A determinação de valores de referência de alguns xenobióticos naturalmente existentes no organismo é importante na biomonitorização, para comparação de níveis encontrados na população exposta com os da população de referência. A acetona é um solvente muito popular, utilizado em vários ramos da indústria e em laboratórios químicos. O isopropanol é um solvente largamente utilizado em indústrias, laboratórios e está presente em vários produtos domésticos. Este solvente é biotransformado no organismo humano, tendo como principal metabólito a acetona. A acetona em urina (AcU) é o bioindicador mais usado para avaliar a exposição de trabalhadores expostos a acetona e ao isopropanol. Como também é encontrada em pessoas não expostas ocupacionalmente a estes solventes, o objetivo deste trabalho foi verificar os níveis basais de AcU e a possível influência de fatores individuais nestes níveis. A população de referência foi constituída por 207 indivíduos (91 homens e 116 mulheres, com idades entre 18 e 80 anos). A AcU foi determinada por headspace/cromatografia em fase gasosa/DIC. O método mostrou linearidade de 0,1 a 5,0 mg/L; o limite de detecção e de quantificação de 0,1 mglL; precisão intra-ensaio, entre 4 e 5% e inter ensaio, entre 5,2 e 8,8% (urina sem adição e fortificada com 1,0 e 3,0 mgIL de acetona). Para a população total, os valores de referência encontrados foram: média (&#177;DP) de 1,12 (&#177;0,47) mgIL; mediana de 1,04 mgIL; média geométrica de 1,03 mglL; intervalo de confiança 95% entre 0,98-1,26 mglL e valor superior de referência (média + 2DP) de 2,06 mgIL. Devido ao fato da distribuição dos valores de AcU (mgIL) não ser Gaussiana, optou-se por uma transformação dos valores (Iog AcU) que aproximou os dados da distribuição normal ( W = 0,98532, P < 0,7000). A população selecionada demonstrou ser saudável e adequada ao estudo; o sexo e a ingestão de bebidas alcoólicas parecem afetar os teores de acetona urinária, enquanto a idade e o uso de tabaco não mostraram este efeito. / The determination of reference values of some xenobiotics is important for the biomonitoring, to compare the concentration in the exposed and the general population. The acetone is a very popular solvent, that is used in a large number of industries and laboratories. Isopropanol is used in industries, laboratories and cosmetic products. In the human body, this solvent is metabolized and the most important product is acetone. Acetone in urine (AcU) is the most used biomarker to monitore workers exposed to acetone/isopropanol. This substance is also found in non-exposed people, so, the main objective of this work was to verify the basal levels of AcU and if there are some factors that have influence on these levels. 207 volunteers were studied (91 men and 116 women, and the ages between 18-80 years). The AcU was determinated by headspace/gas chromatography/ FID. The method showed linearity between 0.1-5.0 mg/L; limit of detection (LOD) and limit of quantification of 0.1 mglL; intra-assay precision, between 4 and 5%; inter-assay precision, between 5.2 and 8.8% (urine without addition, and spiked 1.0 and 3.0 mg/L of acetone). In the total population, the reference values obtained were: mean (&#177;SD) 1.12 (&#177; 0.47) mg/L; median 1.04 mg/L; geometric mean 1.03 mg/L; 95% confidence range between 0.98-1.26 mg/L and upper reference value (mean + 2 SD) of 2.06 mg/L. The values distribution wasn\'t \"normal\", therefore, the ,transformation of the values was necessary (109 AcU). Sex and alcohol intake showed significant influence on the concentration of acetone in urine. No interference was verified for smoking or the age of the volunteers.

Foram desenvolvidos métodos de determinação de urina e trítio em urina. Para o urânio foi adaptada a técnica de análise por fluorimetria em meio sólido. O limite de sensibilidade foi de 5. 10-4&#181;g U/0,1 ml e o erro foi de cerca de 10% para concentrações em torno de 0,05 &#181;g U/0,1 ml. Foi padronizado para o trítio o método de análise por cintilação em meio líquido. O método determina quantidades de trítio até pelo menos 8,10-3&#181;Ci/ml e o erro foi de cerca de 4% para concentrações de trítio em torno de 0,34 &#181;Ci/l. Depois de adaptadas, as técnicas foram aplicadas a amostras de urinas de trabalhadores expostos a compostos de urânio ou trítio com a finalidade de verificar possível contaminação interna por estes radioisótopos. / Abstract not available.

A degradação de antibiótico tetraciclina (TeC) foi avaliada por vários processos a saber, eletroquímico, eletroquímico foto-assistido, Fenton e foto-Fenton. Uma vez que este tipo de antibiótico é excretado principalmente pelo sistema urinário, o meio selecionado foi uma mistura de sais predominantes na composição de urina, a qual apresenta alta concentração de diferentes íons, especialmente íons cloretos. As degradações eletroquímica e eletroquímica foto-assistida foram realizadas em uma célula de fluxo do tipo filtro-prensa, usando um ânodo dimensionalmente estável comercial com composição nominal Ti/Ru0,3Ti0,7O2. O decaimento da concentração do TeC foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e a remoção da carga orgânica por análise de carbono orgânico total (COT). Os processos de degradação eletroquímica e eletroquímica foto-assistido utilizaram densidades de correntes de 20 a 40 mA cm-2 e concentração inicial de TeC de 200 mg L-1. Aplicando 30 mA cm-2, após duas horas a remoção de TeC foi de 91% e 98%, utilizando processo eletroquímico sem e com foto- assistência, respectivamente. A remoção de COT foi incompleta com um máximo de 17%. A fim de comparar o efeito da mistura salina sobre a degradação de TeC, as eletrólises também foram realizadas em NaCl 0,1 mol L-1, onde foi obtida degradação rápida e completa (100%) em ambos os processos, a remoção de COT também foi melhorada (~29%). A degradação de TeC obedeceu uma cinética de pseudo-primeira ordem. A degradação também foi avaliada utilizando os processos Fenton e foto-Fenton na mesma mistura salina variando a concentração inicial de H2O2 (50-150 mg L-1) e de Fe2+ (2,5-15 mg L-1). A concentração inicial de Fe2+ e H2O2 tem uma influência maior sobre a degradação durante ambos os processos. Durante o processo Fenton, sob condições otimizadas, a TeC foi degradada >96%, sendo 57% a redução de COT correspondente, enquanto em meio de NaCl ocorreu a remoção de 99% e redução de COT de 41%. Um ligeiro decaimento foi observado utilizando o processo foto-Fenton devido à influência de íons presentes no meio. Os intermediários de degradação também foram identificados por CLAE acoplado a espectrometria de massa durante os processos Fenton e foto-Fenton, sendo então proposta uma sequência reacional de degradação da TeC . / The degradation of antibiotics tetracycline (TeC) was evaluated by various processes such as electrochemical, photo-assisted electrochemical, Fenton and photo-Fenton. Since this type of antibiotic is excreted mainly by urinary system, the selected medium was a mixture of salts prevailing in composition of urine, which has high concentration of different ions, especially chloride ions. The electrochemical and photo-assisted electrochemical degradations were performed in a filter press type flow cell using a dimensionally stable anode with nominal composition of Ti/Ru0.3Ti0.7O2. The decrease in TeC concentration was analyzed by high performance liquid chromatography and total organic carbon analysis. The electrochemical and photo-assisted electrochemical degradation was performed at current densities of 20 to 40 mA cm-2 and initial TeC concentration of 200 mg L-1. At a current density of 30 mA cm-2,91% and 98% TeC was removed after 2 hours, during electrochemical and photo-assisted electrochemical processes respectively. The TOC removal was incomplete with maximum of 17%. In order to compare the TeC degradation in saline medium, electrolysis was also carried out in 0.1 mol L-1 NaCl, where fast and complete (100%) degradation was observed in both processes and TOC removal was also improved (~29 %). The degradation of TeC followed pseudo-first order kinetics. Fenton and Photo-Fenton process was also evaluated for the degradation of TeC in similar saline medium varying the initial concentration of H2O2 (50_150 mg L-1) and Fe2+ (2.5-15 mg L-1). The initial concentration of Fe2+ and H2O2 has a high influence upon TeC degradation during both processes. During Fenton process under optimized conditions, >96% of TeC was degraded and 57% TOC was removed. However in NaCl medium, 99% degradation 41% TOC was obtained. The degradation was slightly decreased during photo-Fenton process due to the influence of ions in the medium. The degradation Intermediates were also identified by HPLC coupled with mass spectrometer and proposed a reaction sequence for the degradation of TeC.

In order to supply the world-wilde demand for food, it is essential to use the pesticides to protect the crops against pests and diseases. But the indiscriminate and injudicious use of these compounds have resulted in widespread contamination in food commodities and environment in all fields, increasing, this way, the preoccupation with chemical products use. Ethylene-bis-dithiocarbamate pesticides, from dithiocarbamate class, are among the most widely used fungicide to control pest. Beside their low toxicity, one of they degradation products, ethylenethiourea, is a toxic metabolite, which have teratogenic, carcinogenic, immunotoxic and mutagenic effects. In the present work, it was developed and validated a chromatographic method for the determination of ethylenethiourea (ETU) residues in urine, using liquid-liquid extraction and HPLC quantification. The developed procedure consist of the interested compound extraction from urine, with 6.0 mL of dichloromethane, aditioning MgSO4 to help in the partitioning process, that is, distribution os compound between organic and aqueous phase. After sample centrifugation, a supernatant aliquot was taken and evaporated, in water bath at 44 ºC, and the final extract was redissolved in purified water and analyzed by HPLC-UV, injecting 50 μL in C18 column with mobile phase MeOH:H2O (10:90; v/v) and detection by UV light absorption at 233 nm. To the validation study of the method, the following parameters were evaluated: detection limit (LOD), quantification limit (LOQ), precision (under repeatability and reproducibility conditions) and accuracy as recovery. The method LOD was 0.05 mg ETU L-1 and LOQ was 0.2 mg ETU L-1. The analytical curve was linear between 0.05 to 1.0 mg ETU L-1 with determination coefficient r2 > 0.998. Very good precision with RSD between 1.7 and 2.7% was obtained and the recoveries ranged from 85.6 to 95.4% for 3 different spike level: 0,05, 0,1 and 0,5 mg ETU L-1 . The results obtained in the validation step allow us to conclude that the method are quite appropriate to determine residue of ethylenethiourea in urine. The developed method has shown advantages, such as simplicity, quickness and that it could be applied in any laboratory. However, there are some points such as no ETU confirmation nether purity analysis of the chromatographic picks besides the low sensitivity and selectivity of the UV detection that would be much improved using a LC-MS/MS. / Para atender a demanda mundial por alimentos, é essencial o emprego de pesticidas para proteger as culturas contra doenças e pragas, mas o uso imprudente e indiscriminado destes compostos pode resultar em contaminação dos alimentos e seus derivados, bem como no ambiente como um todo, aumentando, dessa forma, a preocupação em relação ao emprego dos pesticidas. Os pesticidas etileno-bisditiocarbamatos, da classe dos ditiocarbamatos, estão entre os fungicidas mais empregados em todo o mundo para o controle de pragas. Apesar de possuírem baixa toxicidade, um de seus produtos de degradação, a etilenotiouréia (ETU), é um metabólito tóxico, a qual possui efeitos teratogênicos, carcinogênicos, imunotóxicos e mutagênicos. Neste trabalho, desenvolveu-se e validou-se um método cromatográfico para a determinação dos resíduos de ETU em urina, empregando-se extração líquidolíquido e quantificação por HPLC-UV. O procedimento desenvolvido consiste na extração do analito de interesse, com 6 mL de diclorometano, adicionando-se MgSO4 para auxiliar no processo de partição, ou seja, distribuição do composto entre as fases orgânica e aquosa. Posteriormente, centrifugou-se e evaporou-se uma alíquota do sobrenadante em banho de água à 44 ºC, redissolvendo-se em água purificada e analisa-se em sistema HPLC, injetando-se 50 μL em coluna C18 com fase móvel MeOH:H2O (10:90; v/v) e detecção por absorção de luz em 233 nm. Para a validação do método avaliaram-se os seguintes parâmetros: limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), linearidade, precisão (repetitividade e precisão intermediária) e exatidão (recuperação). O LOD do método foi de 0,05 mg ETU L-1 e o LOQ 0,2 mg ETU L-1. As curvas analíticas apresentaram r2 > 0,998 com linearidade entre 0,05 e 1,0 mg ETU L-1. Os resultados de precisão foram excelentes, com valores de desvio padrão relativo entre 1,7 e 2,7%, e as recuperações foram de 85,6 a 95,4% para 3 níveis de fortificação: 0,05, 0,1 e 0,5 mg ETU L-1. Através dos resultados obtidos na validação, pode-se concluir que o método é apropriado para determinar resíduos de etilenotiouréia em urina. O método tem várias vantagens como: simplicidade, rapidez, e poder ser executado com equipamentos geralmente disponíveis nos laboratórios. Entretanto, poderia apresentar resultados ainda melhores em termos de sensibilidade, seletividade e confirmação da identidade da ETU, se fosse possível, por exemplo, a utilização de cromatógrafo à líquido acoplado à espectrômetro de massas, onde a pureza dos picos cromatográficos poderia ser avaliada e a detectabilidade poderia ser 3 ordens de magnitude menor (1000 vezes).

Extracellular vesicles (exosomes) are the subject of current nephrology proteomics research as they are considered as a promising source of potential biomarkers of kidney disease. This work is focused on discovery of the most appropriate procedure for the urinary exosomes isolation. We have compared already described methods, based on different physicochemical principles of isolation: hydrostatic filtration dialysis (HFD), differential ultracentrifugation, ultrafiltration through a 100 kDa filter, or sample precipitation with Total Exosome Isolation (from urine) kit. Characterization of individual isolated exosomal fractions was performed using SDS-PAGE method (presence of contaminating proteins), western blot analysis (detection of exosomal markers TSG101, alix), nanoparticle tracking analysis (NTA, vesicle size and concentration) or transmission electron microscopy (TEM, vesicles morphology). Due to the presence of contaminating proteins in urine samples, which could distort the results of subsequent proteomic assays, the conditions for the cleavage of undesirable proteins by proteinase K prior to their own isolation were optimized. It has been found that the best yield and purity of the isolated exosomal fractions were provided by a process combining HFD with differential ultracentrifugation...

OBJECTIVE: To measure urinary triclosan levels and their variability across pregnancy, and to identify sources of triclosan exposure among Canadian pregnant women. METHODS: Single spot and serial urine samples, as well as consumer product use information were collected across pregnancy and post-partum from 80 healthy pregnant women in Ottawa. Analyses included descriptives, linear mixed effects and parametric trend modeling, and surrogate category analysis. RESULTS: Triclosan was detected in 87% of maternal urine samples (LOD=3.0 µg/L). Triclosan concentrations varied by time of day of urine collection (p=0.0006), season of sampling (p=0.019), and parity (p=0.038). Triclosan was included in 4% of all personal care products used by participants; 89% of these triclosan products were varying brands of toothpaste and hand soaps. CONCLUSION: This study provided the first data on temporal variability urinary triclosan levels, and on source attribution data in Canadian pregnant women. Results will assist with population-specific exposure assessment strategies.

Este estudo comparou a ingestão de flúor (F) através da dieta e do dentifrício bem como a excreção urinária de F de 24 horas de crianças recebendo diferentes fontes de F sistêmico: água artificialmente fluoretada (A-Bauru, SP-Brasil, 0,6-0,8 mgF/L, água naturalmente fluoretada (B-Brejo dos Santos, PB-Brasil, 0,6-0,9 mgF/L), sal fluoretado (C-Lima, Peru, 180-200 mgF/Kg) e leite fluoretado (D-Trujillo, Peru, 250 mL de leite contendo 1,0 mgF/L). Crianças de 4-6 anos (n=21-26) participaram em cada comunidade. Uma comunidade com água não fluoretada (<0,1 mgF/L) (E-Pirajuí, SP-Brasil) foi incluída como controle (n=24). A quantidade de F ingerida através da dieta foi determinada pela \"dieta duplicada\", considerando seus diferentes constituintes (água, outros líquidos e sólidos). A ingestão de F através do dentifrício foi determinada pela escovação simulada. A excreção urinária de F de 24 h e a concentração de F das unhas das mãos e dos pés também foram avaliadas. O F foi analisado por eletrodo, depois de difusão facilitada por hexametildiloxano ou após tamponameno com TISAB. A análise estatística foi feita pelos teste de Kruskall-Wallis, Dunn e regressão linear (p<0,05). A média (±DP) da ingestão total de F (mg/Kg peso corporal/ dia) foi 0,065±0,030a,, 0,084±0,029a, 0,088±0044a,, 0,088±0,052a e 0,027±0,022b para A, B, C, D e E, respectivamente. Considerando somente a dieta, a média foi de 0,042±0,012b, 0,058±0,016a,b, 0,048±0,023a,b, 0,059±0,012a e 0,007±0,004c, respectivamente. A maior contribuição através da dieta para A/B e C/D/E foram a água e os sólidos, respectivamente. A média da quantidade F ingerida através do dentifrício variou entre 0,020 (E) e 0,040 (C) mg/Kg peso corporal/ dia e não foi significativamente diferente entre as comunidades. A média (±DP) da excreção urinária de F (mg) de 24 horas foi 0,693±0,198a, 0,625±0,297a,b, 0,808±0,305a, 0,666±0,194a e 0,478±0,321b para A, B, C, D e E, respectivamente. Houve uma correlação significativa entre a excreção urinária de F e a ingestão de F através da dieta (r=0,355, p<0,0001) e ingestão total (dieta mais dentifrício) e excreção urinária (r=0,278, p=0,002). Houve uma correlação significativa entre a excreção urinária de F e concentração de F nas unhas das mãos (r=0,237, p=0,010) e dos pés (r=0,221, p=0,016) e uma forte correlação entre as concentrações de F nas unhas das mãos e dos pés (r=0,730, p<0,0001). Os resultados indicam que a ingestão total de F de crianças deve ser determinada antes que um método de fluoretação sistêmica seja implementado. / This study compared the fluoride (F) intake from diet and dentifrice, as well as 24-hour urinary F excretion of children receiving systemic F from different sources: artificially fluoridated water (A-Brazil, 0.6-0.8 mgF/L), naturally fluoridated water (B-Brazil, 0.6-0.9 mgF/L), fluoridated salt (C-Peru, 180-200 mgF/Kg) and fluoridated milk (D-Peru, 250 mL of milk containing 1.0 mgF/L). Children (n=21-26) aged 4-6 years old participated in each community. A non-fluoridated (<0.1 mgF/L) Brazilian community (E) was evaluated as control (n=24). Children had their F intake from diet monitored by the \"duplicate plate\" method, considering its different constituents (water, other liquids and solids). F ingested from dentifrice was determined by simulated toothbrushings. Twenty-four hour urinary F excretion was also evaluated. F was analyzed with the electrode, after hexamethyldisiloxane-facilitated diffusion or after buffering with TISAB. Data were tested by Kruskall-Wallis and Dunn´s post hoc tests and linear regression (p<0.05). Mean (±SD) total F intake (mg/Kg b.w./day) was 0.065±0.030a, 0.084±0.029a, 0.088±0.044a, 0.088±0.052a and 0.027±0.022b for A, B, C, D and E, respectively. Considering diet only, it was 0.042±0.012b, 0.058±0.016a,b, 0.048±0.023a,b, 0.059±0.012a and 0.007±0.004c, respectively. The main dietary contributors for A/B and C/D/E were water and solids, respectively. Mean F intake from dentifrice ranged between 0.020 (E) and 0.040 (C) mg/Kg b.w./day and was not significantly different among the communities. Mean (±SD) 24-h urinary F excretion (mg) was 0.693±0.198a, 0.625±0.297a,b, 0.808±0.305a, 0.666±0.194a and 0.478±0.321b for A, B, C, D and E, respectively. There was a significant correlation between daily F intake from diet and urinary F excretion (r=0.355, p<0.0001) and total intake (diet and dentifrice) and urinary F excretion (r=0.278, p=0.002). There was a significant correlation between urinary F excretion and fluoride concentration in fingernails (r=0.237, p=0.010) and toenails (r=0.221, p=0.016) and a strong correlation between F concentration from fingernails and toenails (r=0.730, p<0.0001). The results indicate that the total F intake of children must be taken into account before a systemic method of fluoridation is implemented.

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abstract: Antibiotic resistance is a very important issue that threatens mankind. As bacteria are becoming resistant to multiple antibiotics, many common antibiotics will soon become ineective. The ineciency of current methods for diagnostics is an important cause of antibiotic resistance, since due to their relative slowness, treatment plans are often based on physician's experience rather than on test results, having a high chance of being inaccurate or not optimal. This leads to a need of faster, pointof- care (POC) methods, which can provide results in a few hours. Motivated by recent advances on computer vision methods, three projects have been developed for bacteria identication and antibiotic susceptibility tests (AST), with the goal of speeding up the diagnostics process. The rst two projects focus on obtaining features from optical microscopy such as bacteria shape and motion patterns to distinguish active and inactive cells. The results show their potential as novel methods for AST, being able to obtain results within a window of 30 min to 3 hours, a much faster time frame than the gold standard approach based on cell culture, which takes at least half a day to be completed. The last project focus on the identication task, combining large volume light scattering microscopy (LVM) and deep learning to distinguish bacteria from urine particles. The developed setup is suitable for pointof- care applications, as a large volume can be viewed at a time, avoiding the need for cell culturing or enrichment. This is a signicant gain compared to cell culturing methods. The accuracy performance of the deep learning system is higher than chance and outperforms a traditional machine learning system by up to 20%. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Electrical Engineering 2020

Neste trabalho, um eletrodo compósito à base de grafite e poliuretana (EGPU) 60% (grafite, m/m) foi avaliado quanto ao seu potencial para determinação dos antibióticos da família das tetraciclinas em amostras de água natural, de urina bovina e humana, e em amostras de leite bovino e humano. Visando desenvolver métodos simples, de baixo custo e com baixa geração de resíduos, o eletrodo foi usado sem modificação, para atender a estes propósitos e considerando os níveis de concentração das tetraciclinas nas amostras biológicas. A otimização dos parâmetros em voltametria de pulso diferencial (DPV) foi realizada para a determinação dos antibióticos tetraciclina (TC), oxitetraciclina (OTC) e clortetraciclina (CTC) em tampão fosfato 0,10 mol L-1 pH 2,3, permitindo atingir limites de detecção de 2,6 &micro;mol L-1, 1,7 &micro;mol L-1 e 0,82 &micro;mol L-1, respectivamente, sem a necessidade de renovação da superfície, entre as medidas sucessivas. Durante as determinações de TC e OTC em amostras de água natural e purificada, foram observadas recuperações entre 92,6% e 100%, após etapa de pré-concentração. As amostras de urina foram acidificadas, em seguida centrifugadas para a remoção de partículas sólidas e proteínas. A TC e OTC foram determinadas diretamente, na amostra de urina tratada e diluída em tampão fosfato 0,10 mol L-1 pH 2,3. Durante a determinação de TC e OTC nas amostras de urina, após o preparo da amostra, foram obtidas recuperações entre 96% e 100%. As amostras de leite bovino e humano foram intencionalmente contaminadas com TC. Após preparo das amostras, estas foram submetidas à extração, usando cartucho para extração em fase sólida (SPE). Após eluição e retomada do analito retido no cartucho, a quantidade de TC presente nas amostras foi determinada pelo método de adição de padrão, usando DPV, com EGPU 60% (grafite, m/m). Foram obtidas recuperações entre 76% e 103% para as amostras de leite bovino e recuperações entre 91% e 100 % para as amostras de leite humano, que mostram que o eletrodo proposto pode ser usado neste tipo de determinação com as características postuladas acima. / A bare graphite-polyurethane composite electrode 60% (graphite, m/m) (GPUE) was evaluated in the determination of tetracycline (TC) class antibiotics in natural water as well as, in human and bovine urine and in milk samples. Thus, a DPV procedure was optimized for the determination of tetracycline, oxytetracycline (OTC) and chlortetracycline (CTC) antibiotics in phosphate buffer 0.10 mol L-1 pH 2.3, resulting in LOD of 2.6 &micro;mol L-1, 1.7 &micro;mol L-1 and 0.82 &micro;mol L-1, respectively. During the determination of TC and OTC in the water samples, recoveries between 92.6 and 100% were found, after pre-concentration stage. The urine samples were submitted to acidification followed by centrifugation to remove solids and proteins. During the determination of TC and OTC in urine samples, after pre-treatment of urine, recoveries between 96 and 100% were found. The composite electrode was also evaluated in the determination of TC in the bovine and human milk samples. During the determination of TC in milk, recoveries between 76 and 103% were found for bovine milk and recoveries between 91 and 100% were found for human milk after pre-concentration stage, showing the feasibility of the procedure.