Made available in DSpace on 2017-07-10T19:23:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_ Adilson Bosetto 2015 PDF.pdf: 2419034 bytes, checksum: 3fdc9e711199e04fe0746f89b07c4bea (MD5) Previous issue date: 2015-03-10 / The application of enzymes in industrial processes, in its broad sense, has shown the market evolution for innovative alternatives for preserving the environment. Brazil has a great potential to develop some technologies, which allow the use of such materials as substratum for products with higher added value, due to the large amount of lignocellulose as waste that comes from agriculture. Therefore, the analysis of genes expression related to microbial degradation of plant cell wall has caught the researchers attention, mainly because it is associated to the possibility of controlled large-scale synthesis of enzymes applied in biofuel production. In this context, the Gram-negative bacterium C. crescentus is found as a promising microorganism for biotechnological exploitation due to its ability on degrading xylan, the major component of plant hemicellulose. There are several genes in the bacterial genome that codify to Xylanases and β-Xylosidases. In order to purify and biochemically characterize the β-Xylosidase III protein of C. crescentus, xynB3 gene (CCNA_00856) that contains 1,623 nucleotides and encodes a protein with conserved domains of β-Xylosidase with 540 amino acid residues has been studied. Therefore, xynB3 gene was isolated from genomic DNA of C. crescentus NA1000 by Polymerase Chain Reaction (PCR) using specific primers. The single amplification product was cloned into pJet1.2Blunt vector in non-cohesive sites and reintroduced in vector of pTrcHisA expression within the reading frame to produce a histidine tag at the amino-terminus area of fusion protein. The obtained construction was denominated pTrcHis-xynB3 and the confirmation of its gene identification was figured out by the DNA sequence after insertion into the TOP10 E. coli strain and subsequent experimental tests of expression in different temperature of growth, IPTG concentrations and induction times. The recombinant protein was overexpressed into inclusion bodies, thus, in a non-soluble form. Different induction and purification protocols were used to obtain the β-xylosidase III pure of C. crescentus, in native or non-native form. However, assays of enzymatic activity with different substrates neither demonstrated β-xylosidase activity nor detectable levels of the protein. These results suggest that the enzyme was not active during the assays, due its expression in inclusion bodies. This suggests that this protein may have a toxic effect on E. coli when expressed at high levels. Thus, this trial contributes to additional data about the xylanolytic complex concerning the aquatic bacterium C. crescentus. / A utilização de enzimas em processos industriais, no seu sentido mais amplo, demonstra a evolução do mercado em relação a alternativas inovadoras de preservação do meio ambiente. Devido à grande quantidade de material lignocelulósico residuário, proveniente da agricultura, o Brasil é um país com elevado potencial para o desenvolvimento de tecnologias que possibilitem a utilização desses materiais como substrato para produtos de maior valor agregado. Dessa forma, o estudo da expressão de genes microbianos relacionados com a degradação da parede celular vegetal tem despertado a atenção de pesquisadores, principalmente pelo fato de estar relacionado com a possibilidade de síntese controlada e em larga escala de enzimas utilizadas na produção de biocombustíveis. Neste contexto, a bactéria gram-negativa Caulobacter crescentus encontra-se como um microrganismo promissor para a exploração biotecnológica em função da capacidade que tem de degradar o xilano, principal componente hemicelulósico das plantas. Essa bactéria contém em seu genoma vários genes que codificam para xilanases e β-xilosidases. Dentre eles o gene xynB3 (CCNA_00856), que apresenta 1623 nucleotídeos e codifica uma proteína contendo domínios conservados de β-xilosidase, com 540 resíduos de aminoácidos, denominada neste trabalho como β-xilosidase III de C. crescentus. Com o objetivo de possibilitar em estudos futuros a caracterização bioquímica dessa proteína, foi estudado o gene xynB3. Para isso, xynB3 foi isolado a partir do DNA genômico de C. crescentus NA1000 por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando oligonucleotídeos específicos. O único produto de amplificação foi clonado no vetor pJet1.2blunt em sítios não coesivos e reintroduzido no vetor de expressão pTrcHisA dentro do quadro de leitura para a produção de uma cauda de histidinas na região amino-terminal da proteína de fusão. A construção obtida foi denominada pTricHis-xynB3 e após confirmação da identidade da mesma por sequenciamento de DNA foi inserida na cepa TOP10 de Escherichia coli e submetida a ensaios experimentais de expressão com diferentes temperaturas de crescimento, concentrações de IPTG e tempos de indução. A proteína recombinante foi super-expressa em corpos de inclusão, portanto, em uma forma não solúvel. Diferentes protocolos de indução e purificação foram empregados para obtenção da β-xilosidase III de C. crescentus pura, em forma nativa ou não nativa. Entretanto, nos ensaios de atividade enzimática, com diferentes substratos, foram obtidos níveis de atividade de β-xilosidase não detectáveis pelas ferramentas utilizadas. Esses resultados sugerem que a enzima não se mostrou ativa durante os ensaios, em função da formação de corpos de inclusão. Isso leva a crer que essa proteína pode apresentar efeito tóxico para E. coli quando expressa em níveis elevados. Assim, este trabalho contribui com dados adicionais a cerca do complexo xilanolítico da bactéria aquática C. crescentus.

A furosemida é um fármaco de ação diurética e amplamente utilizado em tratamentos de doenças renais, cardíacas e pulmonares. Sua absorção é problemática e de alta variabilidade inter e intraindividual. Este fármaco tem sido classificado como pertencente às classes II (baixa solubilidade e alta permeabilidade) ou IV (baixa permeabilidade e baixa solubilidade) do Sistema de Classificação de Biofarmacêutica (SCB). Em estudos anteriores da equipe de pesquisa, SPRICIGO e colaboradores (2008) e SILVA (2014) desenvolveram complexos de furosemida com hidroxipropil-&#946;-ciclodextrina que permitiram a otimização da solubilidade deste fármaco. Entretanto, dados sobre a sua permeabilidade intestinal, quando complexado, não foram determinados. Somando-se a isto, a literatura apresenta informações distintas em relação a este parâmetro, o que corrobora a importância de se avaliar a permeabilidade deste fármaco. Diversas técnicas têm sido empregadas para a avaliação da permeabilidade intestinal dos fármacos. No presente trabalho empregou-se o modelo de perfusão in situ de passagem tripla, cuja técnica possibilita avaliar a permeabilidade em três segmentos diferentes em um mesmo animal e ainda, apresenta características interessantes, pois trata-se de um método que proporciona, durante todo o experimento, condições mais próximas daquelas encontradas durante o processo in vivo de absorção de fármacos no intestino tais como: suprimento sanguíneo, inervação intacta, preservação das proteínas transportadoras de membranas e presença da camada de muco. O presente trabalho foi dividido nas seguintes etapas: (i) obtenção da furosemida complexada com hidroxipropil-&#946;-ciclodextrina, (ii) caracterização dos fármacos utilizando técnicas de análises térmicas, (iii) estudo de perfusão in situ de passagem tripla nos três segmentos intestinais (duodeno, jejuno e íleo) de ratos machos Wistar na ausência e na presença de inibidores da glicoproteína P e de enzimas metabolizadoras CYP3A4 com posterior análise estatística do impacto da ciclodextrina e inibidores na permeabilidade da furosemida e; (iv) análise histológica das microvilosidades intestinais após o ensaio de perfusão in situ nos três segmentos intestinais. Os valores encontrados em cada segmento para furosemida complexada foram: 8,58 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1; 9,15 ± 0,003 x10-5 cm.s-1 e; 8,06 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1, respectivamente para duodeno, jejuno e íleo enquanto que para furosemida pura encontraram-se os seguintes: 3,42 ± 0,08 x 10-5 cm.s-1 para duodeno; 3,87 ± 0,11 x 10-5 cm.s-1 para jejuno e 3,08 ± 0,001 x 10-5 cm.s-1 para íleo. Assim sendo, os valores obtidos para a permeabilidade da furosemida complexada foram significativamente superiores (p < 0,05) aos da furosemida pura, sugerindo que, a ciclodextrina pode ter influência no mecanismo de transporte da furosemida, que é via passiva paracelular. Quanto aos mecanismos envolvidos na permeabilidade da furosemida através dos enterócitos, pode-se sugerir que observou-se pouca influência dos inibidores da glicoproteína P (P-gp) e da enzima CYP3A4, sugerindo que não há uma participação importante destes mecanismos em sua absorção intestinal. / Furosemide, which is a diuretic drug, is widely used in heart, kidney and pulmonary disease treatments. The absorption is problematic with high variability inter and intra individuals. This drug has been classified as belonging to class II (low solubility and high permeability) or IV (low permeability and low solubility) of the Biopharmaceutical Classification System (BCS). In previous studies of the research team, Spricigo and colleagues (2008) and Silva (2014) developed complex of furosemide with hydroxypropyl-&#946;-cyclodextrin which allowed the optimization of the solubility of this drug. However, datas concerning it\'s intestinal permeability, when complexed, have not been determined. Addicted to this, the literature shows many information regarding to this parameter, which confirms the importance of the evaluation of the permeability of this drug. Some techniques have been employed in order to evaluate the intestinal permeability of drugs. In the present work, a triple single-pass intestinal perfusion technique was used for three different segments. This technique enables the evaluation of the permeability of different segments in the same animal and also has interesting features such as: it provides during all the experiment conditions closer to those found in in vivo process of a drug absorption in the gut; blood supply; intact innervations; preservation of membrane transporter proteins and presence of mucus layer. This study was divided into the following steps: (i) obtaining furosemide complexed with hydroxypropyl-&#946;-cyclodextrin, (ii) characterization of drugs using techniques of thermal analysis, (iii) perfusion study in situ triple passage in three segments (duodenum, jejunum and ileum) from male Wistar rats in the absence and presence of inhibitors of P-glycoprotein and metabolizing enzymes CYP3A4 and subsequential statistical analysis of the impact of the cyclodextrin and the inhibitors in the permeability of furosemide and (iv) histological analysis of intestinal microvilli after in situ perfusion assay in three segments. The values found in each segment for complexed furosemide were: 8,58 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1; 9,15 ± 0,003 x 10-5 cm.s-1; 8,06 ± 0,002 x 10-5 cm.s-1, respectively for duodenum, jejunum and ileum while for pure furosemide, the values were: 3,42 ± 0,08 x 10-5 cm.s-1 to duodenum; 3,87 ± 0,11 x 10-5 cm.s-1 to jejunum and 3,08 ± 0,001 x 10-5 cm.s-1 to ileum. Thus, the values obtained for the permeability of the complexed furosemide were significantly higher (p < 0,05) than those found for pure furosemide, suggesting that the cyclodextrin might have an influence on the transport mechanism of furosemide, which is passive paracellular route. About the mechanisms involved in the permeability of furosemide through the enterocytes, it can be suggested that there was little effect of P-glycoprotein (P-gp) inhibitors and CYP3A4 enzyme, suggesting that there is an important role of these mechanisms in the furosemide intestinal absorption.

O trabalho de tese é dividido em dois capítulos e visou explorar a química das diazocetonas &#945;,&#946;-insaturadas bem como dos ilídeos &#946;-cetosulfoxônios. No primeiro capítulo é apresentado o emprego das diazocetonas &#945;,&#946;-insaturadas como novos aceptores em reações de aza-Michael. A adição conjugada de aminas primárias e secundárias foi explorada, assim como o uso de aminas quirais para avaliar a versão assimétrica da reação. Além da formação desses adutos, também foram investigadas estratégias para a construção de heterocíclicos nitrogenados a partir destes ou via protocolos \"one-pot\" (partindo das diazocetonas &#945;,&#946;-insaturadas) levando à formação de 2- e 3-pirrolidinonas. Por fim, foi avaliada a aplicação da metodologia desenvolvida na síntese do produto natural Barmumicina. O segundo capítulo se dispôs a investigar o emprego dos ilídeos &#946;-cetosulfoxônios como substitutos de compostos diazocarbonílicos em reações de inserção. Num primeiro momento, avaliaram-se reações de inserção S-H intermolecular, visando a construção do fragmento &#946;-cetotioéter. Alguns estudos competitivos e mecanísticos, bem como estratégias assimétricas também compõem o escopo. Num segundo momento, os ilídeos foram empregados em reações de inserção N-H intramolecular, no qual, a partir de sulfoxônios derivados de aminoácidos, vislumbrou-se a formação de 3-azetidinonas. / This thesis is divided into two chapters which are related to the chemistry of &#945;,&#946;-unsaturated diazoketones and &#946;-ketosulfoxonium ylides. The first chapter presents the utility of &#945;,&#946;-unsaturated diazoketones as new aza-Michael acceptors. Conjugate addition of primary and secondary amines was explored, as well as the use of chiral amines to evaluate the asymmetric version of the reaction. In addition to the formation of these adducts, it was also investigated some strategies for the synthesis of 2- and 3-pyrrolidinones via the \"one-pot\" protocols (starting directly from the &#945;,&#946;-unsaturated diazoketones). Finally, the synthesis of the natural product Barmumicyn was evaluated from this methodology. The second chapter aimed to investigate the use of &#946;-ketosulfoxonium ylides as diazocarbonyl compounds substitutes in insertion reactions. At first, the intermolecular S-H insertion reaction was studied aiming the construction of the &#946;-ketothioether fragment. Some competitive and mechanistic studies, as well as asymmetric versions are also part of the scope. Secondly, some ylides were also employed in intramolecular N-H insertion reactions (from sulfoxonium amino acid derivatives) aiming the formation of 3-azetidinones.

A causa de morte da maioria das pacientes com câncer de mama se deve à doença metastática desenvolvida a partir do tumor primário. A degradação dos componentes da matriz extracelular (MEC), um dos principais eventos do processo metastático, é regulada pelo balanço entre as atividades das metaloproteinases de matriz (MMPs) e dos seus inibidores, tanto os inibidores teciduais (TIMPs) como o inibidor associado à membrana (RECK). Contudo, ainda existe pouca informação sobre os mecanismos moleculares responsáveis pela manutenção deste balanço. No presente trabalho, foi investigado o envolvimento de TGF-&#946;1 (Transforming Growth Factor-&#946;1), uma citocina multifuncional é capaz tanto de inibir o crescimento celular, quanto de promover invasão e metástase, dependendo do estadiamento e do tipo de tumor, na regulação da expressão de MMPs, TIMPs e RECK, em modelo de câncer de mama. Primeiramente, examinou-se os níveis de expressão de mRNA das isoformas e receptores de TGF-&#946;, em um painel de cinco linhagens de carcinoma mamário humano, com diferentes potenciais invasivos e metastáticos, por qRT-PCR. Os resultados obtidos demonstraram uma correlação positiva entre a expressão dessas moléculas, e a progressão do caráter invasivo e metastático celular. Em seguida, a linhagem altamente invasiva, MDA-MB-231, foi tratada com diferentes concentrações de TGF-&#946;1 recombinante. Esta citocina foi capaz de modular a expressão gênica de MMPs (MMP-2 e MMP-9) e de seus inibidores (TIMP- 2 e RECK). Tanto ERK½, quanto p38MAPK mostraram-se envolvidas neste mecanismo. Foi demonstrado que a inibição da atividade de ERK½ alterou a expressão das proteínas MMP-9, TIMP-2 e RECK, enquanto o bloqueio de p38 MAPK afetou os níveis protéicos de MMP-2 e TIMP-2. O aumento do potencial migratório e invasivo da linhagem MDA-MB-231, induzido por TGF-&#946;1, mostrou-se também dependente da atividade de MMPs, ERK½ e p38MAPK. Dada a ausência de informações sobre o papel de RECK em modelo mamário, a função deste inibidor de MMPs também foi investigada. Primeiramente, analisou-se a expressão de RECK ao longo do desenvolvimento da mama e, posteriormente, em 1040 amostras tumorais de mama humana, através da metodologia de Tissue Microarray, tendo sido possível demonstrar que a alta expressão de RECK associa-se a menor tempo de sobrevida global e livre de doença em 10 anos. Os resultados obtidos indicaram que a expressão da proteína RECK, em oposição ao verificado em outros tipos de tumores, está relacionada ao fenótipo mais agressivo de tumores de mama. Entretanto, a análise funcional de RECK, realizada por meio da utilização de vetores shRNA específicos para a inibição desta proteína, demonstrou que RECK também atua como um inibidor de invasão celular e da expressão de MMP-9, na linhagem MDA-MB-231. Em conjunto, os resultados obtidos neste trabalho contribuíram para a elucidação dos mecanismos moleculares de regulação de RECK, por clássicas moléculas associadas ao processo de tumorigênese (TGF-&#946;1 e MAPKs), bem como para o esclarecimento de suas funções em modelo mamário, sugerindo-o como mais um promissor candidato a marcador prognóstico e alvo molecular para a terapia do câncer de mama. / The metastatic disease is the main mortality cause of breast cancer patients. The metastatic process involves a complex cascade of events, including the organized breakdown of the extracellular matrix (ECM) compounds. The degradation of ECM is tightly regulated by the balance between the activities of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors, the tissue inhibitors (TIMPs) and the membrane-associated inhibitor (RECK). Among the several molecules released and activated by ECM remodeling, TGF-&#946;1 (Transforming Growth Factor-&#946;1) is a multifunctional cytokine able to regulate both cell growth inhibition and invasion and metastasis promotion, depending on the tumor stage and type. Since the molecular mechanisms involved in the ECM remodeling control are still not completed understood, in this study, we investigated the involvement of TGF-&#946;1 in regulating of MMPs, TIMPs and RECK expression, in the breast cancer model. By qRT-PCR, we first examined the gene expression levels of TGF-&#946; isoforms and receptors, in a panel of five human breast cancer cell lines displaying different degrees of invasiveness and metastatic potential. Our results suggest a positive correlation between the mRNA expression of these molecules and the breast cancer progression. Moreover, the highly invasive breast cancer cell line MDA-MB-231 was treated with different concentrations of recombinant TGF-&#946;1. We described that this cytokine was able to modulate the gene expression of MMPs (MMP-2 and MMP-9) and MMPs inhibitors (TIMP-2 and RECK) at both the mRNA and protein levels, with ERK½ and p38 MAPK being involved in this molecular mechanism. However, while ERK½ activity inhibition altered MMP-9, TIMP-2 and RECK expression, the p38 MAPK blockage affected the protein levels of MMP-2 and TIMP-2. Finally, we reposted that the TGF-&#946;1-enhanced migration and invasion capacities of MDA-MB- 231 cells were blocked by MMPs, ERK½ and p38 MAPK inhibitors. Analysis of the RECK function in the breast model was also an objective of this study. We analyzed RECK expression during mammary gland development. We evaluated the RECK protein profile in 1040 breast tumor tissue samples using Tissue Microarray assays. We demonstrated that high expression levels of RECK were associated with shorter overall and disease-free survival in 10 years. Moreover, we verified that RECK is a biomarker of poor prognosis mainly for patients diagnosed with less aggressive breast tumor. Therefore, in contrast to other tumor types, our results indicate that high protein expression levels of RECK are related to a more aggressive phenotype. In fact, the RECK functional analysis, performed by using of shRNA vectors, showed that RECK function remains as an inhibitor of cellular invasion and MMP-9 expression, in MDA-MB-231 cells. Taken together, our results contribute to better understanding of the molecular mechanisms associated to RECK regulation by TGF-&#946;1 and MAPK as well as to clarify its role in breast model. Thus, we suggests RECK as a new and promising prognostic marker and molecular target candidate for breast cancer therapy.

Algumas das estratégias utilizadas para entender a biologia de células tronco embrionária (CTE) são baseadas na identificação de cascatas de sinalização que induzem a diferenciação e auto-renovação das CTE através da interferência seletiva de processos específicos. A família das proteínas quinase C (PKC) é conhecida por participar dos processos de auto-renovação e diferenciação celular em CTE, entretanto, o papel específico das diferentes isoenzimas das PKCs ainda precisa ser elucidado. Desta forma investigamos. o papel das PKCs atípicas (aPKCs) em CTE indiferenciadas utilizando um inibidor específico para estas serina/ treonina quinases, o peptídeo pseudossubstrato das aPKCs, e fosfoproteômica. A maioria das proteinas identificadas cuja fosforilação reduziu após o tratamento com o inibidor das aPKC, são proteínas envolvidas com o metabolismo principalmente com a via glicolítica. Além disso, a inibição das aPKCs levou a redução do consumo de glicose, secreção de lactato, acompanhada da redução da atividade da lactato desidrogenase, e aumento da fosforilação oxidativa, sendo analisada através do consumo de oxigênio após o tratamento com oligomicina e FCCP. Verificamos também que as aPKCs são capazes de fosforilar diretamente a piruvato quinase. A glicólise aeróbica parece ser fundamental para a manutenção da indiferenciação das CTE, e demonstramos que as aPKCs participam deste processo auxiliando na auto-renovação das CTE indiferenciadas. Também observamos que as aPKCs assim como a PKC&#946;I modulam a fosforilação da &#945;-tubulina, porém ao passo que as aPKCs interagem com a &#945;-tubulina durante a interfase, a PKC&#946;I interage com a mesma apenas durate a mitose. Estes resultados motivaram a segunda parte da tese, na qual o papel da fosforilação da &#945;-tubulina pela PKC&#946;I foi investigado. O resíduo de treonina 253, conservado em diversas espécies de vertebrados e localizado na interface de polimerização entre a &#945;- e a &#946;-tubulina foi identificado, como um novo sítio de fosforilação da &#945;-tubulina pela PKC&#946;I. Este sítio não está em um consenso linear para a PKC, entretanto é um consenso formado estruturalmente, onde aminoácidos básicos distantes na sequência linear se tornam justapostos na estrutura terciária da proteína. Estudos de simulação por dinâmica molecular demonstraram que a interação entre a &#945; e &#946;-tubulina aumenta após esta fosforilação, uma vez que T253 fosforilada passa a interagir com K105, um residuo conservado na &#946;-tubulina. A fosforilação in vitro de &#945;-tubulina aumenta a taxa de polimerização da tubulina e a inibição da PKC&#946;I em células reduziu a taxa de repolimerização do microtubulo após o tratamento com nocodazol. Além disso, a importância da fosforilação deste sítio foi demonstrada pelo fato de que um mutante fosfomimético GFP-&#945;-tubulina, T253E ser mais incorporado no fuso mitótico ao passo que T253A foi menos incorporado do que a proteína selvagem. Nossos dados suportam a hipótese que os consensos estruturais formados podem ser importantes sítios de reconhecimento pelas quinases e que a fosforilação de T253 da &#945;-tubulina afeta a estabilidade do polímero. Em conclusão, utilizando métodos de fosfoproteômica e interferência seletiva de vias de sinalização, combinados a validações experimentais dos alvos identificados podemos propor a importância funcional das aPKCs e PKC&#946;I em CTE indiferenciadas. / Some of the strategies used to understand stem cell biology are based on the identification of signalling cascades that lead to differentiation and self-renewal of embryonic stem cells (ESC) by selective interference of specific signalling processes. The protein kinase C (PKC) family is known to participate in ESC self-renewal and differentiation, however, the specific role of the different PKC isoenzymes in these cells remains to be determined. Therefore, we investigated the role of atypical PKCs (aPKC) in undifferntiated ESC using a specific inhibitor for these serine/ threonine kinases, pseudo-substrate peptide of aPKCs, and phosphoproteomics. The majority of proteins whose phosphorylation decreased upon aPKC inhibition, are proteins involved in metabolism in particular with the glycolytic pathway. Besides that, inhibiton of aPKCs led to a decrease in glucose uptake and lactate secretion, followed by a decrease in lactate dehydrogenase activity, and an increase in mitochondrial activity as measured by oxygen consumption after treatment with olygomycin and a chemical uncoupler. We also verified that aPKCs are able to directly phosphorylated pyruvate kinase. Aerobic glicolysis seems to be fundamental for the maintainance of undifferentiated ESC, and we demonstrated that aPKCs participte in these processes helping to maintain self-renewal of undifferentiated ESC. We also observed that aPKCs as PKC&#946;I modulate the phosphorylation of &#945;-tubulin, however, while aPKCs interact with &#945;-tubulin during interfase PKC&#946;I interacts with &#945;-tubulin only during mitosis. These results lead to the second part of this thesis. We investigated the role of &#945;-tubulina phosphorylation by PKC&#946;I. Indentifying threonine 253, a conserved residue in several vertebrate species, of localized at the polymerization interface between &#945;- and &#946;-tubulin, as a phosphorylation site of &#945;-tubulin by PKC&#946;I. This site is not in a linear consensus for PKC, however, it is in a structuraly formed consensus, where basic aminoacids distant in the linear sequence are juxtaposed in the three dimentional protein structure. Simulation studies by molecular dynamics show that the interaction between &#945; and &#946;-tubulin increases upon this phosphorylation, once, phosphorylated T253 interacts with com K105, a conserved residue in &#946;-tubulin. The in vitro phosphorylation of &#945;-tubulin increased tubulin polymerization rate and inhibiton of PKC&#946;I in cells reduced repolimeration rate of microtubles upon treatment with nocodazole. Besides that, the importance of this phosphorylation site were demonstrated by the fact that a phosphomimetic mutant GFP-&#945;-tubulina, T253E is more incorporated in mitotic fuses while T253A is less than wild type. Our data support the hypothesis that structural consensus may be important sites recognized and that T253 phosphorylation of &#945;-tubulin afects the polymer stability. In conclusion, using phosphoproteomics methods and selective interference of signal transduction pathways combined with experimental validation studies of the identified targets we can propose roles for aPKCs and PKC&#946;I in undifferentiated ESC.

A Escherichia coli enteropatogênica atípica (aEPEC) é um dos principais agentes causadores de diarreia infantil e às vezes é necessário o tratamento com antimicrobianos. O objetivo do presente trabalho foi verificar o perfil de resistência aos antimicrobianos de 72 amostras de aEPEC, correlacionando com o perfil genético de resistência e a produção de &#946;-lactamases de espectro extendido (ESBL). As aEPEC apresentaram resistência aos &#946;-lactamâmicos, sulfonamidas, tetraciclinas, aminoglicosídeos e ansamicina, verificadas através de disco difusão. Multirresistência foi identificada em 27,8%. Treze amostras (18,1%) produziram ESBL. Os genes de resistência encontrados através de PCR foram: sul1 - 50%, sul2 - 86,4%, tetA - 42,1%, tetB - 68,4%, tetC- 5,3%, blaCTX-M - 26,1%, blaTEM -78,3%, blaSHV - 4,4% e intl - 35,7%. O conhecimento sobre o perfil de resistência e produção de ESBLs é muito importante na orientação do tratamento adequado quando se fizer necessário, além de conhecer o potencial de resistência que poderiam vir a ser transferidos para outras bactérias. / The atypical Enteropathogenic Escherichia coli (aEPEC) is one of the most common childhood diarrhea`s agent, and sometimes the antimicrobials treatment may be necessary. The aim of this study was verify the antimicrobial resistance profile of 72 aEPEC strains, correlating with the resistance genetic profile, and the extended-spectrum &#946;-lactamases (ESBL) production. The aEPEC strains presented resistance to &#946;-lactams, Sulfonamides, Tetracycline, Aminoglycoside, and Ansamycin, verified through disc diffusion. Multiresistance was identified in 27.8%. Thirteen strains (18.1%) produced ESBL. The resistance genes found through PCR were: sul1 - 50%, sul2 86.4%, tetA 42.1%, tetB 68.4%, tetC- 5.3%, blaCTX-M 26.1%, blaTEM -78.3%, blaSHV 4.4%, and intl 35.7%. The knowledge about resistance profile´s and ESBL production is very important in guiding the most appropriate treatment when it is necessary, in addition to knowing the resistance potential that could be transferred to other bacteria.

O trabalho de tese é dividido em dois capítulos e visou explorar a química das diazocetonas &#945;,&#946;-insaturadas bem como dos ilídeos &#946;-cetosulfoxônios. No primeiro capítulo é apresentado o emprego das diazocetonas &#945;,&#946;-insaturadas como novos aceptores em reações de aza-Michael. A adição conjugada de aminas primárias e secundárias foi explorada, assim como o uso de aminas quirais para avaliar a versão assimétrica da reação. Além da formação desses adutos, também foram investigadas estratégias para a construção de heterocíclicos nitrogenados a partir destes ou via protocolos \"one-pot\" (partindo das diazocetonas &#945;,&#946;-insaturadas) levando à formação de 2- e 3-pirrolidinonas. Por fim, foi avaliada a aplicação da metodologia desenvolvida na síntese do produto natural Barmumicina. O segundo capítulo se dispôs a investigar o emprego dos ilídeos &#946;-cetosulfoxônios como substitutos de compostos diazocarbonílicos em reações de inserção. Num primeiro momento, avaliaram-se reações de inserção S-H intermolecular, visando a construção do fragmento &#946;-cetotioéter. Alguns estudos competitivos e mecanísticos, bem como estratégias assimétricas também compõem o escopo. Num segundo momento, os ilídeos foram empregados em reações de inserção N-H intramolecular, no qual, a partir de sulfoxônios derivados de aminoácidos, vislumbrou-se a formação de 3-azetidinonas. / This thesis is divided into two chapters which are related to the chemistry of &#945;,&#946;-unsaturated diazoketones and &#946;-ketosulfoxonium ylides. The first chapter presents the utility of &#945;,&#946;-unsaturated diazoketones as new aza-Michael acceptors. Conjugate addition of primary and secondary amines was explored, as well as the use of chiral amines to evaluate the asymmetric version of the reaction. In addition to the formation of these adducts, it was also investigated some strategies for the synthesis of 2- and 3-pyrrolidinones via the \"one-pot\" protocols (starting directly from the &#945;,&#946;-unsaturated diazoketones). Finally, the synthesis of the natural product Barmumicyn was evaluated from this methodology. The second chapter aimed to investigate the use of &#946;-ketosulfoxonium ylides as diazocarbonyl compounds substitutes in insertion reactions. At first, the intermolecular S-H insertion reaction was studied aiming the construction of the &#946;-ketothioether fragment. Some competitive and mechanistic studies, as well as asymmetric versions are also part of the scope. Secondly, some ylides were also employed in intramolecular N-H insertion reactions (from sulfoxonium amino acid derivatives) aiming the formation of 3-azetidinones.

Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας (ΚΤΜ), αποτελεί παγκοσμίως έναν από τους συχνότερα εμφανιζόμενους καρκίνους στο γυναικείο πληθυσμό. Ο ΚΤΜ επιφέρει σημαντική ψυχολογική, κοινωνική και οικονομική επιβάρυνση στους ασθενείς και στα συστήματα υγείας. Η κυριότερη αιτία εμφάνισης της νόσου συσχετίζεται με τη μόλυνση από τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων – HPV (Human papilloma virus). O HPV συγκαταλέγεται στους πιο συχνά σεξουαλικ ώςμεταδιδόμενους ιούς. Ένα από τα μεγαλυτερα βήματα της δημόσιας υγείας για την προφύλαξη του πληθυσμού έναντι του HPV και κατ’ επέκταση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, είναι η εισαγωγή του εμβολίου στο Εθνικό Πρόγραμμα Εμβολιασμού. Στα παρακάτω κεφάλαια (θεωρητικό μέρος) γίνεται εκτενής περιγραφή της ιστοπαθολογίας του ΚΤΜ και της βασικής βιολογίας του HPV, καθώς επίσης και του μηχανισμού δράσης του εμβολίου έναντι του ιού. Εν συνεχεία, στο ειδικό μέρος της παρούσας διπλωματικής εργασίας παρατίθενται στοιχεία που αφορούν την ευαισθητοποίηση και την αποδοσχή του πληθυσμού για τον προληπτικό εμβολιασμό έναντι του ιού HPV. / -

Ce travail s'inscrit dans la recherche et le développement de nouvelles molécules à visée thérapeutique via la mise au point de cyclisations radicalaires oxydatives médiées par l'acétate de manganèse(III). Deux problématiques ont dirigé nos recherches. Tout d'abord, nous avons développé une stratégie de synthèse de prodrogues analogues de la pafuramidine, molécule antileishmanienne. Ainsi, une 1ère série d'amidoximes a été obtenue à partir de &#946;-cétosulfones par une synthèse multi-étapes faisant appel aux réactions i) de cyclisations radicalaires oxydatives médiées par Mn(OAc)3 et ii) de couplages pallado-catalysées de Buchwald-Hartwig et de Heck. Suite à l'évaluation biologique in vitro sur Leishmania donovani et sur des cellules humaines, une 2ème série d'amidoximes et en particulier des monoamidoximes a été réalisée, ce qui a révélé une molécule présentant un index de sélectivité 40 fois plus élevé que celui de la pentamidine, médicament utilisé comme référence. Nous avons également mis au point un double couplage "one-pot" de Buchwald-Hartwig dans le but d'obtenir des produits dicouplés dissymétriques, précurseurs éventuels de futures diamidoximes. Dans une deuxième partie, nous nous sommes focalisés sur la synthèse de composés spirocycliques pouvant constituer un pharmacophore original. De ce fait, une stratégie de synthèse conduisant à divers noyaux tels des tétralines spirocycliques, des spirolactones, des spirobenzophénanthrédin-6(5H)-ones a été mise au point. Ce travail nous a également menés vers la synthèse de dérivés thiobarbiturates, analogues de composés anesthésiques ou anticonvulsivants. / This work focuses on the research and development of new therapeutic molecules through optimized radical cyclizations mediated by manganese(III) acetate. Two problematics directed our research. First, we developed analogous prodrugs of pafuramidine, an antileishmanial molecule. Thus, a 1rst series of amidoximes was obtained from &#946;-ketosulfones by a multi-step synthesis involving i) radical oxidative cyclizations mediated by Mn(OAc)3 and ii) pallado-catalyzed Buchwald-Hartwig and Heck coupling reactions. The 1rst series being biologically evaluated in vitro, both on Leishmania donovani and human cells, a 2nd series and particularly monoamidoximes was prepared and revealed a molecule presenting a selectivity index 40 times higher than the one of pentamidine, used as reference drug compound. We also developed a one-pot double Buchwald-Hartwig coupling reaction in the aim to obtain dissymmetric dicoupled products, potential precursors of future diamidoximes. In a second time, we focused on the synthesis of spirocyclic compounds which could constitute an original pharmacophore. Therefore, we performed a synthesis allowing access to a wide variety of scaffolds such as spirocyclic tetralins, spirolactones, spirobenzophenanthridin-6(5H)-ones. This work allowed the synthesis of thiobarbiturates, analogous of anesthetic or anticonvulsive compounds.

La musique d’al-Andalus a fait couler beaucoup d’encre. Différents mythes et constructions historiographiques circulent à son sujet. Pourtant, elle n’a jamais réellement été étudiée dans une perspective historique, alors même qu’elle se situe à la croisée d’enjeux cruciaux pour la société andalousienne. Traces matérielles d’une pratique musicale profane se déroulant dans des contextes festifs et de loisirs, les instruments se trouvent au cœur de nombreuses problématiques comme le contrôle des mœurs par les juristes, la mise en scène du pouvoir politique, les échanges culturels avec l’Orient et leur rôle dans la construction d’une identité andalousienne. Ils ne peuvent être appréhendés qu’en mobilisant des sources variées, aussi bien textuelles qu’iconographiques ou archéologiques. Une analyse de la façon dont ils étaient définis et envisagés dans la société andalousienne a ainsi été menée grâce au croisement de ces sources. Cette approche a également permis de dresser un panorama des instruments effectivement en usage en al-Andalus entre le IIIᵉ/IXᵉ siècle, période d’apparition des premières sources, et le tournant des VIᵉ/XIIᵉ-VIIᵉ/XIIIᵉ siècles, quand la réduction territoriale d’al-Andalus et l’intensité des échanges culturels avec le reste de la péninsule et le Maghreb limitent la pertinence d’une étude de la musique dans le stricte cadre andalousien. Enfin, la mise en parallèle des différents types de sources a aussi éclairé les pratiques sociales et les discours politiques convoquant les instruments. / A lot has been written about al-Andalus’ music. Various myths and misconceptions pervade its historiography. Furthermore, it has never really been studied from an historical point of view, even though it stands at the crossroads of several issues central to al-Andalus’s society. Musical instruments can be studied as material traces of a profane musical practice taking place in celebrative and leisure contexts. They raise numerous questions, such as the setting of moral regulations by religious authorities, the representation of political power, the staging of cultural exchanges between East and West Islamic worlds and the development of an Andalusian identity. A comprehensive study of Andalusian musical instruments requires an analysis of iconographical evidence and archaeological material as well as written sources. It is indeed impossible to grasp the definition and the conception of lusical instruments in Andalusian society without comparing different types of sources. This multidisciplinary perspective also helped in understanding the panorama of the instruments in use in al-Andalus between the 3rd/9th Century – when the first sources can be dated – and the end of the 6th/12th Century – when a study of Andalusian music has to leave al-Andalus’ shrinking borders to focus as well on the cultural exchanges with the rest of the Peninsula and the Maghreb. Finally, a detailed investigation of social practices and political discourses using musical instruments can only be conducted through the study of various sources.