Multivalente Wechselwirkungen spielen sowohl in der Natur als auch für die Konstruktion hochaffiner Binder eine wichtige Rolle. In dieser Arbeit wurde die Grenze der Bivalenz in Bezug auf den Bindungsabstand, die monovalente Interaktionsstärke und die Flexibiltät des Gerüsts untersucht. Die Modifizierung von DNA mit Cucurbit[7]uril und zwei verschiedenen Adamantananaloga (Ad1 und Ad2) sowie die Verwendung verschiedener Template, ermöglichte die Konstruktion diverser bivalenter Modellsysteme. Die Ergebnisse zeigten eine Distanzabhängigkeit des bivalenten Effekts, der mit dem Bindungsabstand abnahm. Im Gegensatz zum schwächeren Binder (Ad2), war der stärkere Binder (Ad1) in der Lage auch noch bei großen Abständen von einer bivalenten Verstärkung zu profitieren. Somit besteht eine Abhängigkeit des bivalenten Effekts von der monovalenten Bindungsstärke. Mit diesem System wurde anschließend untersucht, unter welchen Bedingungen bivalente Systeme multimolekulare Strukturen ausbilden. Es konnte gezeigt werden, dass verbrückende Strukturen nur bei hohen Konzentrationen und bei Abwesenheit eines bivalenten Effekts vorliegen können.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein bispezifischer Binder auf seine Affinität, Selektivität und auf seinen Einfluss auf die Rezeptoraktivität untersucht. Dafür wurden Oligonukleotide mit Cilengitid, welches αvβ3-Integrin binden kann, und mit einem Peptoid, welches VEGFR2 binden kann, modifiziert. Durch Verwendung verschiedener Template konnten bispezifische Binder mit unterschiedlichen Ligandenabständen konstruiert werden. Messungen an HUVEC-Zellen ergaben eine höhere Affinität der bispezifischen Binder im Vergleich zu den monospezifischen. ELISA-Messungen ergaben eine distanzabhängige Aktivierung oder Deaktivierung der Phosphorylierung von VEGFR2. Es konnte somit ein Modellsystem konstruiert werden, mit dem die Rezeptoraktivität gesteuert werden konnte. / Multivalent interactions play an important role in nature and are also used to construct high-affinity binders.
In this work the limit of bivalency based on binding distance, flexibility of the system and monovalent binding-strength was investigated. Modification of DNA with Cucurbit[7]uril (CB[7]) and two adamantane-analogues (Ad1 and Ad2), along with the use of different templates, enabled the construction of diverse bivalent model-systems. The results revealed a distance-dependency of the bivalent effect, which decreased with increasing binding distance. The stronger binder (Ad1) was able to benefit from bivalent enhancement at relatively large binding distances compared to the weaker binder (Ad2). This denotes a dependency of the bivalent effect on the monovalent binding strength. The same system was used to investigate the factors leading to crosslinking. The results show that only at high concentrations, and when the system does not have to compete with a bivalent enhancement, can multimolecular structures be formed.
The second part of this work deals with a bispecific binder. Binding affinities, selectivity and the impact of the binder on receptor activity were tested. Accordingly, oligonucleotides were modified with cilengitide, which is able to bind αvβ3-Integrin, and with a bivalent peptoid, which binds to VEGFR2. The use of different DNA templates enabled construction of several bispecific binders with different binding distances. Measurements with HUVEC cells revealed higher affinities of the bispecific binders compared to the monospecific ones. ELISA-measurements demonstrated that activation or deactivation of the VEGFR2-phosphorylation was distance dependent. Consequently, a model system was constructed which was able to control receptor activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/20881 |
| Date | 01 July 2019 |
| Creators | Dubel, Natali |
| Contributors | Seitz, Oliver, Hackenberger, Christian, Schrader, Thomas |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | (CC BY-NC-ND 3.0 DE) Namensnennung - Nicht-kommerziell - Keine Bearbeitung 3.0 Deutschland, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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