No description available.

Biological and systematic study of the immature stages of the biting midges (Diptera: Ceratopogonidae) has been infrequent, although the family is one of the largest in the order, with over 4,000 species worldwide, and is ubiquitous among aquatic/semiaquatic environments. An ecosystematic analysis is presented here of the Ceratopogonidae in Virginia and contiguous states based mainly on a diversified biological field survey, with particular attention to associating immature stages with adults, and acquisition of ecological data. I emphasized (a) extraction of larvae and pupae; (b) two methods of rearing, developed for this study: individual rearing(IR) with an agar-nematode technique, and collective rearing from the habitat substrate in rearing cartons(RC); and (c) field trapping of adults at the habitats. In Section I, a faunistic assessment - the first of its sort - is provided of the total Virginia-region ceratopogonid fauna, in all developmental stages, with a focus on <i>Culicoides</i>, including a comparative evaluation of the relative abundance of the ceratopogonid genera with respect to methods of collecting and extracting. High taxonomic richness of the ceratopogonid fauna in the Middle Atlantic states is reflected in the 150 described and 42 undescribed (new) species recovered. A detailed geographic checklist for the 222 species of Virginia and the five contiguous states is presented and interpreted. At least 54 Culicoides species are present in the Middle Atlantic u.s. About half of the larval species can be determined in Virginia. With the results of this study, 93% of breeding sites for the genus are known in Virginia, more than for any other state. Section II assembles and synopsizes data on the autecology, life history, habitat, morphology, systematics, as well as geographic and seasonal occurrence of 28 species (3 new) and 10 genera in two related tribes of predaceous biting midges, Heteromyiini and Sphaeromiini (subfamily Ceratopogoninae). Shorelines are the "archetypical arena" in which these larvae thrive, typically above and below the water line. Their habitats and substrates are characterized in detail. The greatest diversity of larvae in these tribes consistently occurs in and along mid-reach streams{Order: 3 to 5). Mechanisms of ecological partitioning by sympatric species, and the differential adaptive significance of larval, pupal and adult morphological characters are evaluated. Taxonomic and ecological diversity in these groups are clearly related. / Ph. D.

A little-known approach to toxicity testing--based on negative phototaxis of larval <u>Aedes aegypti</u>--was investigated as a contribution to the search for rapid methods applicable to the field of water pollution control. Zinc and copper were the toxicants tested. All tests were conducted with a standard "synthetic" dilution water. A mosquito colony was established to provide a uniform supply of test larvae. Preliminary tests were performed on the acute toxicity of zinc and copper against <u>A. aegypti</u> larvae, as well as tests on larval growth and development at various concentrations of the metals. For the photomigration toxicity tests, two juxtaposed troughs were used, one containing the test solution, the other a control. Third instar larvae migrated away from a six-watt fluorescent light for two minutes per run. This was repeated at intervals until 50% were unable to migrate 50 cm in 120 sec. Photographs were taken of the larval migrations. From the pictures an empirical criterion was derived (the 40-cm, 60-sec ET₅₀) through a series of graphical interpolations. All inactivation analyses were based on this criterion. From time-inactivation regression lines, exponential toxicity curves were obtained by interpolation. The curves were of an unusual shape, depicting the characteristic nature of the dosage-response. The sensitivity of the inactivation technique was comparable to that of the acute toxicity tests. However, inactivation was far quicker; depending on concentration, it occurred within one to five hours. By all methods used in this study, zinc and copper were judged to be slow-acting and of low overall toxicity. Copper was, however, consistently more toxic than zinc by at least one order of magnitude. The ET₅₀ in 10 ppm Cu⁺⁺ was 147 min.; in 10 ppm Zn⁺⁺, it was 209 min. Some possible improvements in technique were discussed. It was suggested that the photornigration approach to toxicity testing can be of definite practical use to biologists in water pollution control. / Master of Science

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(農学) / 甲第25353号 / 農博第2619号 / 京都大学大学院農学研究科地域環境科学専攻 / (主査)准教授 大澤 直哉, 教授 日本 典秀, 教授 田中 千尋 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DGAM

La mouche charbonneuse, Stomoxys calcitrans (L.) est une des espèces les plus nuisibles en élevage. Elle est responsable de pertes directes et indirectes : piqûres douloureuses, spoliation sanguine et transmission d'agents pathogènes. Afin de mieux étudier ce parasite, nous avons mis en place un élevage dans notre laboratoire comprenant deux souches issues de stomoxes sauvages capturés respectivement à l'ENVT et dans un élevage bovin biologique. Le protocole d'élevage est décrit. Nous avons comparé les caractères morphologiques externes des différents stades évolutifs obtenus à partir de notre élevage aux données bibliographiques. Nous avons montré les capacités de transmission mécanique par S. calcitrans de Besnoitia besnoiti, agent de la besnoitiose bovine. Nous avons mis en évidence également des différences de sensibilité entre les deux souches à six insecticides dues probablement à une exposition plus grande à ces derniers de la souche ENVT / Stable fly, Stomoxys calcitrans (L.) is one of the most commonly pest of livestock with direct and indirect sides effects: painful bites, blood loss and transmission of pathogens. To better study this parasite, we have established two strains in our laboratory isolated from two geographical origins: the National Veterinary School of Toulouse and an organic cattle farm. We described the rearing protocol in the laboratory. We compared the external morphological characters of the different developmental instars observed in our rearing to data literature. We have demonstrated the ability of S. calcitrans to mechanically transmit Besnoitia besnoiti, responsible of the cattle besnoitiosis. We have also highlighted differences in susceptibility between the two strains to six insecticides probably due to records of higher exposure to them for the ENVT strain

A digestão nos insetos ocorre no intestino médio de forma compartimentada. A digestão inicial dos polímeros ocorre no interior da membrana peritrófica. Os oligômeros resultantes difundem-se para o espaço luminal exterior à membrana peritrófica onde são atacados por outras enzimas. Na digestão final os dímeros resultantes são hidrolisados por enzimas imobilizadas na superfície do epitélio do intestino médio. Após o processo de digestão final os monômeros são absorvidos pelas células do epitélio intestinal. Os Díptera ditos superiores, incluindo a mosca doméstica, apresentam peculiaridades digestivas que aparentemente resultam de adaptações para digerir uma dieta que consiste principalmente de bactérias. No ventrículo anterior ocorre uma diminuição no conteúdo de amido do bolo alimentar. Na porção seguinte, o bolo alimentar passa para o ventrículo médio onde as bactérias são mortas pela ação combinada de baixo pH, uma lisozima digestiva e uma proteinase tipo catepsina D. O material liberado das bactérias é digerido no ventrículo posterior, como ocorre no ventrículo inteiro da maioria dos insetos de outros grupos taxonômicos. Com o objetivo de compreender a peculiar digestão em Musca domestica, foram utilizadas suas larvas para identificar funcionalmente as regiões absortivas de nutrientes, identificar as moléculas envolvidas na absorção de nutrientes, identificar as moléculas envolvidas com tamponamento e fluxos de fluidos intestinais, sequenciar as enzimas digestivas principais e identificar os seus sítios de secreção. Experimentos fisiológicos de absorção de glicose e análises de atividade enzimática permitiram acessar de maneira direta os aspectos da digestão. Contudo, experimentos de sequenciamento de bibliotecas de cDNA, análise de sequências transcritas e verificação de expressão de genes em diferentes tecidos foram abordagens fundamentais na identificação das moléculas subjacentes aos processos fisiológicos intestinas de Musca domestica. Os indícios de que absorção de glicose no intestino de Musca domestica se dê por transportadores do tipo SGLT, com a possível participação de facilitadores do tipo GLUT, permitem estabelecer um foco para futuros estudos. A descrição de sequências relacionadas ao tamponamento intestinal permitiu ampliar a discussão sobre tal processo. Ao detalhar os sítios de expressão da subunidade a da V-ATPase, do canal de cloreto e do transportador de amônia foi possível testar o modelo de tamponamento proposto anteriormente e propor a participação de outras moléculas no processo. Sequências correspondentes as atividades de carboxipeptidase, maltase e aminopeptidase descritas na literatura foram pesquisadas, gerando sequências candidatas a codificarem as referidas enzimas. Com isso, é possível descrever a digestão de oligômeros e dímeros com base nos genes transcritos e nas sequências de aminoácidos que formam as enzimas digestivas. A descoberta da sequência que transcreve uma metaloproteinase, por sua vez, abre caminhos para a descrição e caracterização de sua atividade proteolítica nos tecidos digestivos da larva de Musca domestica. Essa análise permitiu também elucidar a localização dos sítios de expressão e, portanto, as zonas de secreção de enzimas. De maneira geral, este estudo contribuiu para a compreensão de diversos aspectos da digestão de Musca domestica, elucidando questões da particular fisiologia digestiva desse inseto. / Digestion in insects occurs in the midgut in a compartmentalized way. Initial digestion takes place inside the peritrophic membrane. The resulting oligomers diffuse into the luminal space outside the peritrophic membrane where they are hydrolyzed by other enzymes. In the final digestion, the resulting dimers are hydrolyzed by enzymes immobilized on the midgut epithelium. After the final digestion, the monomers are absorbed by intestinal epithelial cells. The so-called higher Diptera, including the house fly, have digestive peculiarities apparently resulting of adaptations to digest a diet consisting mainly of bacteria. In the anterior midgut there is a decrease in the starch content of the food bolus. The bolus now passes into the middle midgut, where bacteria are killed by the combined action of low pH, a special lysozyme and a cathepsin D-like proteinase. Finally, the material released by bacteria is digested in the posterior midgut, as is observed in the whole midgut of insects of other taxa. In order to understand the peculiar digestion in Musca domestica, the larvae were used to identify (a) the functionally the nutrient absorptive regions, (b) the molecules involved in the absorption of nutrients, (c) the molecules involved in buffering and fluid flows, (d) the cDNA sequences corresponding to intestinal digestive enzymes, (e) the main sites of secretion. Physiological experiments of glucose absorption and enzyme activity analysis allowed a direct access to aspects of digestion. Otherwise, cDNA library sequencing followed by sequence annotation and tissue-specific expression analysis were fundamental approaches in the understanding of intestinal physiology of Musca domestica. Evidence that glucose absorption in the gut of Musca domestica occurs through SGLT-like transporters, with the possible participation of facilitators GLUT-like, allowed us to establish a focus for future studies. The description of cDNA sequences corresponding to proteins putatively responsible for intestinal buffering widened the discussion of this process. The finding of the expression sites of V-ATPase subunits, chloride channel, and ammonia transporter led to revising the present buffering model and the inclusion of other molecules in the process. The cDNA sequences corresponding to the activities of carboxypeptidase, aminopeptidase and maltase described in the literature were searched for as candidate sequences to encode those enzymes. This made it possible to describe the digestion of oligomers and dimers based on transcribed genes and enzyme amino acid sequences. The discovery of the metalloproteinase transcribing sequence opened a new research line: the description and characterization of its proteolytic activity in the midgut of the Musca domestica larvae. This study also allowed elucidating the location of digestive enzyme expression sites and, therefore, the putative zones of enzyme secretion. Overall, this study contributed to understanding many aspects of digestion of Musca domestica, clarifying aspects of the peculiar digestive physiology of this insect.

CDKs são proteínas responsáveis pela ativação e progressão do ciclo celular e também apresentam função na ativação e alongamento na transcrição. Dentre elas, CDK7 atua em ambas as funções, fosforilando as CDKs do ciclo celular e fazendo parte do fator geral de transcrição TFIIH como subunidade catalítica. A partir de uma biblioteca de ESTs de glândula salivar, construído com mRNAs presentes durante o período em que ocorre o início do último ciclo replicativo da politenização e início da amplificação gênica, foram encontradas poucas mensagens relacionadas diretamente com o ciclo celular, correspondendo a 3.11% do ESTs. Dentre elas, foram encontradas as mensagens de Cdc2-like e Cdk7; portanto, foi realizada a caracterização do gene Cdk7 e a análise de sua atuação durante o desenvolvimento larval de Rhynchosciara americana. O gene Cdk7 apresenta 4 éxons, mais que em vertebrados. A sequência completa do mRNA foi obtida a partir de RACE, apresentando 1230 bases e uma ORF de 1020 bases. Perfis de expressão foram determinados por RT-PCR e Western blots. Modificações pós-traducionais foram analisadas por imunoblots em 2D. Seu perfil de expressão de mRNA e proteína apresentam variações durante o ciclo celular e entre os tecidos analisados; os imunoblots mostram a presença de uma fosforilação e possíveis modificações na cadeia lateral de alguns aminoácidos. O estudo de proteínas relacionadas ao ciclo celular nesse modelo é importante para um melhor entendimento dos ciclos celulares incomuns presentes em diferentes tecidos de insetos. / CDKs are proteins responsible for activation and progression of cell cycle and also work on the activation and elongation of transcription. Among them, CDK7 acts in both functions, phosphorylating cell cycle CDKs and as a part of general transcription factor TFIIH as its catalytic subunit. From an EST library of salivary gland, constructed with mRNAs present during the period when the beginning of the last polyteny replicative cycle occurs, it was found only few messages directly related to cell cycle, corresponding to 3.11% of the ESTs. Among them, it was found Cdc2-like and Cdk7; therefore, it was performed the characterisation of Cdk7 gene and the analysis of its role during the larval development of Rhynchosciara americana. Cdk7 gene presents 4 exons, more than in vertebrates. Complete mRNA sequence was obtained via RACE, presenting 1230 bases and an 1020 bases ORF. Expression profiles were determined by RT-PCR and Western blots. Posttranslational modifications were analysed by 2D immunoblots. Its mRNA and protein expression profiles presented variations during cell cycle and between the studied tissues; immunoblots showed the presence of one phosphorylation and possible modifications on the side chain of some amino acids. The study of proteins related to cell cycle in this model is important for a better understanding of uncommon cell cycles in different insect tissues.

O gene A1 da alfa amilase foi isolado de uma biblioteca genômica em lambda EMBL3, feita com DNA do díptero primitivo Anopheles merus (Díptera, Nematocera, Culicoidea). Ele foi parcialmente seqüenciado, caracterizado pelo padrão da clivagem das enzimas restritivas e clonado no plasmídeo pIBI24 por Pernasetti (1991 ). No presente trabalho relata-se sua expressão em: bactéria (Escherichia coli AD494), células de inseto ( Spodoptera frugiperda) e em levedura (Pichia pastoris), tendo-se observado que somente nas células de Spodoptera frugiperda a enzima é expressa com atividade. A expressão extracelular do gene A1 foi ensaiada em E.coli AD494 usando o vetor pRSETc. Para este fim a seqüência do gene contendo seu próprio peptídeo sinal, foi inserida em fase de leitura (\"frame\") nesse vetor. A expressão sem peptídeo sinal foi executada usando o vetor pAE2, uma construção derivada- do pRSETc. Numa outra construção, o gene A1 foi inserido em fase de leitura após a seqüência do promotor e do peptídeo sinal do gene A2 (alfa amilase de Bacillus stearothermophilus) utilizando-se o vetor pIBI24-Bst. As células de E.coli AD494 transformadas com estes construções expressaram a enzima sem atividade. A amilase A1 não foi secretada nem com seu peptídeo sinal nem com o da amilase A2. A expressão do gene A1 em levedura (Pichia pastoris) foi feita usando o vetor pPic9, que permite a expressão tanto intracelular quanto a secreção da proteína. O gene foi amplificado por PCR usando \"primers forward\" com o intuito de obter o gene com ou sem peptídeo sinal. O gene contendo o peptídeo sinal foi construído com diferentes seqüências tipo Kozak precedendo o códon ATG. Para a expressão extracelular usou-se o peptídeo sinal do fator alfa do pPic9. Os resultados mostraram que a enzima é expressa mas que permanece dentro da célula sem atividade. As mesmas construções do gene A1 feitas para Pichia foram inseridas em Baculovírus para transfectar células de Spodoptera frugiperda. Neste sistema a amilase foi expressa com atividade principalmente no sobrenadante das culturas transformadas com construções usando o gene contendo o seu próprio peptídeo sinal assim com o peptídeo sinal da amilase de Zabrotes subfasciatus. O gene da alfa amilase de Bacillus stearothermophilus foi expresso no sistema Baculovírus-Spodoptera e na levedura Pichia, usando o gene contendo o peptídeo sinal da amilase de Z. subfasciatu. A proteína foi secretada e tinha atividade em ambos os sistemas. / The alpha amylase A1 gene was isolated trom a genomic library of lambda EMBL3 made with DNA from the primitve Díptera Anopheles merus (Díptera, Nematocera, Cuclicoidea). This gene was partialy sequenced, characterized by standard restriction enzyme cleavage, and cloned into the pIBI24 plasmid by Pernasetti (1991). Here we present the expression of this gene in: bacteria (Escherichia coli AD494), insect cell (Spodoptera frugiperda) and yeast (Pichia pastoris). It was shown that only in Spodoptera frugiperda cells the protein display enzymatic activity. The presence of the A1 product in the extracelullar culture media was tested in Escherichia coli AD494 using the vector pRSETc. To this end, the gene sequence containing its own signal peptide was inserted in frame into the vector. Expression without a signal peptide was conducted using the pAE2 vector, a construct derived from pRSETc. In another construct, the A1 gene was inserted in frame after the promoter sequence and the signal peptide of the A2 gene (alpha amylase Bacillus stearothermophilus) using the pIBI24-Bst vector. Although the E.coli AD494 cells transformed with these constructs expressed the enzyme, no enzyme activity was detected. A1 was not secreted, either with its own signal peptide or with that of amylase A2. Expression of the A1 gene in yeast (Pichia pastoris) was conducted using the pPic9 vector, wich allows intracellular expression or secretion of this protein. The gene was amplified by PCR with forward primers, so as to amplyfy the gene sequence with or without the signal peptide. The gene containing the signal peptide was constructed with different Kozak sequences preceeding the ATG codon. For extracellular expression, the signal peptide of the pPic9 alpha factor was used. The results showed that the enzyme is expressed , but remained within the cell and do not display activity. The same constructs of the A1 gene made for P. pastoris were inserted in Baculovirus to infect Spodopera frugiperda cells. In this system, the amylase was successfully expressed and display enzymatic activity, mainly in the extracellular supernatant, using constructs of the gene with own signal peptide or with the signal peptide for amylase of Zabrotes subfasciatus. The gene A2 was expressed in the Baculovirus/Spodoptera system and the yeast P. pastoris using constructs containing the signal peptide of alpha amylase of Z. subfasciatus, the protein was secreted with activity.

a. Do ponto de vista metodológico dois problemas foram enfrentados neste trabalho: i) extração dos RNA\'s e ii) fracionamento das células das glândulas salivares de R. angelae. i) O processo prático elaborado para resolver o primeiro problema se constituiu numa variação da técnica clássica de extração com fenol. Jogando com a presença de detergente e variações de pH e de temperatura, foi possível se chegar a um método que garante a extração e um fracionamento parcial de, praticamente, todo RNA celular. Com extrações a baixa temperatura obtém-se preferencialmente rRNA e tRNA. O RNA refratário a extração com fenol a frio tem propriedades do RNA nuclear, mas o citoplasma, também parece conter classes de RNA somente extraíveis a quente. A dificuldade de extração do RNA nuclear com fenol frio, foi especulativamente interpretada como uma propriedade das RNP\'s que encerram esta classe de RNA. A grande vantagem deste método de extração está no fato de ter permitido isolar, com as extrações a alta temperatura, frações de RNA enriquecidas em produtos de transcrição específicos de determinados períodos do desenvolvimento larval. ii) O fracionamento celular das glândulas salivares não é alcançado pela aplicação das técnicas tradicionais de fracionamento de tecido. Em vista disso foi necessário procurar uma alternativa experimental para êste caso. Combinando um enzima proteolítico com a ação de detergentes não iônicos foi conseguido um método útil para o fracionamento das células das glândulas salivares. Êste método foi aplicado nesta tese para um estudo inicial das RNP\'s e da transferência do rRNA do núcleo para o citoplasma nas células das glândulas salivares. b. Foi possível verificar com êste trabalho que o rRNA é sintetizado inicialmente na forma de um precursor primário de 37s, o qual é processado no interior do núcleo para dar as espécies maduras de rRNA segundo o esquema: (Ver no arquivo) No 3&#186; período do 4&#186; estádio do desenvolvimento larval de R. angelae, a síntese de rRNA é intensa. Neste mesmo período observa-se claramente um nucleolo típico na base do cromossomo X. No período seguinte ocorre uma redução na síntese das formas maduras de rRNA. Esta queda de síntese é desencadeada por um bloqueio ao nível do processamento dos precursores nucleares de rRNA citoplasmático. Estudos citológicos tem revelado que neste período o nucleolo sofre uma aparente desagregação. c. Os resultados de incorporação de uridina-H3 mostraram que o 3&#186; e 4&#186; períodos tem uma velocidade de síntese de RNA muito à do 2&#186; período. No 4&#186; período quando a síntese de rRNA é inibida aumenta de importância a síntese de outras classes de RNA. Aparentemente é muito intensificada a síntese de RNA nuclear. Êstes resultados são interpretados como consequência da ativação de novos genes nesta época do desenvolvimento larval. Êstes fatos não são inesperados pois este estágio se caracteriza pelo desenvolvimento de \"puffs\" gigantes, os quais são específicos do tecido e do período de desenvolvimento. O 5&#186; período parece representar uma fase de transição entre uma época de ativa síntese de RNA e outra onde a atividade transcritiva sofre uma redução drástica, provavelmente devido à histólise do tecido que vai ocorrer logo em seguida. d. Os dados apresentados nesta tese são considerados sob todos os aspectos significativos. Com isto faz-se uma tentativa de discussão crítica, no sentido de avaliar a importância do sistema glândulas salivares de R. angelae, como modelo de estudo para a genética molecular dos organismos superiores. / Not available

Insetos abrangem o maior número de espécies descritas, estando distribuídos por praticamente todos os nichos ecológicos. O tubo digestivo destes animais consiste na principal interface entre estes e o meio externo. Assim, o estudo das enzimas digestivas, ou proteínas relacionadas ao processo digestivo em insetos, faz-se fundamental para a tentativa de desenvolver novos métodos de controle que ajam via canal alimentar, como o uso de plantas transgênicas para controlar insetos fitófagos (Felton & Gatehouse, 1996). Diptera superiores são os únicos animais, além dos vertebrados, que apresentam uma região ácida em seu intestino médio (Vonk & Western, 1984). Assim, o estudo da digestão ácida nestes organismos permite-nos examinar em detalhe este interessante paralelismo evolutivo (muito revelador se incluir também aspectos moleculares). Para realização deste estudo foram escolhidas duas enzimas relacionadas com a digestão ácida em Diptera: uma aspártico-proteinase de Musca domestica, semelhante à catepsina D, e uma lisozima digestiva de Drosophila melanogaster. Para purificar a aspártico-proteinase intestinal de M. domestica, ventrículos anterior e médio de larvas deste inseto foram homegeneizados e centrifugados, sendo o sobrenadante resultante utilizado como fonte de enzima. A combinação de uma cromatografia em coluna de troca iônica seguida de uma filtração em gel mostrou-se como a melhor para a obtenção da aspártico-proteinase intestinal de larvas de M. domestica totalmente purificada. Clones de lisozima de D. melanogaster (LysD) e de A. darlingi (Lysdar) foram utilizados na construção de vetores de expressão a seguir usados na transformação de E. coli linhagem OrigamiTMB (DE3) e P. Pastoris GS115 (his4). As bactérias transformadas com vetor pT7-dar (que continha o gene Lysdar), quando induzidas por IPTG, foram capazes de expressar uma proteína, cujo peso molecular em gel de SDS-PAGE é de cerca de 14 kDa, como o esperado. A lisozima hipotética foi encontrada em corpos de inclusão, que solubilizados por SDS 3% resultaram em proteína inativa. Colônias de P. pastoris transformadas com o vetor pPIC-9-D (contendo o gene LysD) foram submetidas a reação em cadeia com DNA polimerase. Aquelas que geraram produtos de PCR de tamanho coerente com o de uma lisozima foram cultivadas e posteriormente, induzidas por metanol. P. pastoris é capaz de secretar a lisozima induzida. Assim, alíquotas do meio de indução foram utilizadas em ensaios enzimáticos para a detecção da atividade da lisozima intestinal de D. melanogaster. A lisozima é expressa em P. pastoris em grande quantidade (12 mg/L) e com atividade preservada. Foi verificado que há uma intima relação entre a força iônica do meio e o pH ótimo da lisozima intestinal recombinante de D. melanogaster. O pH ótimo é deslocado para valores mais ácidos quando em forças iônicas maiores. Em contrapartida, os valores de atividade obtidos para a lisozima D recombinante de D. melanogaster decrescem com o aumento da força iônica do meio. / Insects are the most numerous of living beings and are found in almost all habitats. The midgut of these animals is the main interface between them and their enviroment. Thus, the study of digestive enzymes or of other proteins relateded to the insect digestive process is putatively useful for the development of new insect control strategies. Houseflies (higher Diptera) are the only animals, besides vertebrates, that present an acidic region in the midgut (Vonk & Western, 1984). Due do that, a detailed analysis of the acidic digestion in these insects may disclose molecular evolutionary paralellisms between those animals. Two enzymes were chosen along the aims discussed: a Musca domestica aspartic-proteinase, similar to cathepsin D and a digestive lysozyme from Drosophila melanogaster. To purify the cathepsin D-like proteinase from M. domestica larvae, larval foreguts and midguts were homogeneized, centrifuged, and the resulting supernatant was used as an enzyme source. Ion-exchange chromatography followed by a gel filtration of enzyme extract resulted in a homogeneous preparation of the enzyme. Clones of lysozyme from D. melanogaster (LysD) and A. darling (Lysdar) were used in the construction of expression vectors, which were used to transform E. coli cells (OrigamiTM B(DE3)) and P. pastoris GS115 (his4). Bacteria transformed with pT7-dar (the expression vector which contained the gene Lysdar), when induced by IPTG, expressed a protein with a molecular weight of 14 kDa, as expected for lysozyme. This protein was found in inclusion bodies that were solubilized in 3% SDS resulting in a protein with no activity. After choosing at random P. pastoris colonies transformed with the expression vector pPIC9-D (containing the gene LysD), they were submited to a PCR. The colonies with 366pb products were grown and induced by methanol. P. pastoris was engineered to excrete the expressed proteins. In accordance to that, about 12 mg of lysozyme were recovered from each litter of culture medium. Recombinant D. melanogaster lysozyme D was more active at acid pH values, when present in media with physiological ionic strengths, and its Km value increased with the ionic strength of media. This is agreement with data obtained with lysozyme D isolated from D. melanogaster midgut. The results support the assertion that this enzyme may be used in crystalographic and site mutagenesis studies to reveal the molecular basis of its catalytic properties.