A família Mycetophilidae (Diptera) é a segunda mais numerosa e diversificada da infraordem Bibionomorpha. Inclui tradicionalmente sete subfamílias: Sciophilinae, Gnoristinae, Mycomyiinae, Leiinae, Manotinae, Allactoneurinae e Mycetophilinae. Os gêneros Dziedzickia e Schnusea, foco deste estudo, pertencem à subfamília Gnoristinae. Dziedzickia foi descrito por Johannsen, em 1909. A maioria de suas espécies é conhecida da região Neotropical (38 espécies viventes), porém também ocorrendo nas regiões Paleártica (2), Neártica (7), Oriental (1) e Afrotropical (5). O gênero neotropical Schnusea foi estabelecido por Edwards, em 1933. Atualmente, reconhecem-se cinco espécies viventes. Uma das características considerada apomórfica do gênero Schnusea é a ausência completa da venação alar M1+2, a qual pode ser plesiomórfica nas espécies de Dziedzickia, sugerindo que esse último gênero poderia ser parafilético com relação ao primeiro. O estudo de diversidade resultou no reconhecimento de 47 espécies neotropicais válidas, incluindo seis espécies novas de Dziedzickia e três espécies como sinônimos juniores, e na inclusão de Schnusea como sinônimo júnior de Dziedzickia. Além disso, é apresentada uma chave de identificação para as espécies neotropicais do gênero. Para a análise filogenética foram levantados 41 caracteres morfológicos de indivíduos adultos, resultando em uma amostragem de 49 (somente machos) e 55 (machos e fêmeas) táxons terminais. Foram realizadas buscas heurísticas com pesos iguais e pesagem implícita, seguidas por uma análise de sensibilidade. A análise de sensibilidade foi realizada com o intuito de avaliar quantas vezes cada clado aparece em relação aos diferentes valores de k. Não há diferenças entre a análise de sensibilidade realizada somente com machos e aquela realizada com machos e fêmeas. Em todas as análises, as espécies assinaladas a Schnusea formam um clado bem suportado dentro de Dziedzickia e Gnoristinae é corroborada como um grupo monofilético. O gênero Dziedzickia é monofilético após a inclusão de Schnusea. A metodologia de análise de sensibilidade mostrou-se uma ferramenta útil como medida de suporte, indicando a robustez de alguns clados quando diferentes parâmetros de análise são utilizados. Dois padrões biogeográficos bem circunscritos foram encontrados para as espécies neotropicais de Dziedzickia: um composto por espécies com distribuição restrita ao sul da América do Sul e outro formado por espécies com distribuição ao norte da América do Sul e Região do Caribe. Ademais, existe um clado formado por apenas espécies afrotropicais, corroborando a idéia de que o gênero apresenta diferentes subgrupos com disjunção intercontinental. / Mycetophilidae (Diptera) is the second largest and most diversified family of the infraorder Bibionomorpha. Traditionally, it includes seven subfamilies: Sciophilinae, Gnoristinae, Mycomyiinae, Leiinae, Manotinae, Allactoneurinae, and Mycetophilinae. The genera Dziedzickia and Schnusea, issues of this study, belong to the subfamily Gnoristinae. Dziedzickia was described by Johannsen in 1909. Most of its species is known from the Neotropical Region (38 extant species), but they are also found in the Palaearctic (2), Nearctic (7), Oriental (1), and Afrotropical (5) Regions. The Neotropical genus Schnusea was stated by Edwards, in 1933. Currently, five extant species are recognized for this genus. One of the characteristics thought to be apomorphic for Schnusea is the absence of M1+2 wing venation, which may be plesiomorphic for the species of Dziedzickia, suggesting that the latter could be paraphyletic in relation to the former. The study of diversity resulted in the recognition of 47 Neotropical valid species, including six as new species of Dziedzickia and three as junior synonyms, and in the inclusion of Schnusea into the synonymy of Dziedzickia. Furthermore, a key to the Neotropical species of Dziedzickia is herein presented. For the phylogenetic analysis 41 morphological characters of adult individuals have been surveyed, resulting in a sampling of 49 (males only) and 55 (both males and females) terminals. Heuristic searches were performed with equal weights and implied weighting, followed by a sensitivity analysis. The sensitivity analysis was carried out in order to access to measure how often each clade appears for different values of k. No differences between the sensitivity analysis done with males only and those performed with both males and females at same time were detected. In every analysis, species assigned to Schnusea form a well-supported clade within Dziedzickia and Gnoristinae is recovered as a monophyletic group¬¬¬. The genus Dziedzickia is monophyletic after the inclusion of Schnusea. The methodology of sensivity analysis shown to be a useful tool for measure support, indicating the robustness of certain clades when different analysis parameters are utilized. Two well-circumscribed biogeographic patterns were found for Neotropical species of Dziedzickia: one composed of species confined to Southern South America and one formed exclusively by species from Northern South America and Caribbean Region. Furthermore, there is a clade composed of Afrotropical species only, indicating that Dziedzickia has different subgroups with intercontinental disjunction.

INTRODUÇÃO: O subgrupo Anopheles strodei é pouco estudado apesar de sua importância epidemiológica potencial. Espécies desse subgrupo foram encontradas naturalmente infectadas por parasitos que causam malária em humanos, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax e Plasmodium malariae, no Brasil. O subgrupo Anopheles strodei compreende oito espécies: An. rondoni (Neiva & Pinto), An. albertoi Unti, An. arthuri Unti, An. strodei Root, An. strodei CP, e três outras espécies que foram propostas por Bourke et al. (2013), mas não foram descritas: An. arthuri B, An. arthuri C e An. arthuri D. OBJETIVOS: A definição e delimitação precisa de espécies que atuam como vetores de agentes infecciosos é um dos objetivos da entomologia da saúde pública. Os objetivos deste estudo foram: 1) Estabelecer as relações filogenéticas entre espécies do Subgrupo Strodei; 2) Estimar a distribuição espacial potencial das espécies do Subgrupo Strodei; 3) Confirmar a presença de quatro espécies sob o nome An. arthuri. MÉTODOS: Sequências de DNA de um gene mitocondrial (fragmento de 658 pares de bases do código de barras do gene COI, citocromo oxidase subunidade I) e de três genes nucleares codificadores de proteínas (White, CAD e CAT) foram empregadas para estabelecer as relações filogenéticas potenciais entre as espécies que compõe o subgrupo An. strodei. As análises filogenéticas foram conduzidas utilizando abordagem Bayesiana das sequências de DNA dos quatro genes. Para estabelecer a distribuição espacial potencial das espécies, utilizou-se abordagem de máxima entropia de nichos ecológicos. Para isso as localidades das coletas, juntamente com os dados climáticos e geográficos foram introduzidos no programa MAXENT. RESULTADOS: Os resultados das análises filogenéticas demonstraram e, portanto, confirmaram o monofiletismo do Subgrupo Strodei, a presença de pelo menos sete espécies sob o nome An. strodei, ou seja, corroborou a validade de An. albertoi, An. arthuri, An. strodei, An. strodei CP, além das espécies denominadas, preliminarmente, como An. arthuri B, An. arthuri C e An. arthuri D. Portanto, como definida atualmente, An. arthuri não representa grupo monofilético, pois inclui táxons que deverão ser formalmente descritos em estudos futuros. CONCLUSÃO: As distribuições potenciais de espécies do Subgrupo Strodei foram propostas pela primeira vez. Cinquenta e cinco sequências do gene nuclear CAT e outras 46 sequências do gene nuclear CAD únicas foram recentemente caracterizadas para espécies do Subgrupo Strodei de Anopheles (Nyssorhynchus), confirmando a presença de pelos menos sete espécies, além de An. rondoni que não foi alvo deste estudo, mas de outros anteriores que confirmaram a validade da mesma. / Introduction Anopheles strodei sensu lato is an understudied subgroup of potential epidemiological importance, having been found naturally infected in Brazil with Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax and Plasmodium malariae. An. strodei s.l. is currently composed on 8 species: An. albertoi Unti, An. CP Form, An. rondoni (Neiva & Pinto), An. strodei Root, An. arthuri Unti and three other unnamed species that have been proposed by Bourke et al. (2013): An. arthuri B, An. arthuri C and An. arthuri D. Objectives As delineating species accurately is an essential goal of public health entomology, the objectives of this study were to: 1) Determine the phylogenetic relationships within the Strodei Subgroup and reaffirm or reject the hypothesis of the 3 new species (An. arthuri B, An. arthuri C and An. arthuri D) 2) Address the potential spatial distribution of species of the An. strodei subgroup to provide support for the candidate species in the Strodei Subgroup Methods Bayesian inference, which included DNA sequences of one mitochondrial and three nuclear protein coding genes: CO1, white, CAD and CAT, was used to determine the phylogenetic relationship within the group. To propose a species distribution, collection localities, along with climatic and geographic data were input into MAXENT. Results When analyzing the four molecular markers employed, support was found for allopatry in the Strodei Subgroup. The paraphyletic clade of An. arthuri was supported. Conclusion Potential species distributions of the Strodei Subgroup were addressed for the first time. Fifty-five unique CAT sequences and 46 unique CAD sequences were newly characterized.

A Ordem Diptera é constituída de milhares de espécies, cujo tempo de divergência pode chegar a 250 milhões de anos entre representantes das Sub-Ordens Brachycera e Nematocera. Esta janela temporal, no entanto, não é suficiente para explicar o aparecimento de estruturas cromossômicas terminais alternativas aos telômeros canônicos, conservados desde eucariontes unicelulares até mamíferos. Alguns autores admitem que estruturas não canônicas tenham sido geradas e selecionadas a partir de eventos mutacionais que resultaram na perda da telomerase em espécies ancestrais. Especulações deste tipo, embora pertinentes, não levam em conta que o número de espécies de dípteros estudados até aqui quanto a telômeros e sub-telômeros está longe de representar a diversidade na Ordem. Como evidência negativa não constitui prova, a possível existência de dípteros dotados de telômeros canônicos não pode ser descartada. Também neste sentido, a possível ocorrência de retrotransposons especificamente terminais, como vistos em Drosophila, em espécies ainda não estudadas pode ser vista como possibilidade em aberto apesar da evidência negativa documentada no presente trabalho em R. Americana e em T. pubescens. Outra idéia que tem ganhado corpo com dados procedentes de telômeros não canônicos refere-se à possibilidade de que um organismo apresente mais de uma sequência de DNA terminal. Pouco comentada, esta noção teve início em meados da década de 1980 quando foram publicados os primeiros trabalhos sobre o DNA telomérico de espécies da família Chironomidae. O aparecimento destes dados na literatura praticamente coincidiu com a publicação da descoberta da telomerase. Mais tarde, estudos em Drosophila têm mostrado que três retrotransposons com sequências diferentes podem compor o DNA telomérico nesta espécie. Além disto, repetições aparentemente terminais em Anopheles hibridam em um único telômero, sugerindo que sequências desconhecidas estejam presentes em outros telômeros. Dados obtidos neste trabalho mostram em R. Americana uma nova repetição em tandem que apresenta características de sequência telomérica, a exemplo de duas outras caracterizadas com antecedência nesta espécie. Assim, R. Americana poderia ser vista como exemplo adicional de organismo dotado de mais de uma sequência de DNA terminal. No final da presente exploração, não foi possível a identificação de sequências comuns às extremidades cromossômicas de T. pubescens. Os resultados obtidos sugerem que esta espécie apresenta uma estrutura cromossômica terminal distinta se comparada àquelas de dípteros estudados até então. Uma das hipóteses levantadas a partir dos resultados observados é a de que sequências teloméricas estão presentes em todas as extremidades cromossômicas de T. pubescens; o problema estaria na impossibilidade de visualizá-las através de hibridação in situ em função do comprimento do DNA telomérico que estaria abaixo do limite da técnica de detecção. Isto implicaria deixar de lado os métodos usualmente empregados pelo laboratório na busca de DNA repetitivo terminal. Caso esta espécie apresentasse repetições terminais curtas como aquelas caracterizadas em R. Americana, uma das alternativas seria a de sequênciar massivamente clones obtidos por microdissecção e DOP-PCR até encontrarmos sequências com estas características. Em seguida, o ensaio com Bal-31 seria decisivo na determinação da posição cromossômica das mesmas. Finalmente, os dados sintetizados nos três capítulos deste trabalho reforçam a afirmação de que a Ordem Diptera é uma fornte privilegiada de diversidade quanto a estruturas cromossômicas terminais. Apesar das dificuldades inerentes à exploração de organismos não modelares, a continuidade dos estudos sobre telômeros e sub-telômeros nestas espécies certamente ampliará o conhecimento sobre alternativas de manutenção da integridade cromossômica a partir de suas extremidades / The vast majority of eukaryotic organisms have short tandem repeats and telomerase as components of telomeric structures. However, in dipteran species, this structural conservation is not found. While in Drosophila telomeres are composed of specific retrotransposons, complex tandem repeats are found in the genus Anopheles and in species of Chironomus. In Rhynchosciara americana (family Sciaridae), short repetitions (16 and 22 base pairs) arranged in tandem are observed at chromosome terminal regions. Moreover, in situ hybridization using RNA probes suggests that a third repetition enriched with homopolymeric (dA)/(dT) could occupy significant portions of this chromosomal region in R. americana. In addition, a retroelement named \"RaTART\" was described at chromosomal ends of R. americana; this element enables telomeric maintenance by retrotransposon action in basal dipterans. In this thesis, we present results that rule out the possibility that the \"RaTART\" element occupies the chromosome terminal structure in R. americana. Additional analyses were performed with the sequence RaTART from GenBank and primers designed for the amplification of significant portions of the regions 5′UTR, 3′UTR, and the coding region for reverse transcriptase (RT) of this retroelement. The sequencing and in situ hybridization of these three fragments obtained after PCR (5′UTR, 3′UTR, and RT) indicate that the retroelement RaTART corresponds to a chimeric genomic clone, consisting of distinct repetitive elements, of which only one might be present at the apparent enrichedment terminal. In the second phase of this thesis, we describe a method for the isolation and characterization of the homopolymeric (dA)/(dT) sequence described in the chromosome terminal regions of R. americana. Named T-14, this sequence shares some similarity with canonical telomeric repeats, suggesting that R. americana represents an additional example of an organism where more than one DNA sequence may extend toward the chromosome terminal regions. Finally, we present the results of heterologous hybridization to elucidate structural aspects of conservation and/or divergence in Sciaridae terminal heterochromatin. Three species of the family Sciaridae were assessed by in situ hybridization of polytene chromosomes: R. americana, Rhynchosciara milleri, and Trichosia pubescens. The DNA probe used was obtained by microdissection of non-centromeric chromosome ends from R. americana and T. pubescens, followed by amplification and labeling by degenerate oligonucleotide primed (DOP-PCR). When each probe was hybridized to own chromosome complement, two patterns were observed: (i) hybridization at all non-centromeric ends (R. americana), and most surprisingly, (ii) hybridization only at the end that gave the product of microdissection (T. pubescens). Probes obtained from R. americana produced no hybridization signals on chromosomes of T. pubescens and R. milleri. Unexpected results were obtained when the probe obtained from T. pubescens was hybridized with chromosomes of R. americana and R. milleri. Surprisingly, this probe, which scored only one end in its own chromosome complement, generated hybridization signals in all non-centromeric chromosomal ends of R. americana, as well as in its pericentromeric-centromeric heterochromatin. In R. milleri, the probe from T. pubescens clearly hybridized with centromere-associated heterochromatin of its chromosome C. The data obtained in this study support a process of chromosomal divergence between these three species of Sciaridae occurred by differential amplification of sequences of heterochromatin components, and point to an unusual structure in T. pubescens compared to other dipterans studied for terminal chromosome structure

Os cecos gástricos de Rhynchosciara americana e de outros insetos são órgãos envolvidos em digestão terminal e/ou absorção de nutrientes. Devido a isso, a sua disposição na região anterior do ventrículo é intrigante. Uma explicação para essa localização seria a existência de uma circulação endo-ectoperitrófica de fluidos e de enzimas digestivas, como foi proposto anteriormente em R. americana. Afim de procurar reforçar o modelo proposto procurou-se obter dados sobre a ultraestrutura das células do tubo digestivo e sobre a composição enzimática de suas microvilosidades. As células dos cecos e do ventrículo posterior distal tem uma ultraestrutura bastante semelhante; elas possuem grandes microvilosidades apicais e a membrana plasmática basal apresenta invaginações com mitocôndrias associadas, embora a maioria dessas organelas sejam encontradas no citoplasma apical. O compartimento extracelular delimitado por essas invaginações da membrana basal apresenta poucas aberturas para a hemolinfa, o que dá à célula a possibilidade de concentrar solutos nesse compartimento. As células do ventrículo anterior possuem microvilosidades apicais muito pequenas e um sistema elaborado de invaginações da membrana basal, com muitas mitocôndrias associadas, e que se estendem até quase o ápice das células. O compartimento extracelular delimita do por essas invaginações apresenta, nessas células, grande número de aberturas para a hemolinfa. O ventrículo posterior proximal representa uma região de transição entre o ventrículo anterior e o ventrículo posterior distal. A ultraestrutura dos cecos e ventrículo posterior distal é coerente com uma função na absorção de fluidos, enquanto que aquela do ventrículo anterior e coerente com uma função de secreção de fluidos. A análise da composição de enzimas nas microvilosidades das diferentes regiões do intestino médio mostrou novamente que as células dos cecos e do ventrículo posterior distal são semelhantes e também que devem estar envolvidas na digestão terminal dos nutrientes, pois possuem alta atividade específica para hidrolases de oligômeros. As células do ventrículo anterior (e do ventrículo posterior proximal) possuem microvilosidades com atividade específica muito baixa para as hidrolases de oligômeros, corno seria de esperar para urna célula que estivesse secretando fluidos, pois o substrato seria continuamente arrastado para longe da enzima. Os dados obtidos permitiram reforçar e refinar o modelo da circulação endo-ectoperitrófica de enzimas em R.americana. Para melhor compreensão da digestão terminal de proteínas em R.americana, aminopeptidases de diferentes regiões do tubo digestivo foram estudadas. As aminopeptidases do lúmen e do citossol das células dos cecos são semelhantes, e ambas diferem daquelas presentes na membrana plasmática dessas células. Os dados obtidos apoiam a hipótese de que a maioria das aminopeptidases solúveis nas células dos cecos são enzimas em via de serem secretadas para o lúmen e somente urna quantidade muito pequena pode ter urna função intracelular. Para iniciar o estudo das propriedades das enzimas envolvidas na digestão terminal, a celobiase ligada a membrana plasmática dos cecos foi escolhida. A celobiase solubilizada por Triton X-100 apresenta um peso molecular de 106.000 e um pI de 5,4, enquanto que a solubilização por papaína resulta em urna molécula com peso molecular de 65.000 e um pI de 4,7. A celobiase solubilizada por papaína e purificada por centrifugação em gradientes de densidade hidrolisa β-glicosídeos, β-galactosídeos e β-fucosídeos em um mesmo sítio ativo. Com base na comparação entre os Kis e os Kms para celobiose e para pNPβGli e na constância do Km obtido em diferentes pHs, tem-se uma forte evidência que essa enzima opera segundo uma cinética de equilíbrio rápido e não de estado estacionário. O fato da hidrólise da ligação β-glicosídica ocorrer sem inversão da configuração, ocorrer uma grande inibição da celobiase pela δ-gliconolactona e substituintes do radical aglicone influenciarem a constante catalítica sugere que, no mecanismo de catálise da celobiase, há formação de um íon carbônium intermediário e que não há formação de um complexo covalente enzima-substrato. / The gastric caeca of Rhynchosciara americana and other insects are involved in terminal digestion and/or absorption of nutrients. Due to that, their occurrence near the oesophagus is puzzling. One explanation for this should be the existence of an endo-ectoperitrophic circulation of fluids and digestive enzymes as previously proposed for R. americana. In order to support the proposed model of endo-ectoperitrophic circulation of digestive enzymes, fine structural and enzymological data on the midgut cells were obtained. Midgut caecal and distal posterior ventricular cells have a similar ultrastructure characterized by large apical microvilli and a basal plasma membrane infolded with associated mitochondria which are, nevertheless, more conspicuous in the apical cytoplasm. The fact that the basal plasma membrane infoldings constitute an extracellular compartment, with few openings into the underlying extracellular space, should permit the cell concentrate solutes in that compartment. The anterior ventricular cells possess small microvilli disposed in the cell apexes and elaborate mitochondria-associated basal plasma membrane infoldings extending almost to the tips of the cells. These infoldings display regular openings into the underlying extracellular space. The proximal posterior ventriculus represents a transition region between the anterior ventriculus and the distal posterior ventriculus. The fine structure of caeca and distal posterior ventricular cells is in accordance to their presumed function in fluid absorption, whereas the fine structure of anterior ventricular cells suggests a function in fluid secretion. Hydrolase assays in microvilli samples prepared from cells of different midgut regions showed that caeca and distal activities for digestive enzymes, suggesting a role in terminal posterior ventricular cells are alike in displaying high specific digestion. In contrast, very low specific activities of digestive enzymes were found in anterior ventricular cells, in accordance to their proposed function in fluid secretion. The results lend support to the model of the endo-ectoperitrophic circulation of digestive enzymes in R. americana. In order to extend our knowledge on protein terminal digestion, the aminopeptidases from cytosol and lumen were found to be similar and to differ from caecal microvillar aminopeptidades. The data support the assumption that the majority of the soluble aminopeptidases from the caecal cells are enzymes en route to their being secreted and only a minor amount would have a typical intracellular function. Caecal plasma membrane-bound cellobiase was chosen to initiate a detailed study of the properties of the enzymes involved in terminal digestion. The Triton X-100-solubilized cellobiase displays a molecular weight of 106.00 and a pI of 5.4, whereas the papaintreated cellobiase shows a molecular weight of 65.000 and a pI of 4.7. The papain-solubilized cellobiase, after being purified by density gradient centrifugation, hydrolyze β-g1ucosides, β-galactosides and β-fucosides in the same active site. The cellobiase seems to operate according to a rapid equilibrium kinetics, since the Km for cellobiose is constant over a wide range of pHs and the Km for cellobiose and pNPβGlu are identical to their Kis in a experiment of competition between substrates. The hydrolysis of the β-g1ucosidic bound occurs without inversion of configuration, δ-gluconolactone is a strong inhibitor of cellobiase and substituints in the substrate aglycone affects the catalytic constant of the reaction. These data support the assumption that the mechanism of the reaction catalysed by cellobiase involves the intermediary formation of a carbônium ion, instead of a glucosyl-enzyme intermediate.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-07-19T13:40:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese final.pdf: 4052323 bytes, checksum: 74297c119131b87a26908be1d213027a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-19T13:40:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) tese final.pdf: 4052323 bytes, checksum: 74297c119131b87a26908be1d213027a (MD5) Previous issue date: 2015-12-01 / CAPEs / O uso de insetos visando responder aos quesitos levantados em investigações criminais ganhou espaço nas últimas décadas entre os pesquisadores e profissionais desta área, assim como a combinação de técnicas de genética forense para a obtenção de DNA humano a partir destes organismos, em especial dos dípteros necrófagos. Desse modo, neste estudo objetivou-se obter e testar um protocolo de identificação de DNA humano extraído a partir de larvas de dípteros coletadas em cadáveres no Instituto de Medicina Legal de Pernambuco Antonio Persivo Cunha (IMLAPC/PE). Inicialmente, espécimes imaturos foram coletados no IMLAPC/PE e criados em dieta a base de carne moída bovina para possibilitar a identificação da espécie mais abundante e frequente que se cria neste substrato. A espécie Chrysomya albiceps (Diptera: Calliphoridae) foi selecionada como modelo experimental. Grupos de larvas dessa espécie foram submetidos a uma dieta baseada em carne moída e sangue humano por 48 horas, dissecadas e submetidas a extração de DNA, utilizandose duas metodologias comumente adotadas pelos laboratórios de genética forense: Kit DNA IQ™ e Método Fenol-Clorofórmio. O DNA extraído foi quantificado através de Nanodrop® e Real-Time PCR 7500 com uso do Quantifiler® Duo DNA Quantification. Para amplificação do DNA foram usados os kits para STR (short tandem repeats): AmpFℓSTR® Identifiler® Plus PCR Kit, Argus X-12® Kit e PowerPlex® Fusion System kit. As amostras amplificadas foram analisadas por eletroforese capilar em ABI PRISM 3500, permitindo observar que, para os kits utilizados houve perfis íntegros e compatíveis com a amostra referência, a partir da extração com kit DNA IQ™ e/ou método Fenol- Clorofórmio. Além disso, foram testados quatro meios de armazenagem comumente utilizados em zoologia: etanol 70%, etanol 95%, formol 4% e via seca. Após 24 horas de armazenagem, as amostras foram submetidas aos processos de análise de DNA e o formol 4% apresentou os melhores perfis de DNA. O fato de haver perfis passíveis de comparação confirma a utilidade das larvas de dípteros usadas para este fim, as quais podem futuramente ser usadas para correlacionar perfis genéticos com uma cena criminal. O aprimoramento destas técnicas é necessário para que o uso das larvas de dípteros muscóides com emprego para a entomogenética tenha mais difusão entre os meios acadêmico e forense. / The use of insects for investigations has gained ground in recent decades among researchers and criminal professionals. Recently, the use of these animals has been combined with forensic genetics techniques for obtaining human DNA from these. Among the main focus groups for this technique are the carrion flies that have the host DNA extracted from intestinal contents. Because the visibility of this branch of forensic biology, this study aimed to obtain and test a protocol for identifying human DNA extracted from larvae of Diptera at the Instituto de Medicina Legal de Pernambuco Antonio Persivo Cunha (IMLAPC/PE). The species Chrysomya albiceps (Diptera: Calliphoridae) was selected as an experimental model. Groups of larvae of this species were subjected to diet ground meat and human blood for 48 hours, dissected and subjected to DNA extraction using two methods commonly used by forensic genetics laboratories: DNA IQ™ Kit and Method phenol-chloroform. The extracted DNA was quantified by Nanodrop® and Real-Time PCR 7500 with use of Quantifiler® Duo DNA Quantification. For DNA amplification kits for STR (short tandem repeats) were used: AmpFℓSTR® Identifiler® Plus PCR Kit, Argus X-12® Kit and PowerPlex® Fusion System kit. The amplified samples were analyzed by capillary electrophoresis in ABI PRISM 3500, allowing to observe for kits used there have upright profiles and compatible with the reference sample, from the IQ™ DNA extraction kit and/or phenol-chloroform method. In addition, four storage means commonly used in zoology were tested: 70% ethanol, 95% ethanol, 4% formaldehyde and dry. After 24 hours of storage, the samples were submitted to DNA analysis processes and the 4% formaldehyde DNA showed the best profile. The fact that there be comparable profiles confirms the usefulness of dipteran larvae used for this purpose, which can further be used to correlate genetic profiles and a criminal scene. The improvement of these techniques is required for the use of larvae dipterae with employment for the entomogenetics have more diffusion among academic and forensic means.

A família Mycetophilidae é a segunda mais especiosa da subordem Bibionomorpha (Diptera), abrangendo 233 gêneros e cerca de 4.500 espécies descritas de todas as regiões biogeográficas. A monofilia de Bibionomorpha e de Mycetophilidae é bem corroborada na literatura. A família de modo geral tem sido dividida nas subfamílias Sciophilinae, Gnoristinae, Mycomyiinae, Leiinae, Manotinae, Allactoneurinae, Mycetophilinae. Atualmente, uma das subfamílias que tem recebido menos atenção na literatura é Leiinae e o entendimento das relações entre seus gêneros é ainda incipiente. Essa subfamília compreende um grupo de gêneros caracterizados principalmente por um deslocamento da base do setor radial (Rs) em direção ao ápice da asa, resultando em uma R1 curta, mas há inúmeras exceções que levantam questionamentos sobre o monofiletismos do grupo e resultam em diferentes hipóteses sobre a inclusão ou não de determinados gêneros em Leiinae, como é o caso de Docosia Winnertz, Tetragoneura Winnertz, Ectepesthoneura Enderlein, Novakia Strobl, Sticholeia Søli, Aphrastomyia Coher & Lane, entre outros. O objetivo deste trabalho foi estudar, com base em morfologia, as relações filogenéticas entre os gêneros de Leiinae, propondo limites genéricos para a subfamília. Para tanto, foram realizadas análises filogenéticas apenas com grupos viventes e com a adição de táxons fósseis. O estudo filogenético realizado indica que é possível atribuir a Leiinae um agrupamento monofilético relativamente amplo, caracterizado pela presença do mesopleurotrocantin e do mesepímero sem contato com a região ventral do tórax, terminando no mesopleurotrocantin. Os gêneros Docosia, Novakia, Ectrepesthoneura e Tetragoneura não fazem parte de Leiinae e são alocados provisoriamente em Gnoristinae. Sticholeia também não pertence à Leiinae, sendo grupo-irmão de Allactoneura e, portanto, transferido para Allactoneurinae. Leiinae passa a compreender 27 gêneros viventes. A análise realizada com fósseis não foi informativa filogeneticamente. / The family Mycetophilidae is the second most diverse of the suborder Bibionomorpha (Diptera), with 233 genera and about 4.500 species known from all biogeographical regions. The monophyly of Bibionomorpha and Mycetophilidae is well corroborated in the literature. The family has been divided in the subfamilies Sciophilinae, Gnoristinae, Mycomyiinae, Leiinae, Manotinae, Allactoneurinae, Mycetophilinae. Currently, Leiinae is one of the subfamilies with less attention in the literature and the knowledge on the relationships between its genera is still incipient. This subfamily comprises a group of genera characterized by a displacement of the base of the radial sector (Rs) towards the wing apex, resulting in a short R1. There are several exceptions that point in doubts the monofiletism of the group and result in different assumptions on the inclusion or not of certain genera in Leiinae, as Docosia Winnertz, Tetragoneura Winnertz, Ectepesthoneura Enderlein, Novakia Strobl, Sticholeia Søli, Aphrastomyia Coher & Lane, among others. The aim of this study was recover the phylogenetic relationships among the Leiinae genera, based on morphology, proposing generic limits for the subfamily. Thus, phylogenetic analyzes were performed with living genera and with the addition of fossil taxa. The phylogenetic analysis indicates that Leiinae is a monophyletic group, characterized by the presence of mesopleurotrochantin and the mesepimeron not reaching the ventral region of the thorax, ending in the mesopleurotrochantin. The genera Docosia, Novakia, Ectrepesthoneura, and Tetragoneura not belongs to Leiinae and are temporalily allocated in Gnoristinae. Sticholeia is not a member of Leiinae as well being sister group of Allactoneura and thus is transferred to Allactoneurinae. Leiinae now comprises 27 living genera. The analysis performed with fossils was not phylogenetically informative.

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2017-06-22T17:12:01Z No. of bitstreams: 1 2015 - Zeneida Teixeira Pinto.pdf: 2580042 bytes, checksum: 0224e4e1200e83ae2a5e09bfaf7ca97d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-22T17:12:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015 - Zeneida Teixeira Pinto.pdf: 2580042 bytes, checksum: 0224e4e1200e83ae2a5e09bfaf7ca97d (MD5) Previous issue date: 2015-02-10 / CAPES / The muscoid flies have important public health because it acts as a mechanical vector of pathogens (bacteria, viruses, helminth eggs) and cause secondary myiasis in humans and animals. Chemical insecticides have been of great importance in the control of synanthropic flies, but have great persistence and a broad spectrum of action, causing a prolonged impact on the environment. An alternative way to this type of control are secondary metabolites of plants, which are considered the active principle of natural insecticides. This study was divided into two chapters that approached the the theme of natural control. The first chapter is related to the essential oil chemical composition of Cymbopogon citratus collected d in Brazil and Cuba, and evaluation of oil and its major component citral against the post-embryonic development of Musca domestica, Chrysomya putoria, C. megacephala and Lucilia cuprina. The chemical analysis of the essential oils allowed the identification of 13 and 12 chemical components, respectively, and in both the major components were the isomers Neral (35.21% ? Cuba) (36.37% - Brazil) and Geranial (53.2% - Brazil) (51.14% - Cuba) and, Myrcene (6.52%), in a smaller proportion, was only found in Cuban oil. The results show that there were no differences between the activity of Cuban oil and Brazilian. The post-embryonic period of L. cuprina, M. domestica and C. megacephala elongated with the treatment with both oils, but it shortened the larval and neolarva to adult periods for C. putoria. All groups presented morphological alterations. The results of the the test showed that C. megacephala was the most sensitive species killing 73% in larval stage and 77% in newly-hatched larvae to adult and less sensitive was C. putoria with 40% mortality in the larval stage and 57% in newly-hatched larvae to adult. Citral shortened post-embryonic development period (larval, pupal and newly hatched larvae to adult) of M. domestica, L. cuprina and C. megacephala but C. putoria was delayed. In the second chapter, the aim was to analyze the chemical composition and insecticidal effect of the essential oils extracted from leaves of Pinus caribaea Morelet collected in Brazil and Cuba and the terpene Caryophyllene, on the post- embryonic development of the species Musca domestica, Chrysomya megacephala, C. putoria e Lucilia cuprina. Twelve components were identified in the essential oil of P. cariabea collected in Brazil, and ? Phellandrene and Germacren D and (E) Caryophyllene were the major components, with relative areas of 39.57, 26.57 and 16.85% respectively. In comparison, 20 components were identified from the essential oil of the same species originated from Cuba with the major components, Germacrene D (48.25%), o ?-Phellandrene (12.10%) and Caryophyllene Oxide (12.41%). Caryophyllene was more toxic to M. domestica with an 87% of mortality for the newly hatched larvae to adult, the less affected species were L. cuprina and C. megacephala with 83% of mortality and for C. putoria the mortality was 63%. The post-embryonic development period was shortened in the species M. domestica, L. cuprina and C. megacephala and prolonged in C. putoria. The pupal weight was reduced in most species except in C. putoria that it had increased; there was no change in the sex ratio in the species in the study. / Os d?pteros muscoides apresentam import?ncia em sa?de p?blica, pois atua como vetor mec?nico de pat?genos (bact?rias, v?rus, ovos de helmintos), al?m de causar mi?ases secund?rias no homem e nos animais. Os inseticidas qu?micos t?m sido de grande import?ncia no controle de d?pteros sinantr?picos, mas apresentam grande persist?ncia e um amplo espectro de a??o, causando um impacto prolongado ao ambiente. Uma forma alternativa a este tipo de controle s?o os metab?litos secund?rios de plantas, que s?o considerados o princ?pio ativo dos inseticidas naturais. O presente estudo foi dividido em dois cap?tulos que abordam o tema do controle natural. O primeiro cap?tulo foi relativo a analise da composi??o qu?mica do ?leo essencial de Cymbopogon citratus coletado no Brasil e Cuba, e da avalia??o do ?leo e do seu componente majorit?rio citral sob o desenvolvimento p?s-embrion?rio de Musca domestica, Chrysomya putoria, C. megacephala e Lucilia cuprina. A an?lise da composi?ao qu?mica dos ?leos essenciais (Brasil/Cuba), por Cromatografia Gasosa acoplada ao espectr?metro de massa (GC-EM), permitiu a identifica?ao de 13 e 12 componentes principais, respectivamente; nove deles comuns aos dois. Em ambos os ?leos, os principais componentes foram os is?meros geranial e neral, que, juntos, formam o composto citral. Esse corresponde a um total de 97,92%/Brasil e 97,69%/Cuba dos compostos identificados. O monoterpeno mirceno, observado na amostra cubana, apresentou grande abund?ncia relativa (6,52%). Os d?pteros foram submetidos a diferentes concentra??es do ?leo de C. citratus (5, 10, 25, 75 e 100%) (Brasil/Cuba). As subst?ncias foram aplicadas topicamente nas neolarvas (1?L/larva). N?o houve grandes diferen?as entre a atividade do ?leo cubano e brasileiro. As esp?cies L. cuprina, M. domestica, C. megacephala tiveram o seu per?odo p?s-embrion?rio aumentado pelos dois ?leos (Brasil/Cuba), por?m em C. putoria ela apresentou um encurtamento no per?odo larval e no per?odo de neolarva a adulto. Todos os grupos tratados apresentaram deformidades. Os resultados do teste com o monoterpeno Citral mostraram que C. megacephala foi a esp?cie mais sens?vel matando 73% no per?odo larval e 77% no per?odo de neolarva a adulto e a esp?cie menos sens?vel foi C. putoria que apresentou 40% de mortalidade no per?odo larval e 57% no per?odo de neolarva a adulto. O Citral encurtou o per?odo p?s-embrion?rio das esp?cies M. domestica, L. cuprina e C. megacephala, por?m na esp?cie C. putoria ele atrasou. No segundo cap?tulo objetivou analisar a composi??o qu?mica do ?leo essencial de Pinus caribaea coletado no Brasil e Cuba, e avaliar a sua a??o e a do seu componente cariofileno sob o desenvolvimento p?s-embrion?rio analise da composi??o qu?mica do ?leo essencial de Cymbopogon citratus coletado no Brasil e Cuba, e da avalia??o do ?leo e do seu componente majorit?rio citral sob o desenvolvimento p?s-embrion?rio de Musca domestica, Chrysomya putoria, C. megacephala e Lucilia cuprina. Para o ?leo essencial obtido das folhas de P. caribaea coletadas no Brasil foram identificadas 12 subst?ncias qu?micas, sendo o ?-Felandreno (39,57%), Germacreno D (26,57%) e (E) Cariofileno (16,85%) os majorit?rios. A an?lise do ?leo das folhas de P. cariabea provenientes de Cuba resultou na identifica??o de 20 subst?ncias, sendo o Germacreno D (48,25%), ?xido de Cariofileno (12,41%) e ? Felandreno (12,10%) Germacreno D (48,25%) os constituintes majorit?rios. O Cariofileno mostrou ser mais t?xico para M. domestica com uma mortalidade de 87% na fase de neolarva a adulto e as esp?cies menos afetadas foram L. cuprina e C. megacephala com 83% de mortalidade e para C. putoria a mortalidade observada foi de 63%. O per?odo p?s- embrion?rio foi encurtado nas esp?cies M. domestica, L. cuprina e C. megacephala e aumentado em C. putoria. O peso pupal foi reduzido na maioria das esp?cies com exce??o de C. putoria que teve ele aumentado e n?o houve altera??o na propor??o sexual nas esp?cies estudadas.

Rondônia apresenta área com rica diversidade de artrópodes, porém pouco se conhece sobre a transmissão de arbovírus por estas espécies. O presente trabalho visou detectar arbovírus, por meio da RT-PCR e da Duplex RT-PCR, nas espécies de dipteros coletados no Estado, bem como caracterizá-los pela reação de sequenciamento. A RT-PCR e a Duplex RT-PCR detectaram as suspensões dos vírus Mayaro e Oropouche até 104 e 101 TCID50/mL, respectivamente, porém o vírus Dengue 2 em pools contendo menos de três mosquitos infectados foi negativa. O controle endógeno foi detectado em 66,8 % das amostras, sendo que, em pools contendo entre um e três mosquitos, a detecção foi aproximadamente metade da detecção nos pools contendo entre 11 e 15. Em 0,66 % dos pools foi encontrado o vírus Oropouche e em outros 0,66 %, o vírus Cacipacoré. O vírus Oropouche foi detectado em Coquillettidia sp. e Deinocerites sp., enquanto o vírus Cacipacoré foi encontrado em Anopheles sp. e Culex sp. As técnicas possibilitaram a detecção dos arbovírus pesquisados nos pools coletados em Rondônia. / The Rondônia state has an area with rich arthropods diversity although the knowledge about the arboviruses transmition for these species is poor. The present work aimed to detect arboviruses through RT-PRC and RT-PCR Duplex in the diptera species collected in the region as well as their characterization through the sequence reaction. The RT-PRC and RT-PCR Duplex detected the Mayaro and Oropouche virus suspensions until 104 e 101 TCID50/mL respectively, although it was negative for the Dengue 2 virus in pools containing less than three infected mosquitoes. The endogenous control was detected in 66,8 % of samples and from pools containing from one to three mosquitoes the detection rate was approximately half from that obtained from pools with 11 to 15 mosquitoes. Oropouche virus was found in 0,66 % of pools and Cacipacore virus also in 0,66 % of pools. Oropouche virus was detected in Coquillettidia sp. and Deinocerites sp. while Cacipacoré virus was found in Anopheles sp. and Culex sp. The techniques allowed the detection of examined arboviruses in the pools collected from Rondonia.

Call number: LD2668 .T4 1958 Y68

Thesis (MScAgric (Conservation Ecology and Entomology))--Stellenbosch University, 2011 / ENGLISH ABSTRACT: Climate change will alter both temperature and moisture availability in the future and therefore will likely affect vector borne disease prevalence. Organisms faced with changes in weather can respond in a variety of ways and this complicates any predictions and inferences for these organisms with climate change. Cause-and-effect links between climate change, insect vector responses, and changes in risk of disease transmission are poorly established for most vector borne diseases. Tsetse (Diptera, Glossinidae) are important vectors of trypanosome parasites posing a major threat to human health and socio-economic welfare in Africa. Water balance plays an important role in determining activity patterns, energy budgets, survival and population dynamics and, hence, geographic distribution and abundance of insects. Glossina species occupy a wide range of habitats in Africa and are notable for their desiccation resistance in xeric environments. Yet, whether or not the different species, subgroups or ecotype groups differ in susceptibility to changes in weather remain undetermined. The first main focus of my thesis was to test the effects of climate change on water balance traits (water loss rate, body water content and body lipid content) of adult tsetse flies. Four species from xeric and mesic habitats were exposed to a range of temperature (20 – 30 °C) and relative humidity (0 – 99 %) combinations. Water loss rates were significantly affected by measurement treatments, while body water content, body lipid content and mass were less affected and less variable across treatment combinations. The results provide support for mass-independent inter- and intra-specific variation in water loss rate and survival times. Therefore, water balance responses to variation in temperature and relative humidity are complex in Glossina, and this response varies within and among species, sub-groups and ecotypes in terms of magnitude and the direction of effect change. Secondly, I apply a mechanistic distribution model for G. pallidipes to predict potential population responses to climate change. I validate the mechanistic model (NicheMapperTM) results spatially and temporally using two methods. Both tests of the model showed that NicheMapper‟s predicted resting metabolic rate has great potential to capture various aspects of population dynamics and biogeography in G. pallidipes. Furthermore, I simulate the effect of phenotypic plasticity under different climate change scenarios and solve for the basic reproductive number of the trypanosomiasis disease (R0) under a future climate scenario. This integrated thesis provides strong evidence for a general decrease in optimal habitat for G. pallidipes under future climate change scenarios. However, it also provides strong support for a 1.85 fold increase in R0 based on changes in biting frequency as a result of higher predicted metabolic rates in the future. This might suggest that the reduction in optimal habitat could be outweighed by the increase in R0. The results demonstrate that an understanding of the physiological mechanism(s) influencing vectors of disease with climate change can provide insight into forecasting variation in vector abundance and disease risk. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die invloed van klimaatsverandering op die temperatuur en vog beskikbaarheid mag moontlik insek-oordraagbare siektes in the toekoms beïnvloed. Organismes wat verandering in klimaat ervaar kan op verskillende maniere reageer en daarom is voorspelling en afleidings van die reaksies op klimaatsverandering nie eenvoudig nie. Boonop is die verband tussen klimaatsverandering, insek reaksies en veranderinge in die oordragsrisiko van siektes onbekend vir die meeste insekoordraagbare siektes. Tsetse (Diptera: Glossinidae) is belangrike draers van trypanosoom parasiete wat 'n bedreiging inhou vir mensegesondheid en sosio-ekonomiese welsyn in Afrika. Waterbalans speel 'n belangrike rol in die energiebondel samestelling, aktiwiteitspatrone, oorlewing en populasie dinamika van insekte en, dus, die geografiese voorkoms en verspreiding van insekte. Glossina spesies kom in 'n verskeidenheid habitatte in Afrika voor en is bekend daarvoor dat hulle weerstand bied teen uitdroging in droё habitatte. Maar, die mate waartoe die verskillende subgroepe, ekotiepegroepe en spesies kwesbaar is vir klimaatsverandering, is steeds onbekend. Die eerste hooffokus van my tesis was om die uitwerking van klimaatsverandering op waterbalansrelevante uitkomste (tempo van waterverlies, waterinhoud en vetinhoud) van volwasse tsetse vlieё te bestudeer. Vier spesies van droë en klam habitatte is aan verskillende kombinasies van temperatuur (20 – 30 °C) en relatiewe humiditeit (0 – 99 %) blootgestel. Die tempo van waterverlies is betekenisvol deur die verskillende toetskombinasies beïnvloed, terwyl die waterinhoud, vetinhoud en liggaamsmassa tot 'n minder mate beïnvloed is en minder gevarieer het tussen die toetskombinasies. Die resultate toon bewyse vir gewigs-onafhanklike inter- en intraspesie variasie in waterverlies tempo‟s en oorlewingstyd. Die waterbalans uitkomste op variasie in temperatuur en relatiewe humiditeit is dus ingewikkeld in Glossina, en dit varieer binne en tussen spesies, subgroepe en ekotiepe in terme van die graad en rigting van effek verandering. Tweedens pas ek 'n meganistiese verspreidingsmodel toe vir G. pallidipes om die moontlike populasiereaksies met klimaatsverandering te voorspel. Ek toets die antwoorde van die model (NicheMapperTM) oor tyd en skaal op twee verskillende maniere. Beide toetse het aangedui dat die NicheMapper voorspelde rustende metaboliese tempo die verskillende aspekte van G. pallidipes populasie dinamika en biogeografie goed beskryf. Ek simuleer die uitkomste van die fenotipiese veranderbaarheid van G. pallidipes onder „n verskeidenheid klimaatsverandering-uitkomste, en los „n model van die basiese ommekeer van trypanosomiasis (R0) op onder 'n klimatsverandering situasie in die toekoms. Hierdie geïntegreerde tesis toon sterk bewyse dat die optimale habitat van G. pallidipes verminder met klimaatsverandering. Dit toon egter ook bewyse vir 'n 1.85 keer toename in R0 gebasseer op 'n verhoging in die frekwensie van bytgeleenthede weens die hoër voorspelde metaboliese tempo van die vlieë in die toekoms. Laasgenoemde stel voor dat die afname in optimale habitat moontlik deur 'n toename in R0 oorheers sal word. Die resultate demonstreer dat beter begrip van die fisiologiese meganisme(s) wat parasiet-draers beïnvloed verdere insig kan voorsien in die toekomstige voorspelling van draer teenwoordigheid en siekte waarskynlikheid.