Les montagnes sont des hotspots de biodiversité dont les réseaux plantes-pollinisateurs constituent un élément central, et où les conséquences du réchauffement climatique sont déjà avérées. Malgré le nombre colossal d’espèces potentiellement affectées par la destructuration du mutualisme entre les angiospermes et leurs pollinisateurs dans ces écosystèmes, les patrons spatio-temporels des communautés de pollinisateurs le long des gradients altitudinaux sont toujours méconnus. La première partie de ce travail propose une analyse des effets de l’altitude et de la phénologie sur l’abondance et la diversité des insectes anthophiles le long d’un gradient altitudinal de 1700 m. Nous montrons qu’il existe une structuration altitudinale et trophique entre les principaux ordres de pollinisateurs (hyménoptères, diptères, coléoptères), avec une nette prédominance des diptères dès 1500 m d’altitude qui s’amplifie jusqu’à la limite supérieure du gradient (2700 m). Ces diptères appartiennent principalement à trois familles (Anthomyiidae, Empididae, Muscidae) qui se structurent également le long du gradient par l’altitude, la phénologie et le choix des plantes visitées. Leur biologie, efficacité pollinisatrice comprise, est encore largement méconnue. Dans un second temps, nous étudions l’écologie de la pollinisation et les causes évolutives du succès d’un groupe central de ces communautés anthophiles, les Empidinae. Nous avons mesuré 1) leur importance relative dans un réseau plantes-visiteurs à l’étage subalpin et 2) leur efficacité pollinisatrice par rapport à celles des autres visiteurs pour une plante de ce réseau (Geranium sylvaticum L.). Nous montrons que les visites d’une grosse espèce d’Empis produisent le même nombre de graines que celles de l’abeille domestique (Apis mellifera L.), pollinisatrice réputée très efficace. Ces résultats suggèrent un rôle majeur des gros Empidinae dans la pollinisation des plantes alpines. Pour comprendre le rôle de la floricolie dans la diversification des Empidinae et l’origine de leur abondance en altitude, nous avons construit une phylogénie moléculaire mondiale sur la base de 4 marqueurs et pour plus de 210 espèces. La plupart des clades d’Empidinae contiennent des espèces qui occupent diverses altitudes, indiquant qu’il n’y a pas de conservatisme de niche impliqué dans leur distribution le long du gradient. L’association angiospermes-Empidinae remonte à la période de fin de radiation des angiospermes et semble, par l’intermédiaire de l’allongement de la trompe, avoir favorisé la radiation évolutive de certains clades en parallèle avec celles des plantes à fleurs. Leur large distribution altitudinale et leur capacité à visiter des morphotypes floraux inaccessibles à d’autres floricoles pourraient leur conférer une importante résistance aux changements globaux. / Mountains are biodiversity hotspots, where the effects of global warming have already been demonstrated in numerous studies. Plant-pollinator networks are a central element of these ecosystems, but, despite the tremendous number of species potentially affected by the disruption of this mutualism, spatial and temporal patterns of pollinator communities along altitudinal gradients are still poorly known. The first part of this work analyses the effects of elevation and phenology on the abundance and diversity of anthophilous insects along a 1700 m altitudinal gradient. I show that the main orders of pollinators (Diptera, Hymenoptera, Coleoptera) are structured by elevation and foraging preferences, with an increasing predominance of flies from 1500 m altitude up to 2700 m, the upper limit of the gradient. Most of these fly species belong to four families (Anthomyiidae, Empididae, Muscidae and Syrphidae) which also segregate along the gradient according to altitude, phenology and the choice of flowering plants they visit. The systematics and biology of these taxa, including their pollination efficiency, are still largely under-investigated. Second, I studied the pollination ecology and the evolutionary causes of the success of empidine dance flies (Empidinae), a central group in these anthophilous communities. I measured 1) their relative importance in the plant-visitor network of a subalpine meadow; and 2) the pollinating effectiveness of their visits to Geranium sylvaticum L. relative to the other visitors. Visits by large species of Empis produced the same number of seeds as those by the domestic bee (Apis mellifera L.), a highly effective pollinator. Such results suggest a major role of large empidines in the pollination of alpine plants. To understand the role of anthophily in Empidinae diversification and the origins of their abundance at altitude, I built a worldwide molecular phylogeny for the subfamily. The resulting cladogram includes 212 species for which four molecular markers were sequenced (28S D1-D2, D4-D5, 16S mtDNA, COI). Most clades of Empidinae contain species occupying various altitudes, indicating that there is no phylogenetic niche conservatism involved in their distribution along the gradient. The association between Empidinae and Angiosperms dates back to the end of the angiosperm radiation and seems, through the lengthening of the proboscis, to have favoured the evolutionary radiation of several clades in parallel with flowering plants. Their wide altitudinal distribution, combined with their ability to visit floral morphotypes inaccessible to other anthophilous insects, could confer them a strong resistance to global changes.

Um enfoque analítico, envolvendo centrifugação diferencial de homogeneizados de cecos gástricos de Rhynchosciara americana preparados em condições brandas e vigorosas, suporta a asserção de que existe uma classe principal de aril-α- e β -glicosidases, aril-α- e β-galactosidases e celobiases que é ligada à membrana plasmática, e duas classes de maltases, aminopeptidases, carboxipeptidases e dipeptidases. Maltases ocorrem na membrana plasmática e no interior de lisossomos na forma solúvel, enquanto que as peptidases (amino-carboxi- e dipeptidase) são encontradas na membrana plasmática e citossol. A ocorrência das enzimas citadas acima na membrana plasmática das células cecais, foi confirmada por resultados obtidos em preparações de microvilosidades realizadas com técnica desenvolvida para enterocito de mamíferos. O tratamento de microvilosidades com solução hiperosmótica de Tris, seguido de centrifugação em gradiente de densidade, permitiu a separação de quatro frações de membrana e de uma fração que contém microvilosidades intactas e, provavelmente, microfilamentos isolados. Eletroferogramas do material recolhido do gradiente mostrou diferenças entre as frações de membrana e sugeriu a ocorrência de actina como componente majoritário dos microfilamentos das microvilosidades. Ensaios enzimáticos nas diferentes frações do gradiente confirmaram a ocorrência de celobiase e carboxipeptidase ligadas à membrana plasmática. Os resultados de distribuição intracelular de hidrolases nos cecos de R. americana permitiram propor que a digestão terminal de proteínas ocorre na membrana plasmática e no citossol, por ação de amino-, carboxi- e dipeptidases, enquanto que a digestão de carboidratos, com exceção da trealose, ocorre somente na superfície das microvilosidades. / An analytical approach involving differencial centrifugation of Rhynchosciara Americana midgut caeca homogenates prepared in mild and in vigorous conditions support the assumption there are one main class of aryl-α- e β-glucosidases, aryl-α - e β-galactosidases and cellobiases, which are plasma membrane bound, and two classes of maltases, aminopeptidades, carboxypeptidases and dipeptidases. Maltases, occur in plasma membrane and in lysosomes (as a soluble enzyme) and the others are found in plasma membrane and cytosol. A succeful purification of caeca cells brush-borders by tecniques used for mammal enterocytes confirmed the assumptions based on differential centrifugation data. Treatment of purified microvilli with a hyperosmotic solution of Tris, followed by density gradient centrifugation, resulted in the separation of four membrane fractions and one fraction containing intact microvilli and, probably, isolated microfilaments. Electropherograms of the material recovered from the gradient showed differences among the membrane fractions, and they permitted to propose that actin is a major component of microvilli microfilaments. Enzymatic assays in the different fractions from the gradient confirmed the occurrence of cellobiase and carboxypeptidase plasma membrana bound. The results permite to propose that the majority of the terminal digestion of proteins and carbohydrates, with the exception of trehalose, occurs on the surface of the insect midgut caeca cells microvilli.

Os elementos de transposição são seqüências discretas que são capazes de mover- se de um lócus para outro, constituindo uma parte significante do genoma de eucariotos. São agrupados em duas classes principais, os elementos da Classe I, que se transpõem via um intermediário de RNA (retrotransposon), e os elementos da Classe II, que se transpõem via mecanismo de DNA do tipo corta e cola (transposon). A análise das seqüências de um banco de cDNA construído com RNA mensageiro da glândula salivar de Rhynchosciara americana mostrou a presença de representantes das duas classes de elementos. Nesse trabalho caracteriza-se quarto elementos de transposição tipo mariner, onde as seqüências consenso de nucleotídeos foram derivadas de múltiplas cópias defectivas contendo deleções, mudança no quadro de leitura e códons de terminação. Ramar1, um elemento full-length e Ramar2 um elemento defectivo que contém uma deleção na região interna da ORF da transposase, mas mantém e as extremidades intactas. Ramar3 e Ramar4 são elementos defectivos que apresentam muitas deleções no interior da ORF. As seqüências preditas das transposases demostraram que Ramar1 e Ramar2 estão filogeneticamente muito próximos dos elementos mariner da subfamília mauritiana. Enquanto, Ramar3 e Ramar4 pertencem às subfamílias mellifera e irritans, respectivamente. Hibridização in situ mostrou que Ramar1 localiza-se em muitas regiões do cromossomo, principalmente na heterocromatina pericentromérica, enquanto Ramar2 aparece em uma única banda no cromossomo A. Resultado ainda mais curioso foi a caracterização molecular de um elemento de retrotransposição, denominado RaTART, que provavelmente é o responsável pela reconstituição telomérica em R.americana, assim como os elementos TART, HeT-A e TAHRE de Drosophila. Experimentos de Southern Blots do retroelemento RaTART indicam que este está representado por seqüências repetidas no genoma de R.americana, enquanto que Northern Blots mostraram uma expressão em diferentes estágios do desenvolvimento e o transcrito de alto peso molecular detectado representa o retrotransposon non-LTR inteiro. Enquanto a localização cromossômica de RaTART por hibridização in situ mostrou uma marcação predominante nas extremidades dos cromossomos, indicando possivelmente o primeiro elemento de transposição descrito em R.americana com função definida na estrutura do cromossomo. O último retrotransposon, identificado nesse projeto, presente no genoma de R.americana, denominado R2Ra, foi isolado a partir de uma varredura em um banco genômico construído no bacteriófago lambda dash usando como sonda o recombinante pRa1.4 que contém a unidade de repetição do rDNA. A análise da seqüência mostrou a presença de regiões conservadas, como o domínio de transcriptase reversa e o motivo zinc finger na região amino-terminal. O sítio de inserção no gene 28S do rDNA é altamente conservado em R.americana e a análise filogenética mostrou que este elemento pertence ao grupo R2. A localização cromossômica confirma que o elemento móvel R2Ra se insere em um sítio específico no gene rDNA. / Transposable elements are discrete sequences that are able to move from one locus to another within the genome, constituting a significant part of eukaryotic genome. They are grouped into two main types, Class I elements transpose via an RNA intermediate (retrotransposon), and Class II elements transpose via a DNA \"cut-and-paste\" mechanism (transposons). The analysis of sequences of a cDNA bank constructed from mRNA of the salivary glands of Rhynchosciara americana showed the presence of putative types of two classes elements. In the present thesis we describe four mariner elements, where the nucleotides consensus sequences were derived from multiple defective copies containing deletions, frame shifts and stop codons. Ramar1, a full-length element and Ramar2 is a defective mariner element that contains a deletion overlapping most of the internal region of the transposase ORF and the extremities of the element maintain intact. Ramar3 e Ramar4 are defective mariner element that were impossible to predict a complete ORF. Predicted transposase sequences demonstrated that Ramar1 and Ramar2 are phylogenetically very close to mariner-like elements of mauritiana subfamily. However, Ramar3 and Ramar4 belong to mellifera and irritans subfamilies, respectively. In situ hybridisations showed Ramar1 localized in several chromosome regions, mainly in pericentromeric heterochromatin and their boundaries, while Ramar2 appeared as a single band in chromosome A. More interesting data were the molecular characterization of the non-LTR retrotransposon element, called as RaTART, that probably is the responsible by telomeric reconstruction in R.americana, as well as the telomeric retrotransposable elements TART, Het-A and TAHRE of Drosophila. Southern blot analysis indicated that this transposable element is represented by repeat sequences in the genome of R. americana, and Northern blot analysis showed a expression in different developmental stages and the transcript of high molecular mass detected represents the full-length non-LTR retrotransposon. However, the chromosomal localization of the retroelement by in situ hybridisation showed a labelling predominant on chromosome ends, indicating possibly the first transposable element described in R.americana with a defined role in chromosome structure. The last retrotransposon, identified in this project, present in the genome of Rhynchosciara americana, called R2Ra, was isolated from screening of a lambda dash genomic library using as probe the recombinant pRa1.4 of rDNA. The analysis of sequence showed the presence of conserved regions, like transcriptase reverse domain and zinc finger motif in the amino terminal region. The insertion site is high conserved in R.americana and a phylogenetic analysis showed that this element belongs to the R2 clade. The chromosomal localization confirm that the R2Ra mobile element insert into the site specific in rDNA gene.

Este trabalho teve por objetivo esclarecer a identidade de duas espécies próximas a Doryctobracon areolatus (Szépligeti) e de uma relacionada a Opius bellus Gahan, mencionada na literatura nacional como Opius sp. aff. bellus, por meio da morfometria geométrica e da análise das regiões do ITS2 do rDNA e 28S rDNA D2. As medidas das asas de D. areolatus, Doryctobracon sp. 1 e Doryctobracon sp. 2, O. bellus e Opius sp. aff. bellus, provenientes de diversas localidades brasileiras, foram estudadas por meio da morfometria geométrica. A avaliação de 20 pontos anatômicos nas asas, por meio de análise multivariada revelou a existência de variabilidade interpopulacional em 11 populações de D. areolatus, provenientes de localidades das cinco regiões brasileiras. O estudo morfométrico ainda revelou que Doryctobracon sp. 1 (estigma claro) e Doryctobracon sp. 2 (estigma escuro) diferem entre si e também de D. areolatus (Szépligeti). No entanto, entre os espécimes de O. bellus Gahan e Opius sp. aff. bellus, os resultados apontaram a coespecificidade desses indivíduos. Com base no tamanho do centróide, os resultados apontam a existência de dimorfismo sexual em relação ao tamanho das asas, ou seja, as fêmeas possuem asas relativamente maiores que as dos machos. Nas análises moleculares, os resultados indicaram a ocorrência de variabilidade intraespecífica, com relação ao tamanho do fragmento entre as populações de D. areolatus provenientes dos estados do AP, SP, GO e TO com a utilização dos dois marcadores moleculares (ITS2 e 28S rDNA D2). Porém, entre os espécimes de Doryctobracon sp. 1 (estigma claro) e de Doryctobracon sp. 2 (estigma escuro), essas regiões não variaram quanto ao tamanho, mas diferiram na composição das sequências, revelando que correspondem realmente a duas espécies. Portanto, houve congruência entre os resultados morfométricos e moleculares para essas espécies de Doryctobracon. Entre os espécimes identificados como Opius bellus e Opius sp. aff. bellus, a região do ITS2 indicou a ocorrência de variabilidade intrapopulacional, semelhante à interpopulacional, com elevada similaridade entre as morfoespécies analisadas. No entanto, a região do 28S rDNA D2 apresentou elevada similaridade entre as sequências obtidas, fortalecendo as indicações de que os espécimes considerados como O. bellus Gahan e Opius sp. aff. bellus, na realidade, pertencem à uma única espécie, conclusão também sustentada pelas análises morfométricas. / This study aimed to elucidate the identity of two-closely related species of Doryctobracon areolatus (Szépligeti) and a closely related species of Opius bellus Gahan, commonly referred to as Opius sp. aff. bellus, by using geometric morphometry and molecular analysis (ITS2 rDNA and 28S rDNA D2 regions). The analysis based on 20 landmarks through the multivariate analysis (CVA) revealed the existence of interpopulation variability in the wing morphology of 11 populations of D. areolatus, from five Brazilian regions. The morphometric study also showed that specimens of Doryctobracon sp. 1 (clear stigma) and Doryctobracon sp. 2 (dark stigma) were distinct between themselves and also from D. areolatus (Szépligeti). However, specimens of O. bellus Gahan and Opius sp. aff. bellus were found to be cospecifics. Analysis based on the centroid size indicated the existence of sexual dimorphism in relation to the size of the wings, ie, females had relatively larger wings than males. The molecular analysis indicated intraspecific variability in the size of the fragment between populations of D. areolatus from Amapá, São Paulo, Goiás and Tocantins states for both of the molecular markers used (ITS2 and 28S D2 rDNA). But these markers had similar sizes for Doryctobracon sp. 1 (stigma clearly) and Doryctobracon sp. 2 (dark stigma), with a very different base composition, indicating the existence of two distinctive species. Both molecular and morphometric analysis gave similar results. Among the specimens identified as Opius bellus and Opius sp. aff. bellus, analysis of the ITS2 region indicated the intrapopulation variability was similar to the interpopulation, with high similarity between the morphospecies analyzed. However, the region of the 28S D2 rDNA showed high similarity between the sequences obtained, reinforcing the indication that the specimens taken as O. bellus Gahan and Opius sp. aff. bellus in fact, belong to the same species, which was also supported by morphometric analysis.

Este trabalho teve por objetivo esclarecer a identidade de duas espécies próximas a Doryctobracon areolatus (Szépligeti) e de uma relacionada a Opius bellus Gahan, mencionada na literatura nacional como Opius sp. aff. bellus, por meio da morfometria geométrica e da análise das regiões do ITS2 do rDNA e 28S rDNA D2. As medidas das asas de D. areolatus, Doryctobracon sp. 1 e Doryctobracon sp. 2, O. bellus e Opius sp. aff. bellus, provenientes de diversas localidades brasileiras, foram estudadas por meio da morfometria geométrica. A avaliação de 20 pontos anatômicos nas asas, por meio de análise multivariada revelou a existência de variabilidade interpopulacional em 11 populações de D. areolatus, provenientes de localidades das cinco regiões brasileiras. O estudo morfométrico ainda revelou que Doryctobracon sp. 1 (estigma claro) e Doryctobracon sp. 2 (estigma escuro) diferem entre si e também de D. areolatus (Szépligeti). No entanto, entre os espécimes de O. bellus Gahan e Opius sp. aff. bellus, os resultados apontaram a coespecificidade desses indivíduos. Com base no tamanho do centróide, os resultados apontam a existência de dimorfismo sexual em relação ao tamanho das asas, ou seja, as fêmeas possuem asas relativamente maiores que as dos machos. Nas análises moleculares, os resultados indicaram a ocorrência de variabilidade intraespecífica, com relação ao tamanho do fragmento entre as populações de D. areolatus provenientes dos estados do AP, SP, GO e TO com a utilização dos dois marcadores moleculares (ITS2 e 28S rDNA D2). Porém, entre os espécimes de Doryctobracon sp. 1 (estigma claro) e de Doryctobracon sp. 2 (estigma escuro), essas regiões não variaram quanto ao tamanho, mas diferiram na composição das sequências, revelando que correspondem realmente a duas espécies. Portanto, houve congruência entre os resultados morfométricos e moleculares para essas espécies de Doryctobracon. Entre os espécimes identificados como Opius bellus e Opius sp. aff. bellus, a região do ITS2 indicou a ocorrência de variabilidade intrapopulacional, semelhante à interpopulacional, com elevada similaridade entre as morfoespécies analisadas. No entanto, a região do 28S rDNA D2 apresentou elevada similaridade entre as sequências obtidas, fortalecendo as indicações de que os espécimes considerados como O. bellus Gahan e Opius sp. aff. bellus, na realidade, pertencem à uma única espécie, conclusão também sustentada pelas análises morfométricas. / This study aimed to elucidate the identity of two-closely related species of Doryctobracon areolatus (Szépligeti) and a closely related species of Opius bellus Gahan, commonly referred to as Opius sp. aff. bellus, by using geometric morphometry and molecular analysis (ITS2 rDNA and 28S rDNA D2 regions). The analysis based on 20 landmarks through the multivariate analysis (CVA) revealed the existence of interpopulation variability in the wing morphology of 11 populations of D. areolatus, from five Brazilian regions. The morphometric study also showed that specimens of Doryctobracon sp. 1 (clear stigma) and Doryctobracon sp. 2 (dark stigma) were distinct between themselves and also from D. areolatus (Szépligeti). However, specimens of O. bellus Gahan and Opius sp. aff. bellus were found to be cospecifics. Analysis based on the centroid size indicated the existence of sexual dimorphism in relation to the size of the wings, ie, females had relatively larger wings than males. The molecular analysis indicated intraspecific variability in the size of the fragment between populations of D. areolatus from Amapá, São Paulo, Goiás and Tocantins states for both of the molecular markers used (ITS2 and 28S D2 rDNA). But these markers had similar sizes for Doryctobracon sp. 1 (stigma clearly) and Doryctobracon sp. 2 (dark stigma), with a very different base composition, indicating the existence of two distinctive species. Both molecular and morphometric analysis gave similar results. Among the specimens identified as Opius bellus and Opius sp. aff. bellus, analysis of the ITS2 region indicated the intrapopulation variability was similar to the interpopulation, with high similarity between the morphospecies analyzed. However, the region of the 28S D2 rDNA showed high similarity between the sequences obtained, reinforcing the indication that the specimens taken as O. bellus Gahan and Opius sp. aff. bellus in fact, belong to the same species, which was also supported by morphometric analysis.

Os elementos de transposição são seqüências discretas que são capazes de mover- se de um lócus para outro, constituindo uma parte significante do genoma de eucariotos. São agrupados em duas classes principais, os elementos da Classe I, que se transpõem via um intermediário de RNA (retrotransposon), e os elementos da Classe II, que se transpõem via mecanismo de DNA do tipo corta e cola (transposon). A análise das seqüências de um banco de cDNA construído com RNA mensageiro da glândula salivar de Rhynchosciara americana mostrou a presença de representantes das duas classes de elementos. Nesse trabalho caracteriza-se quarto elementos de transposição tipo mariner, onde as seqüências consenso de nucleotídeos foram derivadas de múltiplas cópias defectivas contendo deleções, mudança no quadro de leitura e códons de terminação. Ramar1, um elemento full-length e Ramar2 um elemento defectivo que contém uma deleção na região interna da ORF da transposase, mas mantém e as extremidades intactas. Ramar3 e Ramar4 são elementos defectivos que apresentam muitas deleções no interior da ORF. As seqüências preditas das transposases demostraram que Ramar1 e Ramar2 estão filogeneticamente muito próximos dos elementos mariner da subfamília mauritiana. Enquanto, Ramar3 e Ramar4 pertencem às subfamílias mellifera e irritans, respectivamente. Hibridização in situ mostrou que Ramar1 localiza-se em muitas regiões do cromossomo, principalmente na heterocromatina pericentromérica, enquanto Ramar2 aparece em uma única banda no cromossomo A. Resultado ainda mais curioso foi a caracterização molecular de um elemento de retrotransposição, denominado RaTART, que provavelmente é o responsável pela reconstituição telomérica em R.americana, assim como os elementos TART, HeT-A e TAHRE de Drosophila. Experimentos de Southern Blots do retroelemento RaTART indicam que este está representado por seqüências repetidas no genoma de R.americana, enquanto que Northern Blots mostraram uma expressão em diferentes estágios do desenvolvimento e o transcrito de alto peso molecular detectado representa o retrotransposon non-LTR inteiro. Enquanto a localização cromossômica de RaTART por hibridização in situ mostrou uma marcação predominante nas extremidades dos cromossomos, indicando possivelmente o primeiro elemento de transposição descrito em R.americana com função definida na estrutura do cromossomo. O último retrotransposon, identificado nesse projeto, presente no genoma de R.americana, denominado R2Ra, foi isolado a partir de uma varredura em um banco genômico construído no bacteriófago lambda dash usando como sonda o recombinante pRa1.4 que contém a unidade de repetição do rDNA. A análise da seqüência mostrou a presença de regiões conservadas, como o domínio de transcriptase reversa e o motivo zinc finger na região amino-terminal. O sítio de inserção no gene 28S do rDNA é altamente conservado em R.americana e a análise filogenética mostrou que este elemento pertence ao grupo R2. A localização cromossômica confirma que o elemento móvel R2Ra se insere em um sítio específico no gene rDNA. / Transposable elements are discrete sequences that are able to move from one locus to another within the genome, constituting a significant part of eukaryotic genome. They are grouped into two main types, Class I elements transpose via an RNA intermediate (retrotransposon), and Class II elements transpose via a DNA \"cut-and-paste\" mechanism (transposons). The analysis of sequences of a cDNA bank constructed from mRNA of the salivary glands of Rhynchosciara americana showed the presence of putative types of two classes elements. In the present thesis we describe four mariner elements, where the nucleotides consensus sequences were derived from multiple defective copies containing deletions, frame shifts and stop codons. Ramar1, a full-length element and Ramar2 is a defective mariner element that contains a deletion overlapping most of the internal region of the transposase ORF and the extremities of the element maintain intact. Ramar3 e Ramar4 are defective mariner element that were impossible to predict a complete ORF. Predicted transposase sequences demonstrated that Ramar1 and Ramar2 are phylogenetically very close to mariner-like elements of mauritiana subfamily. However, Ramar3 and Ramar4 belong to mellifera and irritans subfamilies, respectively. In situ hybridisations showed Ramar1 localized in several chromosome regions, mainly in pericentromeric heterochromatin and their boundaries, while Ramar2 appeared as a single band in chromosome A. More interesting data were the molecular characterization of the non-LTR retrotransposon element, called as RaTART, that probably is the responsible by telomeric reconstruction in R.americana, as well as the telomeric retrotransposable elements TART, Het-A and TAHRE of Drosophila. Southern blot analysis indicated that this transposable element is represented by repeat sequences in the genome of R. americana, and Northern blot analysis showed a expression in different developmental stages and the transcript of high molecular mass detected represents the full-length non-LTR retrotransposon. However, the chromosomal localization of the retroelement by in situ hybridisation showed a labelling predominant on chromosome ends, indicating possibly the first transposable element described in R.americana with a defined role in chromosome structure. The last retrotransposon, identified in this project, present in the genome of Rhynchosciara americana, called R2Ra, was isolated from screening of a lambda dash genomic library using as probe the recombinant pRa1.4 of rDNA. The analysis of sequence showed the presence of conserved regions, like transcriptase reverse domain and zinc finger motif in the amino terminal region. The insertion site is high conserved in R.americana and a phylogenetic analysis showed that this element belongs to the R2 clade. The chromosomal localization confirm that the R2Ra mobile element insert into the site specific in rDNA gene.

Um enfoque analítico, envolvendo centrifugação diferencial de homogeneizados de cecos gástricos de Rhynchosciara americana preparados em condições brandas e vigorosas, suporta a asserção de que existe uma classe principal de aril-α- e β -glicosidases, aril-α- e β-galactosidases e celobiases que é ligada à membrana plasmática, e duas classes de maltases, aminopeptidases, carboxipeptidases e dipeptidases. Maltases ocorrem na membrana plasmática e no interior de lisossomos na forma solúvel, enquanto que as peptidases (amino-carboxi- e dipeptidase) são encontradas na membrana plasmática e citossol. A ocorrência das enzimas citadas acima na membrana plasmática das células cecais, foi confirmada por resultados obtidos em preparações de microvilosidades realizadas com técnica desenvolvida para enterocito de mamíferos. O tratamento de microvilosidades com solução hiperosmótica de Tris, seguido de centrifugação em gradiente de densidade, permitiu a separação de quatro frações de membrana e de uma fração que contém microvilosidades intactas e, provavelmente, microfilamentos isolados. Eletroferogramas do material recolhido do gradiente mostrou diferenças entre as frações de membrana e sugeriu a ocorrência de actina como componente majoritário dos microfilamentos das microvilosidades. Ensaios enzimáticos nas diferentes frações do gradiente confirmaram a ocorrência de celobiase e carboxipeptidase ligadas à membrana plasmática. Os resultados de distribuição intracelular de hidrolases nos cecos de R. americana permitiram propor que a digestão terminal de proteínas ocorre na membrana plasmática e no citossol, por ação de amino-, carboxi- e dipeptidases, enquanto que a digestão de carboidratos, com exceção da trealose, ocorre somente na superfície das microvilosidades. / An analytical approach involving differencial centrifugation of Rhynchosciara Americana midgut caeca homogenates prepared in mild and in vigorous conditions support the assumption there are one main class of aryl-α- e β-glucosidases, aryl-α - e β-galactosidases and cellobiases, which are plasma membrane bound, and two classes of maltases, aminopeptidades, carboxypeptidases and dipeptidases. Maltases, occur in plasma membrane and in lysosomes (as a soluble enzyme) and the others are found in plasma membrane and cytosol. A succeful purification of caeca cells brush-borders by tecniques used for mammal enterocytes confirmed the assumptions based on differential centrifugation data. Treatment of purified microvilli with a hyperosmotic solution of Tris, followed by density gradient centrifugation, resulted in the separation of four membrane fractions and one fraction containing intact microvilli and, probably, isolated microfilaments. Electropherograms of the material recovered from the gradient showed differences among the membrane fractions, and they permitted to propose that actin is a major component of microvilli microfilaments. Enzymatic assays in the different fractions from the gradient confirmed the occurrence of cellobiase and carboxypeptidase plasma membrana bound. The results permite to propose that the majority of the terminal digestion of proteins and carbohydrates, with the exception of trehalose, occurs on the surface of the insect midgut caeca cells microvilli.

Historically, terrestrial food web research has focused on describing the structure of aboveground grazing webs, and determining how interactions among plants, herbivores and higher trophic levels influence primary productivity. Detrital food webs however, play a significant role in regulation of ecosystem dynamics through direct impacts on decomposition. Unraveling the complex nature of detrital food web structure is critical to developing a better understanding of ecosystem function. Therefore the primary objective of this research was to describe the structure of the leaf-litter food web in a temperate deciduous forest, with emphasis on interactions between a community of generalist predators, the forest-floor spiders, and arthropod prey. Elucidating occurrence of trophic interactions in the forest-floor food web was a formidable task due to the high diversity, small body sizes and cryptic habits of many litter-dwelling arthropods. Analysis of natural variation in consumer stable isotope ratios (δ13C and δ15N) formed the crux of this research because it simultaneously permitted quantification of the trophic positions of litterdwelling arthropods and identification of spider resources, including prey subsidies from the grazing web. A monoclonal antibody-based ELISA was employed to analyze the gut contents of spiders to quantify predation on a major arthropod taxon, the forest-floor flies. Surveys of spider distributions and prey availability in the litter layer also provided fundamental knowledge of community structure. Stable isotope analyses suggested that most spiders exhibited strong trophic connections to the detrital web, but weak links to herbivorous prey. Several lines of evidence supported a strong trophic link between large, litterdwelling collembolans (Tomoceridae) and cursorial spiders, including correlation between spider and tomocerid densities on the forest-floor, similarities in spider and tomocerid carbon signatures, and nitrogen enrichment of tomocerids relative to other prey types. Conversely, this research provided conflicting evidence regarding spider consumption of flies. Gut content assays indicated consistent predation on flies by cursorial spiders, while stable isotope models suggested that flies are likely of little importance in the spiders’ diets. This project yielded valuable insights into the role of spiders in the forest-floor food web and the potential importance of species-specific variation in prey consumption for detrital food web dynamics.

Tripsinas e quimotripsinas são classes de serina peptidases amplamente estudadas e fortemente responsáveis pela digestão proteica, pela clivagem de ligações peptídicas no lado carboxila de L-aminoácidos de cadeia lateral básica e hidrofóbica, respectivamente. Três processos regulam finamente a ação dessas peptidases: secreção, ativação do precursor (zimogênio) e o sítio de reconhecimento do substrato. No presente trabalho é apresentada uma análise filogenética detalhada das tripsinas e quimotripsinas de três ordens de insetos holometábolos, revelando características divergentes nas enzimas de Lepidóptera em relação a Coleóptera e Díptera. Em particular, o sub-sítio S1 das tripsinas foi observado como mais hidrofílico em Lepidóptera do que em Coleóptera e Díptera, enquanto os sub-sítios S2-S4 parecem mais hidrofóbicos, sugerindo diferente preferências pelo substrato. Além disso, Lepidóptera mostrou um grupo de tripsinas bastante específico a um grupo taxonômico, compreendendo somente proteínas de espécies da família Noctuidae. Evidências de eventos de auto-ativação facilitada foram também observadas em todas as ordens de insetos estudadas, com as características do motivo de ativação do zimogênio complementárias ao sítio ativo das tripsinas. Em contraste, as quimotripsinas de insetos não parecem ter uma história evolutiva peculiar com respeito a, por exemplo, seus homólogos em mamíferos. Em geral, os presentes resultados sugerem que a necessidade de uma rápida taxa de autoativação fez os insetos holometábolos selecionarem grupos especializados de tripsinas com altas taxas de auto-ativação e também destacam que a evolução das tripsinas culminou em um grupo especializado de enzimas em Lepidóptera. / Trypsins and chymotrypsins are well-studied classes of serine peptidases largely responsible for the digestion of proteins by cleavage of the peptide bond at the carboxyl side of basic and hydrophobic L-amino acids, respectively. Three processes mainly regulate the action of these peptidases: secretion, precursor (zymogen) activation and substrate-binding site recognition. In the present work is presented a detailed phylogenetic analysis of trypsins and chymotrypsins in three orders of holometabolous insects revealing divergent characteristics in the Lepidoptera enzymes in relation to Coleoptera and Diptera. In particular, trypsin subsite S1 was observed to be more hydrophilic in Lepidoptera than in Coleoptera and Diptera, whereas subsites S2-S4 appeared more hydrophobic, suggesting different substrate preferences. Furthermore, Lepidoptera displayed a very specific taxonomic trypsin group, only encompassing proteins from the Noctuidae family. Evidences for facilitated trypsin auto-activation events were also observed in all the insect orders at hand, with the characteristic zymogen activation motif complementary to the trypsin active site. In contrast, insect chymotrypsins did not seem to have a peculiar evolutionary history with respect to e.g. their mammal counterparts. Overall, the present findings suggest that the need for fast digestion made holometabolous insects evolve specialized groups of trypsins with high autoactivation rates and highlight that the evolution of trypsins culminated in a specialized group of enzymes in Lepidoptera.

This Master thesis is focused on selected pollinators of our meadows and their didactic integration into education. The thesis is divided into two parts - theoretical and practical. In theoretical part, there are defined two orders (Hymenoptera and Diptera), process of pollination, plants pollination strategies and pollen grain. Practical part is focused on research of dipterans (particularly on hoverflies) of which purpose was to find out which plants are most pollinated. Subsequent section deals with analysis of secondary school Biology textbooks in terms of representation of selected pollinators. Next section contains plan of practical exercise, which deals with whether honey contains pollen grains. In final section of practical part, a worksheet is presented, which verifies pupil's knowledge about pollinators. KEYWORDS Hymenoptera, Diptera, hoverfly research, pollinators, pollen, textbook analysis