As a class, protein-based therapeutics offer tremendous advantages over traditional small molecule drugs. Due to their sizes and folding energies, proteins are ideal for catalyzing chemical reactions, and can bind tightly and selectively to extended target surfaces. However, due to their large size, virtually all proteins are unable to spontaneously enter cells, and as a result protein therapeutics are restricted to extracellular targets. We developed a platform for delivery of proteins to intracellular target sites by engineering the surface chemistry of a model protein, green fluorescent protein (GFP). We found that 'supercharged' cationic GFP variants (scGFPs) bind to anionic cell surface molecules and initiate endocytosis, resulting in the efficient delivery of translationally fused cargo to intracellular targets. We discovered that scGFPs, and cationic delivery reagents in general, alter endosomal trafficking in a manner proportional to both their charge and their delivery efficiency, suggesting that avoidance of endosomal maturation is a key step in the endosomal escape of delivered protein cargos. We also developed a method for encapsulation of recombinant proteins by cationic lipid delivery reagents using negatively supercharged GFP. Genetic modification technologies have matured rapidly following the discovery of protein classes with programmable DNA-binding specificities. While site-directed genetic knockout technologies are highly effective, targeted integration and repair remain comparatively inefficient. Site-specific recombinases directly catalyze strand exchange and ligation between DNA molecules, offering an approach to efficient genomic integration. However, most site-specific recombinases are not easily reprogrammable. To address this problem, we developed a genetic selection technique based on the Phage-Assisted Continuous Evolution (PACE) system, to enable the rapid evolution of recombinase proteins towards targets of interest. Using Cre recombinase as a model, the PACE system was optimized, validated, and used to evolve Cre variants with higher activity on their native loxP target site, as well as altered specificity towards a human genomic sequence within the hROSA26 locus. Finally, we developed a method for enhancing the specificity of RNA-guided nucleases by restricting activity to sites of obligate dimeric nuclease assembly. We engineered a FokI nuclease fusion to a catalytically inactivated Cas9 protein that mediates efficient modification with significantly reduced off-target activity.

Le système de recombinaison Xer est impliqué dans la monomerisation des réplicons bactériens, comme les plasmides et les chromosomes, dans une grande variété de bactéries. Ce système est un système de recombinaison site-spécifique composé de deux tyrosine recombinases, soit XerC et XerD. Ils agissent ensemble afin de convertir les chromosomes dimériques en monomères en agissant à un site spécifique près du terminus de la réplication, appelé le site dif. Les gènes Xer et leur site d’action sont identifiés dans plusieurs bactéries gram positives et gram négatives. Staphylococcus aureus représente une bactérie gram positive qui contient un système XerCD/dif. Elle est impliqué dans plusieurs maladies humaines, tels que des infections cutanées, des gastroentérites, et le syndrome de choc toxique, pour en nommer quelques unes. Bien que les gènes codant les protéines XerC et XerD ont été identifiés, il y a beaucoup d’inconnu sur leur mode d’action au site dif. Des mutations dans XerC ont été obtenues, mais aucune dans XerD, suggérant que ce gène pourrait être essentiel pour cet organisme. Les études présentées dans ce mémoire ont permis de commencer à mieux caractériser XerD de S. aureus, en séquençant le gène et en faisant des tests de liaison à l’ADN. Elles ont montré que la recombinase XerD se lie au site dif d’Eschericia coli seul et de façon coopérative avec la recombinase XerC d’E. coli. XerD de S. aureus est, aussi, efficace dans la complémentation de XerD muté d’E. coli dans la réaction de recombinaison chromosomique. Cependant, elle ne démontre pas cette même capacité de complémentation lors de la recombinaison plasmidique aux sites cer. / The Xer recombination system is involved in the monomerisation of bacterial replicons, such as plasmids and chromosomes, in a wide variety of bacteria. This system is a site-specific recombination system comprised of two tyrosine recombinases, XerC and XerD, which act in concert to convert dimeric chromosomes to monomers by acting at a specific site near the terminus of replication called the dif site. Xer genes and their site of action have been identified in many gram positive and gram negative bacteria. Staphylococcus aureus represents a gram positive bacterium containing a XerCD/dif system. It is a bacteria implicated in many human diseases, such as skin infections, gastroenteritis and toxic shock syndrome, to name a few. Although the genes encoding the XerC and XerD proteins have been identified, not much is known about their mode of action on the dif site. Mutations in xerC have been obtained, but none in xerD, suggesting that this gene may be essential for this organism. The work presented in this paper has allowed us to better understand the XerD protein of S. aureus, not only in the sequencing of the xerD gene but also in the performing of DNA binding assays. It has been shown that XerD binds to the dif site of E. coli, not only alone but also in cooperativity with E. coli XerC. S. aureus XerD is also capable of complementing the mutated XerD protein in E. coli when it comes to chromosomal recombination. However, it does not demonstrate this same ability to complement XerD regarding recombination at the plasmidic cer sites.

Chez les bactéries à chromosome circulaire, la réplication peut engendrer des dimères que le système de recombinaison site-spécifique dif/Xer résout en monomères afin que la ségrégation des chromosomes fils et la division cellulaire se fassent normalement. Ses composants sont une ou deux tyrosines recombinases de type Xer qui agissent à un site de recombinaison spécifique, dif, avec l’aide de la translocase FtsK qui mobilise l’ADN au septum avant la recombinaison. Ce système a été d’abord identifié et largement caractérisé chez Escherichia coli mais il a également été caractérisé chez de nombreuses bactéries à Gram négatif et positif avec des variantes telles que les systèmes à une seule recombinase comme difSL/XerS chez Streptococcus sp et Lactococcus sp. Des études bio-informatiques ont suggéré l’existence d’autres systèmes à une seule recombinase chez un sous-groupe d’ε-protéobactéries pathogènes, dont Campylobacter jejuni et Helicobacter pylori. Les acteurs de ce nouveau système sont XerH et difH. Dans ce mémoire, les premières recherches in vitro sur ce système sont présentées. La caractérisation de la recombinase XerH de C. jejuni a été entamée à l’aide du séquençage de son gène et de tests de liaison et de clivage de l’ADN. Ces études ont montré que XerH pouvait se lier au site difSL de S. suis de manière non-coopérative : que XerH peut se lier à des demi-sites de difSL mais qu’elle ne pouvait, dans les conditions de l’étude effectuer de clivage sur difSL. Des recherches in silico ont aussi permis de faire des prédictions sur FtsK de C. jejuni. / DNA replication can form dimers in bacteria harboring a circular chromosome. The dif/Xer recombination system resolves monomers them so that chromosome segregation and cell division take place normally. This system is composed of one or two tyrosine recombinases that act at a specific recombination site, dif, with the help of the FtsK translocase that mobilises DNA to the septum before recombination. The Xer system has been first identified and widely characterized in Escherichia coli where XerC and XerD are the recombinases. The system has been found and studied in many other Gram negative and positive bacteria. A different form, carrying a single recombinase acting on an atypical site, has been identified in Streptococci and Lactococci, difSL/XerS. In silico studies suggested the existence of other single recombinase systems in a sub-group of pathogenic ε-proteobacteriasuch as Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori. The components of this system were identified as XerH and difH. In this thesis, the first in vitro studies made on this system are presented. The characterization of the XerH recombinase of C. jejuni started with the sequencing of its gene and with the DNA binding and cleavage assays. These studies showed that XerH could bind difSL of S. suis non-cooperatively, that it could bind difSL half-sites and that it was unable to perform cleavage on difSL. Also, in silico comparisons permitted predictions on FtsK of C. jejuni.

Les dimères chromosomiques se produisant lors de la réparation de chromosomes circulaires peuvent être dommageables pour les bactéries en bloquant la ségrégation des chromosomes et le bon déroulement de la division cellulaire. Pour remédier à ce problème, les bactéries utilisent le système Xer de monomérisation des chromosomes. Celui-ci est composé de deux tyrosine recombinases, XerC et XerD, qui vont agir au niveau du site dif et procéder à une recombinaison qui aura pour effet de séparer les deux copies de l’ADN. Le site dif est une séquence d’ADN où deux répétitions inversées imparfaites séparées par six paires de bases permettent la liaison de chacune des recombinases. Cette recombinaison est régulée à l’aide de FtsK, une protéine essentielle de l’appareil de division. Ce système a été étudié en profondeur chez Escherichia coli et a aussi été caractérisée dans une multitude d’espèces variées, par exemple Bacillus subtilis. Mais dans certaines espèces du groupe des Streptococcus, des études ont été en mesure d’identifier une seule recombinase, XerS, agissant au niveau d’un site atypique nommée difSL. Peu de temps après, un second système utilisant une seule recombinase a été identifié chez un groupe des epsilon-protéobactéries. La recombinase fut nommée XerH et le site de recombinaison, plus similaire à difSL qu’au site dif classique, difH. Dans cette thèse, des résultats d’expériences in vitro sur les deux systèmes sont présentés, ainsi que certains résultats in vivo. Il est démontré que XerS est en mesure de se lier de façon coopérative à difSL et que cette liaison est asymétrique, puisque XerS est capable de se lier à la moitié gauche du site prise individuellement mais non à la moitié droite. Le clivage par XerS est aussi asymétrique, étant plus efficace au niveau du brin inférieur. Pour ce qui est de XerH, la liaison à difH est beaucoup moins coopérative et n’a pas la même asymétrie. Par contre, le clivage est asymétrique lui aussi. La comparaison de ces deux systèmes montrent qu’ils ne sont pas homologues et que les systèmes Xer à seule recombinase existent sous plusieurs versions. Ces résultats représentent la première découverte d’un espaceur de 11 paires de bases chez les tyrosine recombinases ainsi que la première étude in vitro sur XerH. / The chromosome dimers produced during the repair of circular chromosomes can be harmful to bacteria by blocking the segregation of the chromosome and cell division. To overcome this problem, bacteria use the Xer system for the monomerisation of chromosome dimers. It has two components, XerC and XerD, which act on the dif site and complete a recombination that will lead to the separation of the two copies of the DNA. The dif site is a DNA sequence where two imperfect inverted repeats separated by six base pairs allow the binding of each recombinase. This recombination is regulated by the protein FtsK, an essential member of the cell division machinery. The Xer system has been well studied in Escherichia coli and has also been characterized in a variety of species, for example Bacillus subtilis. Furthermore, in certain species of Streptococcus, studies have identified only a single recombinase, XerS, which acts on an atypical site named difSL in order to monomerize dimeric chromosomes. Not long after, a second system using a single recombinase was identified in a group of epsilon-proteobacteria. This recombinase was named XerH and the recombination site, difH, was found to more similar to difSL than to the classical dif sites. In this thesis, results from in vitro experiments on both systems are presented, as well as some results from in vivo experiments. We show that XerS is capable of binding cooperatively to difSL and that this binding is asymmetrical. This is because XerS is able to bind to the left half of the site but not to the right half when they are separated. The cleavage by XerS is also asymmetrical, as it is more efficient on the bottom strand. As for XerH, its binding to difH is much less cooperative and doesn’t have the same asymmetry. But the cleavage is also asymmetrical like the one seen in XerS. Comparing the two systems show that they are not homologuous and that more than one version of Xer systems using a single recombinase exists. These results represent the first discovery of an 11 bases pairs spacer for tyrosine recombinase. It is also the first in vitro studies of XerH.

Thesis (D.C.A.)--University of Wollongong, 2005. / Typescript. Includes bibliographical references: leaf 173-188.

Techn. Univ., Diss.--München, 2002.

Mémoire (M.A.)-- Université du Québec à Chicoutimi, 1994. / Cette communication a été réalisée à l'Université du Québec à Chicoutimi dans le cadre du programme de maîtrise en arts plastiques de l'Université du Québec à Montréal extensionné à l'Université du Québec à Chicoutimi. CaQCU Document électronique également accessible en format PDF. CaQCU

Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2009. / Title from PDF title page (viewed on July 1, 2010). Includes bibliographical references.

Thesis (M.S.)--Miami University, Dept. of Chemistry and Biochemistry, 2004. / Title from first page of PDF document. Includes bibliographical references (p. 57-64).

Em face da tendência nas artes cênicas de ocupação dos espaços da cidade, nesta pesquisa apresento quatro eixos de ação, por meio dos quais acredito que é possível pensar a interação do artista cênico com o ambiente urbano na sua multiplicidade de leituras e que os nomeio de trama urbana, contexto, fluxos e percepção-sensação. Apresento estas quatro categorias como possibilidades para se aprofundar o conhecimento dos espaços urbanos como locais cênicos específicos, levando em conta sua complexidade. Como influencia o ambiente urbano no discurso e no desenvolvimento da obra? Para responder, é necessário primeiro entender o funcionamento da cidade e as diferentes camadas que a constituem como sistema gerador de sentido, um espaço para ser lido, quer dizer, uma dramaturgia. Sob este olhar, a cidade não é mais cenografia, mas cocriadora da ação teatral, pois se trata de um espaço com contexto e características próprias que raramente podem ser manipuladas. Assim, precisamos, artistas cênicos, de um pensamento diferenciado que procure não a dominação do espaço, mas a apropriação do espaço de uma maneira criativa e, sobretudo, pensando numa dinâmica de negociação com a cidade. Como continuação a essa proposição de pensamento, estabeleço algumas reflexões e problematizações sobre o fazer; a teoria proposta levada para a prática e a prática pensada com base nesta teoria; as questões que se tem gerado e as diferenças que tenho percebido em relação ao trabalho dentro de uma sala de teatro tradicional. A pesquisa parte das ideias de Richard Schechner sobre teatro ambiental, assim como na teoria desenvolvida por André Carreira sobre a cidade como dramaturgia. Além disso, a base teórica foi complementada com olhares de outras áreas do conhecimento, como o Urbanismo e a Sociologia, com o intuito de gerar uma visão abrangente que possibilite uma visão íntegra da cidade, para além da ideia de um espaço apenas cenográfico. / Ante la tendencia de ocupación de los espacios de la ciudad para el ejercicio de las artes escénicas, presento en la siguiente investigación cuatro ejes de acción por medio de los cuales creo que es posible pensar la interacción del artista escénico con el ambiente urbano en su multiplicidad de lecturas y a los cuales he llamado trama urbana, contexto, flujos y percepción-sensación. Coloco estas cuatro categorías como posibilidades para profundizar en el conocimiento de los espacios urbanos como locales escénicos específicos, tomando en cuenta su complejidad. ¿De qué manera influye el ambiente urbano en el discurso y desarrollo de la obra? Para responder, es necesario entender primero el funcionamiento de la ciudad y los diferentes niveles que la constituyen como sistema generador de sentido, un espacio para ser leído, es decir, una dramaturgia. Bajo este punto de vista, la ciudad ya no es escenografía, sino co-creadora de la acción teatral, pues se trata de un espacio con contexto y características propias que raramente pueden ser manipuladas. Así, necesitamos artistas escénicos con un pensamiento diferenciado que no busquen la dominación del espacio, sino la apropiación del espacio de una manera creativa y, sobretodo, que piensen en una dinámica de negociación con la ciudad. Como continuación a esa propuesta de pensamiento, presento algunas reflexiones y problemáticas sobre el ejercicio de estos conocimientos; la teoría propuesta llevada a la práctica y la practica pensada con base en esta teoría, las cuestiones que han surgido y las diferencias que he percibido en comparación al trabajo en una sala de teatro tradicional. La investigación parte de las ideas de Richard Schechner sobre teatro ambiental, así como de la teoría desarrollada por André Carreira sobre la ciudad como dramaturgia. Adicionalmente, esta base teórica fue complementada con ideas de otras áreas del conocimiento como el Urbanismo y la Sociología, esto con la intención de crear una visión amplia que posibilite un pensamiento íntegro sobre la ciudad, más allá de la idea de un espacio apenas escenográfico.