Genomic DNA is the template of life - the entity which is characterized by a self-sustaining anatomical development, regulated signaling processes, the ability to reproduce and to respond to stimuli. Through what is classically known as the central dogma, the genome is transcribed into mRNA, which in turn is translated into proteins. The proteins take part in most, if not all, cellular processes, and it is by unraveling these processes that we can begin to understand life and disease-causing mechanisms. In vitro and in vivo assays are two levels at which protein communication may be studied, and which permit manipulation and control over the proteins under investigation. But in order to retrieve a representation of the processes as close to reality as possible, in situ analysis may instead be applied as a complement to the other two levels of study. In situ PLA offers the ability to survey protein activity in tissue samples and primary cell lines, at a single cell level, detecting single targets in their natural unperturbed environment.   In this thesis new developments of the in situ PLA are described, along with a new technique offering in situ enzyme-free detection of proximity between biomolecules. The dynamic range of in situ PLA has now been increased by several orders of magnitude to cover analogous ranges of protein expression; the output signals have been modified to offer a greater signal-to-noise ratio and to limit false-positive-rates while also extending the dynamic range further; simultaneous detection of multiple protein complexes is now possible; proximity-HCR is presented as a robust and inexpensive enzyme-free assay for protein complex detection. The thesis also covers descriptions on how the techniques may be simultaneously applied, also together with other techniques, for the multiple data-point acquisition required by the emerging realm of systems biology. A future perspective is presented for how much more information may be simultaneously acquired from tissue samples to describe biomolecular interactions in a new manner. This will allow new types of biomarkers and drugs to be discovered, and a new holistic understanding of life.

Der stetig anwachsende Bedarf und die innovative Weiterentwicklung im Bereich der Großdieselmotoren als Antrieb für Schiffe und Generatoranlagen erfordert ebenfalls die Weiterentwicklung der Abgasturbolader. Hohe Leistungsfähigkeit und Wirtschaftlichkeit ist nur durch moderne Fertigungsverfahren und einer optimalen Ausnutzung der eingesetzten, hochwertigen Werkstoffe zu erreichen. Dies gilt insbesondere für die integralen Radialturbinenräder in Abgasturboladern, die aufgrund der hohen Betriebsbelastungen einen zentralen Punkt bei der Auslegung darstellen. Lebensdauerbegrenzend ist die hochzyklische Ermüdung aufgrund Resonanzschwingungen an der Beschaufelung der Turbinenräder. Die vorliegende Arbeit soll die Auslegungsmethodik zur Berechnung und Beurteilung der zu erwartenden Schwingbeanspruchungen der Turbinenräder im Hinblick der realen Geometrie verbessern. Dazu wird ein einfaches Berechnungsmodell zur Identifizierung der kritischen Schaufelmoden und Bestimmung der Schwingbeanspruchungen im integralen Turbinenrad erarbeitet. Das Modell wird auf vorhandene Turbinenräder angewendet und aus den Ergebnissen werden Hinweise für eine systematische Beurteilung der Schaufelmoden, Knotendurchmesser und Schaufelgestaltung bezüglich der kritischen Schwingbeanspruchungen angegeben. Desweiteren wird der Einfluss der Verstimmung (engl. Mistuning) des Schwingverhaltens realer, integraler Turbinenräder ausführlich im Hinblick auf die Schwingbeanspruchungen untersucht. Die wesentlichen Ursachen für die Verstimmung sind die innerhalb der Fertigungstoleranzen auftretenden Geometrieabweichungen der Schaufeln. Dabei wird ein Überblick über die typischen Geometrie- und Frequenzabweichungen Radialturbinen gegeben und Auswirkungen auf das Schwingverhalten des Rades wie Lokalisierung der Schwingformen und Amplitudenüberhöhungen ermittelt und in einen systematischen Zusammenhang mit den geometrischen Ursachen, der Komplexität der Schaufelschwingformen und Knotendurchmesser gestellt. Es zeigt sich, dass unter gewissen Voraussetzungen bei Radialturbinen KD0 und KD1 Schwingformen weniger sensibel auf die Verstimmung reagieren. Hieraus können Hinweise für die Verbesserung des Auslegungsprozess abgeleitet werden. Die Kenntnis über das reale Schwingverhalten verstimmter Turbinenräder ermöglicht die korrekte Auswahl geeigneter Schaufeln zur Applikation von Dehnmessstreifen, wodurch eine sichere Beurteilung der Betriebsbeanspruchungen erst möglich wird.

Due to the emergence of new materials and advanced engineering technology, slender footbridges are increasingly becoming popular to satisfy the modern transportation needs and the aesthetical requirements of society. These structures however are always &quotlively" with low stiffness, low mass, low damping and low natural frequencies. As a consequence, they are prone to vibration induced by human activities and can suffer severe vibration serviceability problems, particularly in the lateral direction. This phenomenon has been evidenced by the excessive lateral vibration of many footbridges worldwide such as the Millennium Bridge in London and the T-Bridge in Japan. Unfortunately, present bridge design codes worldwide do not provide sufficient guidelines and information to address such vibrations problems and to ensure safety and serviceability due to the lack of knowledge on the dynamic performance of such slender vibration sensitive bridge structures. A conceptual study has been carried out to comprehensively investigate the dynamic characteristics of slender suspension footbridges under human-induced dynamic loads and a footbridge model in full size with pre-tensioned reverse profiled cables in the vertical and horizontal planes has been proposed for this purpose. A similar physical suspension bridge model was designed and constructed in the laboratory, and experimental testings have been carried out to calibrate the computer simulations. The synchronous excitation induced by walking has been modelled as crowd walking dynamic loads which consist of dynamic vertical force, dynamic lateral force and static vertical force. The dynamic behaviour under synchronous excitation is simulated by resonant vibration at the pacing rate which coincides with a natural frequency of the footbridge structure. Two structural analysis software packages, Microstran and SAP2000 have been employed in the extensive numerical analysis. Research results show that the structural stiffness and vibration properties of suspension footbridges with pre-tensioned reverse profiled cables can be adjusted by choosing different structural parameters such as cable sag, cable section and pretensions in the reverse profiled cables. Slender suspension footbridges always have four main kinds of vibration modes: lateral, torsional, vertical and longitudinal modes. The lateral and torsional modes are often combined together and become two kinds of coupled modes: coupled lateral-torsional modes and coupled torsionallateral modes. Such kind of slender footbridges also have different dynamic performance in the lateral and vertical directions, and damping has only a small effect on the lateral vibration but significant effect on the vertical one. The fundamental coupled lateral-torsional mode and vertical mode are easily excited when crowd walking dynamic loads are distributed on full bridge deck. When the crowd walking dynamic loads are distributed eccentrically on half width of the deck, the fundamental coupled torsional-lateral mode can be excited and large lateral deflection can be induced. Higher order vertical modes and coupled lateral-torsional modes can also be excited by groups of walking pedestrians under certain conditions. It is found that the coupling coefficient introduced in this thesis to describe the coupling of a coupled mode, is an important factor which has significant effect on the lateral dynamic performance of slender suspension footbridges. The coupling coefficient, however, is influenced by many structural parameters such as cable configuration, cable section, cable sag, bridge span and pre-tensions, etc. In general, a large dynamic amplification factor is expected when the fundamental mode of a footbridge structure is the coupled lateral-torsional mode with a small coupling coefficient. The research findings of this thesis are useful in understanding the complex dynamic behaviour of slender and vibration sensitive suspension footbridges under humaninduced dynamic loads. They are also helpful in developing design guidance and techniques to improve the dynamic performance of such slender vibration sensitive footbridges and similar structures and hence to ensure their safety and serviceability.

Ce mémoire de thèse traite du contrôle et de la mise en forme des fronts de phase et d'énergie d'impulsions lasers brèves ultra-intenses. La première partie est consacrée à la conception et la réalisation d'une boucle d'optique adaptative pour la correction des distorsions de surface d'onde sur la chaîne laser de puissance 100 Térawatts du Laboratoire pour l'Utilisation des Lasers Intenses. Cette boucle repose sur l'utilisation d'un dispositif à cristaux liquides comme modulateur de phase et d'un interféromètre à décalage comme senseur de front d'onde. L'association de ces deux dispositifs a permis la construction d'un système innovant de mesure et mise en forme de la surface d'onde d'impulsions lasers ultra-intenses. Il est démontré qu'il permet de corriger une surface d'onde présentant d'importantes distorsions et ainsi améliorer grandement la qualité de focalisation de faisceaux lasers. Cette boucle d'optique adaptative a été testée avec succès sur la chaîne 100 Térawatts et une correction de la surface d'onde de l'ordre de 60% a ainsi pu être démontrée. La seconde partie du mémoire traite de la mise en forme d'une impulsion laser inhomogène brève permettant le pompage du milieu à gain (un plasma) d'un laser à rayons X. L'idée consiste à jouer sur le parallélisme du système de compression d'impulsions utilisé en fin de chaîne 100 Térawatts. Un modèle expliquant la génération d'une impulsion inhomogène laser brève à l'aide de ce compresseur à réseaux de diffraction est développé. Une campagne expérimentale Laser X a notamment permis de valider les prédictions théoriques annoncées par ce modèle et a montré la nécessité d'utiliser une telle impulsion inhomogène afin d'obtenir une émission laser X lorsque le pompage s'effectue par impulsion brève.

Ce mémoire de thèse traite du contrôle et de la mise en forme des fronts de phase et d'énergie d'impulsions lasers brèves ultra-intenses.<br />La première partie est consacrée à la conception et la réalisation d'une boucle d'optique adaptative pour la correction des distorsions de surface d'onde sur la chaîne laser de puissance 100 Térawatts du Laboratoire pour l'Utilisation des Lasers Intenses. Cette boucle repose sur l'utilisation d'un dispositif à cristaux liquides comme modulateur de phase et d'un interféromètre à décalage comme senseur de front d'onde. L'association de ces deux dispositifs a permis la construction d'un système innovant de mesure et mise en forme de la surface d'onde d'impulsions lasers ultra-intenses. Il est démontré qu'il permet de corriger une surface d'onde présentant d'importantes distorsions et ainsi améliorer grandement la qualité de focalisation de faisceaux lasers. Cette boucle d'optique adaptative a été testée avec succès sur la chaîne 100 Térawatts et une correction de la surface d'onde de l'ordre de 60% a ainsi pu être démontrée.<br />La seconde partie du mémoire traite de la mise en forme d'une impulsion laser inhomogène brève permettant le pompage du milieu à gain (un plasma) d'un laser à rayons X. L'idée consiste à jouer sur le parallélisme du système de compression d'impulsions utilisé en fin de chaîne 100 Térawatts. Un modèle expliquant la génération d'une impulsion inhomogène laser brève à l'aide de ce compresseur à réseaux de diffraction est développé. Une campagne expérimentale Laser X a notamment permis de valider les prédictions théoriques annoncées par ce modèle et a montré la nécessité d'utiliser une telle impulsion inhomogène afin d'obtenir une émission laser X lorsque le pompage s'effectue par impulsion brève.

A in uência do caráter inomogêneo da região-fonte na ampli cação da Radiação Quilom étrica das Auroras é investigada. Inicialmente é feita uma revisão de trabalhos relevantes publicados a respeito do mesmo tema geral, tanto os que concernem aos dados observacionais como os que concernem aos modelos teóricos e simulações numéricas. Esta revisão é precedida pelo estabelecimento de conceitos e de nições pertinentes ao tema. São consideradas duas abordagens distintas na determinação da ampli cação da radiação na região-fonte. A primeira considera o plasma localmente homogêneo, enquanto a segunda toma em conta, explicitamente, a contribuição dos gradientes dos parâmetros do plasma. A ampli cação da radiação é determinada pela avaliação do tensor dielétrico do plasma e pela evolução da radia ção através do estudo de traçado de raios. Os parâmetros do plasma são obtidos através de uma formulação autoconsistente que toma em conta uma queda de potencial elétrico ao longo das linhas de campo geomagnético. Utiliza-se um modelo de lâmina auroral em que o campo magnético ambiente é considerado localmente homogêneo. O modelo teórico subjacente adotado é o do maser de elétron-cíclotron. O principal resultado obtido revela uma diminuição na ampli cação nal por um fator em torno de três, quando os gradientes dos parâmetros do plasma são considerados explicitamente. Este resultado pode ter implicações na capacidade do maser de elétron-cíclotron em explicar os níveis de radiação mais elevados observados. / The in uence from source region inhomogeneous character on ampli cation of Auroral Kilometric Radiation is investigated. Firstly, a review over relevant works published about the same general theme is made, concerning about observational data as well theoretical models and numerical simulations. This review is preceded by the establishment of de nitions and concepts related to the theme. Two distinct approaches are considered in determining the ampli cation of radiation across the source region. First approach takes the plasma as locally homogeneous, while second approach account, explicitly, for gradients on plasma parameters. The ampli cation is obtained through evaluation of the dielectric tensor and the evolution of radiation through ray tracing. Plasma parameters are obtained using a self-consistent formulation which account for an electric potential drop along geomagnetic eld lines. An auroral slab model is used where the ambient magnetic eld is taken as locally homogeneous. The subjacent theoretical model adopted is the electron-cyclotron maser. The main result obtained reveals a reduction on nal ampli cation by a factor about three, when plasma parameters gradients are explicitly accounted. This nding may have implications on capability of electron-cyclotron maser for explanation the most intense levels of radiation observed.

Submitted by Maria Medeiros (maria.dilva1@ufcg.edu.br) on 2018-08-29T14:12:32Z No. of bitstreams: 1 DESIANE MAIARA GOMES DOS SANTOS - DISSERTAÇÃO (PPGF) 2015.pdf: 6011160 bytes, checksum: a5021549766593cfe2eb8fe5314ea39b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-29T14:12:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DESIANE MAIARA GOMES DOS SANTOS - DISSERTAÇÃO (PPGF) 2015.pdf: 6011160 bytes, checksum: a5021549766593cfe2eb8fe5314ea39b (MD5) Previous issue date: 2015-04-10 / Capes / Nesta dissertação, analisamos a dinâmica de osciladores parametricamente forçados, com enfoque na amplificação de pequenos sinais. Iniciamos por uma revisão da ressonância paramétrica e da amplificação paramétrica em um oscilador linear parametricamente excitado. Em seguida, estudamos dois tipos de osciladores não-lineares parametricamente forçados e concluímos a dissertação com a análise de um dímero parametricamente excitado. Basicamente, analisamos os fenômenos de ressonância paramétrica e de amplificação paramétrica, comparando os resultados obtidos analiticamente (via métodos da média ou do balanço harmônico) com os obtidos via integração numérica das equações do movimento. Em todos os casos, obtivemos a linha de transição para a instabilidade paramétrica do oscilador paramétrico. Nós excitamos os amplificador paramétrico com e sem dessintonia entre entre o bombeamento e o sinal externo ac. Verificamos que o ganho da amplificação paramétrica depende da sensitivamente na fase do sinal externo ac e na amplitude do bombeamento. Mostramos que tais sistemas podem ser facilmente utilizados para recepção e decodificação de sinais com modulação de fase. Além disso, obtivemos séries temporais, envelopes e transformadas de Fourier para a resposta da amplificação paramétrica de pequenos sinais ac. Especificamente nos casos dos osciladores de Duffing parametricamente forçados, obtivemos e analisamos linhas de bifurcação e a amplitude dos ciclos limites como função da frequência e da amplitude de bombeamento. Adicionalmente, conseguimos obter uma relação analítica para os ganhos do sinal e do idler dos osciladores não-lineares parametricamente forçados pelo método do balanço harmônico. Os resultados obtidos implicam que os amplificadores paramétricos não-lineares podem ser excelentes detectores, especialmente em pontos próximos a bifurcações para instabilidade, em que apresentam altos ganhos e largura de banda bem estreitas. Por último, investigamos também o comportamento de dois osciladores lineares acoplados e parametricamente estimulados, com e sem força externa ac. Tais sistemas são muito sensíveis à fase do sinal a ser amplificado e podem ser utilizados para criar amplificadores sintonizáveis em função do parâmetro de acoplamento. / In this dissertation, we studied the dynamics of parametrically-driven oscillators, with a focus on the amplification of small signals. We begin with a revision of parametric resonance and parametric amplification in a linear oscillator parametrically excited. Next, we studied two types of nonlinear parametrically-driven oscillators and finished the dissertation with an analysis of a parametric dimer. Basically, we analyzed the phenomena of parametric resonance and parametric amplification by comparing the results obtained analytically (via the averaging or harmonic balance methods) with those of numerical integration of the equations of motion. In all cases, we obtained the transition line to parametric instability of the parametric oscillator. We excited the parametric amplifier with and without detuning between the pump and the external signal. We found that the parametric amplification depends sensitively on the phase of the external ac signal and on the internal pump amplitude. We showed that such amplifiers can be easily used for the reception and decoding of signals with phase modulation. Furthermore, we obtained time series, envelopes, and Fourier transforms of the response of the parametric amplifier to small external ac signals. Specifically in the cases of the parametrically-driven Duffing oscillators, we obtained and analysed the bifurcation lines and the amplitude of limit cycles as function of the pump amplitude and frequency. In addition, we derived an expression for the signal and idler gains of the nonlinear parametrically-driven oscillators with the harmonic balance method. The results imply that the nonlinear parametric amplifiers can be excellent detectors, specially near bifurcations to instability, due to their high gains and narrow bandwidths. Finally, we studied the dynamics of two linear oscillators coupled and parametrically excited, with and without external ac driving. We found that such systems have a wealth of dynamical responses. They present parametric amplification that is dependent on the coupling parameter and on the phases of the external ac signals. Such systems may be used as tunable amplifiers.

A in uência do caráter inomogêneo da região-fonte na ampli cação da Radiação Quilom étrica das Auroras é investigada. Inicialmente é feita uma revisão de trabalhos relevantes publicados a respeito do mesmo tema geral, tanto os que concernem aos dados observacionais como os que concernem aos modelos teóricos e simulações numéricas. Esta revisão é precedida pelo estabelecimento de conceitos e de nições pertinentes ao tema. São consideradas duas abordagens distintas na determinação da ampli cação da radiação na região-fonte. A primeira considera o plasma localmente homogêneo, enquanto a segunda toma em conta, explicitamente, a contribuição dos gradientes dos parâmetros do plasma. A ampli cação da radiação é determinada pela avaliação do tensor dielétrico do plasma e pela evolução da radia ção através do estudo de traçado de raios. Os parâmetros do plasma são obtidos através de uma formulação autoconsistente que toma em conta uma queda de potencial elétrico ao longo das linhas de campo geomagnético. Utiliza-se um modelo de lâmina auroral em que o campo magnético ambiente é considerado localmente homogêneo. O modelo teórico subjacente adotado é o do maser de elétron-cíclotron. O principal resultado obtido revela uma diminuição na ampli cação nal por um fator em torno de três, quando os gradientes dos parâmetros do plasma são considerados explicitamente. Este resultado pode ter implicações na capacidade do maser de elétron-cíclotron em explicar os níveis de radiação mais elevados observados. / The in uence from source region inhomogeneous character on ampli cation of Auroral Kilometric Radiation is investigated. Firstly, a review over relevant works published about the same general theme is made, concerning about observational data as well theoretical models and numerical simulations. This review is preceded by the establishment of de nitions and concepts related to the theme. Two distinct approaches are considered in determining the ampli cation of radiation across the source region. First approach takes the plasma as locally homogeneous, while second approach account, explicitly, for gradients on plasma parameters. The ampli cation is obtained through evaluation of the dielectric tensor and the evolution of radiation through ray tracing. Plasma parameters are obtained using a self-consistent formulation which account for an electric potential drop along geomagnetic eld lines. An auroral slab model is used where the ambient magnetic eld is taken as locally homogeneous. The subjacent theoretical model adopted is the electron-cyclotron maser. The main result obtained reveals a reduction on nal ampli cation by a factor about three, when plasma parameters gradients are explicitly accounted. This nding may have implications on capability of electron-cyclotron maser for explanation the most intense levels of radiation observed.

Um Amplificador Paramétrico Óptico (optical parametric amplifier - OPA) é uma fonte de luz coerente, de alta qualidade e sintonizável, baseada em processos ópticos não-lineares de segunda ordem. Alguns modelos possuem largura de banda estreita e um amplo intervalo de sintonia, podendo alcançar regiões que vão desde o ultravioleta até o infravermelho médio. A nossa motivação para construir este amplificador paramétrico óptico é sua utilização em experimentos de espectroscopia vibracional de superfícies através do processo óptico não-linear de segunda ordem, geração de soma de frequências (sum-frequency generation - SFG), que é uma técnica que exige fontes sintonizáveis no infravermelho médio e com altas intensidades de pico e largura de banda estreita. O objetivo desse trabalho foi projetar, montar e testar um amplificador paramétrico óptico capaz de produzir pulsos sintonizáveis de alta energia no infravermelho médio (&lambda; ~ 2,5 a 10 &mu;m) a partir de um laser de bombeio que fornece pulsos de 25 ps, com alta energia em &lambda; = 1064 nm. Para obter-se uma geração de infravermelho bastante eficiente, foi proposto um projeto inovador para amplificadores paramétricos de picossegundos, utilizando-se a geração de supercontínuo de luz branca como feixe sinal do estágio de amplificação paramétrica. O pulso de bombeio (&lambda; = 1064 nm) é dividido em duas partes: a primeira, de menor energia, é utilizada para gerar um pulso de alta largura espectral no infravermelho próximo (supercontínuo de luz branca de picossegundos). Uma fração espectral desse pulso é selecionada através de um monocromador e utilizada como semente do estágio de amplificação paramétrica. O cristal amplificador paramétrico (sulfeto de prata e gálio, AgGaS2) é então bombeado pelo restante do pulso de bombeio e simultaneamente amplifica a semente sintonizável no infravermelho próximo e gera um novo pulso de frequência complementar no infravermelho médio. Foram testados vários meios para geração de supercontínuo, mas os melhores resultados foram obtidos em uma cubeta de 10 cm de comprimento com uma mistura de água e água deuterada (3 % em volume de H2O em D2O) e em uma fibra fotônica não-linear com 2 m de comprimento. Usando o supercontínuo como feixe semente, observou-se amplificação paramétrica no caso do feixe gerado na fibra fotônica com um ganho de 260 vezes, mas não com o feixe gerado na mistura de água/água deuterada, presumivelmente pela maior instabilidade desse supercontínuo. / An Optical Parametric Amplifier (OPA) is a tunable light source of high quality, coherent radiation, based on second-order nonlinear optical processes. Some models have a narrow spectral bandwidth and a tuning range from the ultraviolet to the mid-infrared. The motivation for building this optical parametric amplifier is its use in vibrational spectroscopy of surfaces by a second-order nonlinear optical process, sum-frequency generation (SFG), which is a technique that requires tunable sources in the mid-infrared with narrow bandwidth and high peak intensities. The purpose of this work is to design, implement and test an OPA to generate tunable high energy pulses tuneable in the mid-infrared (&lambda; ~ 2.5 to 10 &mu;m) from a pumping laser that provides 25 ps pulses with high energy at &lambda; = 1064 nm. For an efficient mid-infrared generation, we propose an innovative design for picosecond parametric amplifiers, using the near infrared portion of a white-light supercontinuum pulse as the seed beam for the parametric amplifier. The pump pulse (&lambda; = 1064 nm) is divided into two parts: the first one, with lower energy, generates a high spectral width pulse in the near infrared (white-light supercontinuum picosecond pulse). A spectral fraction of this pulse is selected through a monochromator and is used as seed for the parametric amplification stage. The second part of the laser beam pumps the parametric amplifier crystal (silver gallium sulfide, AgGaS2) which simultaneously amplifies the tunable seed beam in the near infrared and generates a new pulse with complementary frequency in the mid-infrared. Several media were tested for supercontinuum generation, but the best results were obtained with a 10 cm long cuvette with a mixture of water and deuterated water (3 % volume of H2O in D2O) and with a 2 m long nonlinear photonic crystal fiber. Using the supercontinuum as a seed beam, we have obtained parametric amplification of the seed generated by the photonic fiber with a gain of 260 times, but not of the beam generated by the water mixture, presumably because of its significantly higher instability.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2018-08-01T17:33:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maythsulene Inácio de Sousa Oliveira - 2015.pdf: 3135445 bytes, checksum: a08e11c7f2df635f3ff7726cfde58f49 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-08-02T11:09:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maythsulene Inácio de Sousa Oliveira - 2015.pdf: 3135445 bytes, checksum: a08e11c7f2df635f3ff7726cfde58f49 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-02T11:09:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maythsulene Inácio de Sousa Oliveira - 2015.pdf: 3135445 bytes, checksum: a08e11c7f2df635f3ff7726cfde58f49 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-04-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Common bean (Phaseolus vulgaris L.) is grown in Brazil in three different cropping seasons, and in diverse agroecosystems. In such different environments, the crop is exposed to several constraints responsible for yield losses, such as pathogenic organisms. Among common bean relevant diseases, fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli), dry root-rot (Fusarium solani) and Curtobacterium wilt (Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens) have similar symptoms, hindering diagnosis in the field, and whose identification in seed health testing is also limited. In both cases, identification at species level is an important step to manage this root pathogen complex, whose detection can be improved by molecular biology tools. Therefore, this study aimed to: 1) to develop and validate a multiplex PCR (m-PCR) method for simultaneous identification of three common bean pathogens, F. oxysporum f. sp. phaseoli, F. solani and C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens; and 2) develop an isothermal amplification of DNA (LAMP) method to detect of F. oxysporum f. sp. phaseoli on seeds. M-PCR method was developed for identification of isolated colonies, as well as infected seeds. In seeds, total DNA was obtained by alkaline lysis method, which inactivates nucleases during the extraction process. M-PCR allowed the identification of all pathogens, with detection of C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, F. oxysporum f. sp. phaseoli and F. solani amplicons in agarose gel with respectively 306, 609 and 143 base pairs. Furthermore, m-PCR also reduced costs and time to detect Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli from 10 days to three hours. It was not possible to develop an optimized protocol for detection of F. oxysporum f. sp. phaseoli by the LAMP method, using only the tf1 gene for design of primers, since such primers were functional only for amplifying large amounts of target DNA. Based on the negative results with LAMP, it is suggested that further studies should be performed using other DNA sequences available in GenBank database. / O feijoeiro-comum (Phaseolus vulgaris L.) é cultivado durante todo o ano no território brasileiro, em três épocas distintas e em vários agroecosistemas. Nestes ambientes distintos, a cultura está exposta a diversos fatores que causam perdas de rendimento, como o ataque de patógenos. Dentre as doenças do feijoeiro-comum encontram-se a murcha-de-fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli), a podridão-radicular-seca (Fusarium solani) e a murcha-de-curtobacterium (Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens) que apresentam sintomas semelhantes, dificultando seu diagnóstico no campo, e cuja identificação em testes de sanidade de sementes também é limitada. Em ambos os casos, a identificação em nível de espécie é uma importante etapa do manejo deste complexo de patógenos, cuja detecção pode ser aperfeiçoada com a adoção de ferramentas de biologia molecular. Portanto, este estudo teve como objetivos: 1) Desenvolver e validar um método de multiplex PCR (m-PCR) para identificação simultânea de três espécies de patógenos do feijoeiro-comum, F. oxysporum f. sp. phaseoli, F. solani e C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens; e 2) desenvolver a técnica de amplificação isotérmica de DNA (LAMP) para detecção de F. oxysporum f. sp. phaseoli em sementes. O método de m-PCR foi desenvolvido para identificação de colônias isoladas bem como sementes infectadas. Nas sementes, o DNA total foi obtido pela lise alcalina, método que inativa nucleases durante o processo de extração. A m-PCR possibilitou a identificação de todos os patógenos, com detecção de C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens, F. oxysporum f. sp. phaseoli e F. solani em bandas formadas em gel de agarose respectivamente com 306, 609 e 143 pares de base. Além disso, a extração do DNA total das sementes pela lise alcalina em combinação com a m-PCR também possibilitou redução de custos e tempo de realização do diagnóstico de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, de 10 dias para três horas. Não foi possível estabelecer um protocolo otimizado para detecção de F. oxysporum f. sp. phaseoli pelo método LAMP, utilizando somente o gene tf1 para desenho dos iniciadores, uma vez que, os iniciadores revelaram-se funcionais apenas para a amplificação com grandes quantidades de DNA alvo. Diante dos resultados obtidos com LAMP, sugere-se que estudos posteriores sejam realizados empregando outras sequências de DNA disponíveis no banco de dados GenBank.