à travers ce complexe. Nos études phénotypiques en utilisant des fibroblastes primaires humains montrent que FOXK1 et FOXK2 régulent différemment la prolifération cellulaire, la sénescence cellulaire et la transformation oncogénique. En effet, FOXK1, mais pas FOXK2, favorise la prolifération cellulaire via l’activation de l'expression d'E2F1 et de ses gènes cibles. En conséquence, FOXK1 retarde la sénescence cellulaire et favorise une réplication prolongée des fibroblastes primaires. De plus, la surexpression de FOXK1 favorise la transformation oncogénique des fibroblastes primaires transduits par les oncoprotéines E1A et RAS V12G en augmentant la pénétrance et en diminuant le temps de latence de formation des tumeurs. Ces résultats confirment que ces facteurs disposent de fonctions de signalisation cellulaire distinctes et suggèrent qu'ils sont régulés de manière différentielle au niveau moléculaire.
Afin d’investiguer davantage le mécanisme moléculaire qui pourrait distinguer entre les fonctions cellulaires de FOXK1 et FOXK2, nous avons cherché à étudier les modifications post-traductionnelles de ces facteurs. Fait intéressant, nos données de spectrométrie de masse ont révélé que seul FOXK1, mais pas FOXK2, est modifié par O-GlcNAcylation, une modification post-traductionnelle catalysée par l'enzyme OGT. Nos essaies in-vitro montrent que cette modification régule la fonction de FOXK1 dans la prolifération cellulaire car le mutant de la O-GlcNAcylation réduit l'impact prolifératif de FOXK1 sur des cellules. Nos essaies in-vivo, en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules cancéreuses humaines chez la souris, confirment que la O-GlcNAcylation de FOXK1 favorise la croissance tumorale. Plus intéressant, le mutant de la O-GlcNAcylation de FOXK1 affecte la transformation oncogénique des fibroblastes primaires transduits par E1A et RAS V12G, en augmentant le temps de latence tumorale et diminuant la taille finale de la tumeur. Au niveau de la chromatine, la O-GlcNAcylation de FOXK1 favorise le recrutement de BAP1 sur les gènes cibles des facteurs E2Fs afin deubiquitiner H2AK119Ub et permettre leur expression. En conclusion, la O-GlcNAcylation est un mécanisme clé qui régule la fonction de FOXK1 dans la prolifération cellulaire, et qui contribue à son activité oncogénique.
Dans une autre perspective de cette étude, et afin d'investiguer l'importance de l'axe de signalisation BAP1-FOXKs dans la fonction de suppression tumorale de BAP1, nous avons étudié le rôle fonctionnel de l’interaction BAP1-FOXKs dans un modèle murin. Nous avons généré un modèle de souris en utilisant le système d'édition de gènes CRISPR/Cas9 pour muter la thréonine 492 du gène bap1, en alanine et ainsi perturber l'interaction entre les FOXKs et BAP1 chez la souris. Des descendants hétérozygotes de Bap1T492A/+ ont été croisés pour générer des individus homozygotes et étudier leur phénotype. Fait intéressant, nos résultats montrent que les souris homozygotes Bap1T492A/T492A meurent au stade embryonnaire. De plus, les quelques souris homozygotes Bap1T492A/T492A viables échappant à la barrière de létalité (qui représentent seulement 4.7 % au lieu de 25%) sont remarquablement plus petites et certaines d'entre elles ont présenté des anomalies de développement. De plus, lors de l'analyse du système immunitaire des souris adultes homozygotes Bap1T492A/T492A, nous avons constaté une réduction importante dans les proportions des cellules NKT qui sont des combattants du système immunitaire pouvant éliminer les cellules cancéreuses. Ensemble, ces données montrent que l'axe BAP1-FOXKs est important pour le développement et fournissent de nouvelles informations sur la manière dont les événements de signalisation entre le suppresseur de tumeurs BAP1 et les facteurs FOXKs doivent être étroitement contrôlés pour maintenir une homéostasie cellulaire normale et prévenir le cancer. / The tumor suppressor BAP1 is one of the most frequently mutated deubiquitinase in human cancer. This latter is involved in the regulation of the E2F target genes, which are central regulators of cellular proliferation by controlling, cell cycle checkpoints, mitosis, DNA repair, and apoptosis. Importantly, in the BAP1 complex, we note several chromatin-binding proteins, such as FOXKs transcription factors, which are known to recruit BAP1 to its target genes. Indeed, the BAP1 complex is recruited to chromatin to ensure its deubiquitinating function of the repressive histone mark H2AK119ub and thus regulating gene expression. In this study, we sought to investigate the BAP1-FOXKs axis in regulating associated cellular functions. Interestingly, FOXK1 but not FOXK2, is known to have oncogenic properties as higher expression levels of FOXK1 has been observed in a variety of cancers and is correlated with tumor progression, invasion, and metastasis. These results raise many questions about the nature of the regulation between these proteins, including whether there is a cooperative or antagonistic relationship between the tumor suppressor BAP1 and the oncogene FOXK1?
Interestingly, we found that FOXK1 and FOXK2 proteins are mutually exclusive for their interactions with the BAP1 complex, which suggests that they have distinct molecular and cellular functions within this complex. Our functional studies using human primary fibroblasts show that FOXK1 and FOXK2 regulate differentially cell proliferation, cellular senescence, and oncogenic transformation. Indeed, FOXK1, but not FOXK2, promotes cellular proliferation through the activation of the expression of E2F1 and its target genes. As a consequence, FOXK1 delays cellular senescence and promotes prolonged primary cell replication. In addition, overexpression of FOXK1 promotes oncogenic transformation of primary fibroblasts transduced by E1A and RAS V12G oncogenes, by increasing tumor penetrance and decreasing latency of tumor formation. These results confirm that these factors have distinct cellular signalling functions and suggest that they are regulated differentially on the molecular level.
To further investigate the molecular mechanism, which could distinguish FOXK1 and FOXK2 cellular functions, we sought to study posttranslational modifications of these factors. Interestingly, our mass spectrometry data revealed that only FOXK1, but not FOXK2, is modified by O-GlcNAcylation, a protein posttranslational modification catalyzed by the enzyme OGT. Our in vitro data shows that this modification regulates FOXK1 function in cellular proliferation as the expression of the O-GlcNAc mutant reduces the proliferative potential of FOXK1. Our in-vivo data, using human cancer cell xenografts on mice, confirms that FOXK1 O-GlcNAcylation promotes tumor growth. More interestingly, FOXK1 O-GlcNAcylation mutants affect the oncogenic transformation of primary fibroblasts expressing E1A and RAS V12G by increasing tumor latency and decreasing tumor size. At the chromatin level, O-GlcNAcylation of FOXK1 promotes the recruitment of BAP1 to target genes of E2Fs factors in order to deubiquitinate H2AK119Ub and allow their expression. In conclusion, O-GlcNAcylation is a key mechanism that regulates the function of FOXK1 in cell proliferation, which contributes to its oncogenic activity.
In another perspective of this study, and in order to investigate the importance of BAP1- FOXKs signaling axis in the tumor suppression function of BAP1, we sought to study the functional role of BAP1-FOXKs interaction in a murine model. We generated a mouse model using the CRISPR/Cas9 gene-editing system by mutating BAP1-threonine 492 into alanine and thus disrupting the interaction between FOXKs and BAP1. Heterozygous offspring of Bap1T492A/+ were crossed to generate homozygous litters to study their phenotypes. Interestingly, our results show that homozygous Bap1T492A/T492A mice are embryonic lethal. Moreover, a few homozygous Bap1T492A/T492A mice can escape the embryonic lethality (representing only 4.7% instead of 25%), are remarkably smaller, and some of them showed developmental abnormalities. Moreover, when analyzing the immune system of adult homozygous Bap1T492A/T492A mice, we found a significant reduction of NKT cells proportions, which could be central fighters against cancer cell development. Altogether, these data show that BAP1-FOXKs axis is important for development and provide novel insights into how signaling events between the tumor suppressor BAP1 and FOXKs should be tightly controlled to maintain normal cellular homeostasis and prevent cancer.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/32960 |
| Date | 03 1900 |
| Creators | Ahmed, Oumaima |
| Contributors | Affar, El Bachir |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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