Abstract The embryonic urogenital system generates the metanephric kidneys, the gonads and the adrenal glands, and its development is based on sequential and reciprocal cell and tissue interactions. The mechanisms which regulate urogenital ontogeny are still poorly understood. In this thesis, the roles of Wnt-4 and ErbB4 functions in gonad and kidney development were analysed by using in vivo functional genomic technologies. Wnt-4 is crucial in female development since its absence leads to a partial female to male sex reversal. We found that Wnt-4 mediated the interactions between the somatic and the germ cells and played a role in meiosis which is regulated in part by the secreted signal retinoic acid (RA). Expression of certain meiosis-controlling genes (Stra8, Spo11) was inhibited in the Wnt-4 deficient germ cells, while certain pluripotency genes (Oct4, Fgf9, Sox2 and Dnmt3l) were activated similarly as in the wild-type male gonad. In addition to this, we noted that a gene encoding for a Cyp26b1 enzyme, which degrades RA in the embryonic testis, was ectopically expressed in the Wnt-4 deficient ovary. Microarray analysis was used to identify candidate Wnt-4 target genes by using the Wnt-4 knock-out mouse. Of these genes, Runx-1 may represent a novel signalling target to mediate Wnt-4 activity in the control female development The role of receptor-tyrosine kinase ErbB4 in kidney development was studied by using both in vivo gain and loss of function approaches. In the gain-of-function situation, we found that certain markers for the epithelial tubules and collecting ducts lost their polarized expression pattern. At the same time, the orientation of the cells in the kidney tubules was deregulated and an increase in cell proliferation was noticed. We suggest that the observed defects gave rise to an increase in the tubule diameter and to cyst formation in the kidney cortex. In the loss-of-function mouse, the lack of ErbB4 expression led to a similar phenotype as with the gain of function, and the renal functions of the mutant adult kidneys were compromised. In conclusion, the results point to specific roles for Wnt-4 and ErbB4 in the control of urogenital development. Wnt-4 appears to be crucial in sustaining proper female somatic cell and germ cell differentiation, and maintenance of gonad development during and after the sex determination event, while ErbB4 activity is critical for the regulation of tubular growth in embryonic kidney development. / Tiivistelmä Sekä nisäkkään jälkimunuainen, lisämunuainen että sukurauhanen kehittyvät alkion urogenitaalialueen järjestelmästä ja solu- ja kudosvuorovaikutukset ohjaavat elinkehitysprosessia. Tapahtuman molekyylitason mekanismit ovat kuitenkin huonosti tunnettuja. Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin Wnt-4 signaalin tehtäviä sukurauhasen ja ErbB4- proteiinin munuaisen kehityksessä. Wnt-4 signaali on keskeinen naisen sukupuolisuuden kehityksessä, koska signaalin puutos aiheuttaa alkion sukupuolen osittaisen kääntymisen naaraasta koiraaksi. Tarkastelimme aluksi sitä, välittääkö Wnt-4 itusolujen ja sukurauhasen somaattisten solujen vuorovaikutuksia ohjaten itusolujen meioosia, jota mm. A-vitamiini säätelee. Havaitsimme, että Wnt-4 geeni puuttuessa tietyt meioosia säätelevät geenit kuten Stra8 ja Spo11 olivat heikentyneet, kun taas solujen monikykyisyyteen liittyvät geenit kuten Oct4, Fgf9, Sox2 ja Dnmt3l aktivoituivat vastaavalla tavalla kuin havaitaan normaalisti koirasalkion kivesaiheessa. Tämän lisäksi havaitsimme, että Cyp26b1-geeni, joka johtaa A-vitamiinin hajoamiseen alkiossa ja estää normaalisti meioosin koirasalkion kivesaiheessa oli aktivoitunut munuaisrauhasaiheessa, jolta puuttuu Wnt-4 aktiivisuus. Tuloksemme osoittavat, että Wnt-4 säätelee osaltaan naarasalkion itusolujen meioosia. Tarkastelimme myös mikrosirututkimusten avulla niitä geenejä, joita Wnt-4 säätelee sukuelinaiheessa. Identifioimme useissa Wnt ja β-catenin signaalireittiin liittyvissä geeneissa muutoksia. Muuntuneet geenit voivat olla Wnt-4 signaalireitin kohdegeenejä. Näistä Runx-1 saattaa olla keskeinen Wnt signaalitien kohdegeeni, joka säätelee merkittävällä tavalla naaraan munarauhasen kehitystä. Väitöskirjan toisessa osassa tarkastelimme ErbB4-reseptorityrosiinikinaasin tehtäviä munuaisen kehityksen säätelyssä. ErbB4-geenin tehtäviä tutkittiin käyttäen hyväksi siirtogeenisiä malliorganismeja, joissa ErbB4-geenin määrä oli joko koholla tai ajastetusti inaktivoitu. ErbB4- geenin kokeellinen yliaktiivisuus muutti spesifisti tekijöitä, jotka säätelevät osaltaan jälkimunuaisen epiteeliputkien solujen orientaatiota ja solun jakautumista. Solujen orientaatiomuutoksen yhteydessä myös solujen jakautuminen häiriintyi. Oletuksemme on, että nämä epiteelikudoksessa tapahtuneet muutokset ovat syy, miksi kohotettu ErbB4-aktiviteetti muuttaa epiteeliputkien paksuutta ja pituutta erityisesti munuaisen pintakerroksissa. Havaitsimme myös, että ErbB4-geenin ajastettu poistaminen munuaisen epiteelikudoksessa johti hyvin samankaltaisiin, mutta vastakkaisiin muutoksiin kuin ErbB4-aktiviteetin kohottaminen. Muutokset johtivat myös muutoksiin munuaisen toiminnassa. Yhteenvetona toteamme, että näillä Wnt-4 ja ErbB4 solusignallointiin liittyvillä molekyyleillä on keskeinen tehtävä alkion munarauhasen ja munuaisen aiheen kehityksen säätelyssä. Wnt-4 ohjaa sekä itusolujen että somaattisten solujen erilaistumista ja samalla sukupuolen määräytymistä ja jatkokehitystä, kun taas ErbB4-signallointireseptorin tehtävä on avainasemassa munuaisen epiteeliputken kasvun säätelyssä.

L'épithélium intestinal est un tissu en constant renouvellement, grâce à des cellules souches somatiques présentes dans les cryptes intestinales. Le renouvellement perpétuel et l’homéostasie de ce tissu sont assurés par plusieurs réseaux de signalisation. Il est maintenant admis que la dérégulation de ces mêmes voies est impliquée dans le processus d’initiation et/ou de progression tumorale. Mon laboratoire a décrit l'implication des hormones thyroïdiennes (HT) et de leur récepteur nucléaire TRα1 dans le contrôle de l'homéostasie intestinale, via la régulation de la voie Wnt, jouant un rôle clé dans la physiopathologie de ce tissu. Plus précisément, TRα1 active l’expression et la stabilisation de β-caténine via un mécanisme impliquant le facteur sFRP2. Au cours de ma thèse, j’ai participé, d’une part à l’étude de souris transgéniques surexprimant TRα1 dans l’épithélium intestinal et à l’analyse des mécanismes moléculaires de la régulation croisée entre TRα1 et la voie Wnt canonique dans l’induction des tumeurs intestinales. Nous avons donc démontré un rôle oncogénique de TRα1 dans l’épithélium intestinal. De plus, le mécanisme moléculaire et fonctionnel implique les deux effecteurs de la voie canonique, β-caténine et TCF4. D’autre part, j’ai analysé la fonction de sFRP2 dans la physiopathologie intestinale, et son action sur la voie Wnt. D’une manière intéressante, l’étude de la fonction de sFRP2 nous a permis de révéler son rôle original dans la différenciation des cytotypes épithéliaux. De plus, nous avons montré que sFRP2 est un modulateur positif des voies Wnt canonique et non canonique (JNK). Par ailleurs, l’absence d’expression de sFRP2 a pour conséquence d’augmenter l’apoptose dans les cryptes intestinales et ainsi diminuer le nombre de tumeurs chez des animaux double mutants sFRP2-/-/Apc+/1638N comparé aux simple mutants Apc+/1638N. Ces résultats fournissent des éléments originaux et importants sur les relations fonctionnelles entre les voies des HT et Wnt. / The intestinal epithelium is a tissue constantly renewing through somatic stem cells located within the crypts. Several signalling pathways control this process and the homeostasis in this tissue. It is now recognized that the deregulation of these pathways is involved in the process of initiation and/or progression of intestinal tumors. My laboratory has described the involvement of thyroid hormones (TH) and their nuclear receptor TRα1 in the control of the intestinal homeostasis via the regulation of Wnt pathway, which plays a key role in the intestinal physiopathology. Specifically, TRα1 directly activates the expression of β-catenin and controls its stabilization through a mechanism involving sFRP2 (secreted frizzled-related protein 2). During my thesis, I participated to the characterization of transgenic mice overexpressing TRα1 in the intestinal epithelium. Moreover, I have been involved in the study of the molecular mechanisms of the cross-regulation between TRα1 and the canonical Wnt in the induction of intestinal tumors. We have therefore demonstrated an oncogenic role of TRα1 in the intestinal epithelium. In addition, the molecular and functional mechanisms involve both effectors of the canonical pathway, β-catenin and TCF4. On the other hand, I carried out the study of sFRP2 function in the intestinal physiopathology, and its action on the Wnt pathway. My data strongly suggest that sFRP2 plays an essential role in the differentiation of epithelial cytotypes. In addition, we showed that sFRP2 is a positive modulator of the canonical and non-canonical (JNK) Wnt. For instance, the absence of sFRP2 expression increases the apoptosis in the intestinal crypts and thus reduces the number of tumors in the double mutant sFRP2-/-/Apc+/1638N compared to simple mutant Apc+/1638N. These results provided original and important data of the functional relationships between TH and Wnt pathways.

Dans ce mémoire, nous présentons l’utilisation de techniques de model-checking pour l’inférence de paramètres de réseaux de régulation génétique (GRN) et l’analyse formelle d’une voie de signalisation. Le coeur du mémoire est décrit dans la première partie, dans laquelle nous proposons une approche pour inférer les paramètres biologiques régissant les dynamiques de modèles discrets de GRN. Les GRN sont encodés sous la forme d’un méta-modèle, appelé GRN paramétré, de telle façon qu’une instance de paramètres définit un modèle discret du GRN initial. Sous réserve que les propriétés biologiques d’intérêt s’expriment sous la forme de formules LTL, les techniques de model-checking LTL sont combinées à celles d’exécution symbolique et de résolution de contraintes afin de sélectionner les modèles satisfaisant ces propriétés. L’enjeu est de contourner l’explosion combinatoire en terme de taille et de nombre de modèles discrets. Nous avons implémenté notre méthode en Java, dans un outil appelé SPuTNIk. La seconde partie décrit une collaboration avec des neuropédiatres, qui ont pour objectif de comprendre l’apparition du phénotype protecteur ou toxique des microglies (un type de macrophage du cerveau) chez les prématurés. Cette partie exploite un autre versant du model-checking, celui du modelchecking statistique, afin d’étudier un type de réseau biologique particulier : la voie de signalisation Wnt/β-caténine, qui permet la transmission d’un signal de l’extérieur à l’intérieur des cellules via une cascade de réactions biochimiques. Nous présentons ici l’apport du model-checker stochastique COSMOS, utilisant la logique stochastique à automate hybride (HASL), un formalisme très expressif nous permettant une analyse formelle sophistiquée des dynamiques de la voie Wnt/β-caténine, modélisée sous la forme d’un processus stochastique à événements discrets. / In this thesis, we present the use of model checking techniques for inference of parameters of Gene Regulatory Networks (GRNs) and formal analysis of a signalling pathway. In the first and main part, we provide an approach to infer biological parameters governing the dynamics of discrete models of GRNs. GRNs are encoded in the form of a meta-model, called Parametric GRN, such that a parameter instance defines a discrete model of the original GRN. Provided that targeted biological properties are expressed in the form of LTL formulas, LTL model-checking techniques are combined with symbolic execution and constraint solving techniques to select discrete models satisfying these properties. The challenge is to prevent combinatorial explosion in terms of size and number of discrete models. Our method is implemented in Java, in a tool called SPuTNIk. The second part describes a work performed in collaboration with child neurologists, who aim to understand the occurrence of toxic or protective phenotype of microglia (a type of macrophage in the brain) in the case of preemies. We use an other type of model-checking, the statistical model-checking, to study a particular type of biological network: the Wnt/β- catenin pathway that transmits an external signal into the cells via a cascade of biochemical reactions. Here we present the benefit of the stochastic model checker COSMOS, using the Hybrid Automata Stochastic Logic (HASL), that is an very expressive formalism allowing a sophisticated formal analysis of the dynamics of the Wnt/β-catenin pathway, modelled as a discrete event stochastic process.

Background & Aims: Despite advances in surgical care and chemotherapeutic regimens, the five-year survival rate for Stage IV Hepatoblastoma (HB), the predominant pediatric liver tumor, remains at 27%. YAP1 and β-Catenin co-activation occurs in 80% of children’s HB; however, a lack of conditional genetic models precludes exploration of tumor maintenance and therapeutic targets. Thus, the clinical need for a targeted therapy remains unmet. Given the predominance of YAP1 and β-catenin activation in children’s tumors, I sought to evaluate YAP1 as a therapeutic target in HB. Approach & Results: Herein, I engineered the first conditional murine model of HB using hydrodynamic injection to deliver transposon plasmids encoding inducible YAP1S127A, constitutive β-CateninDelN90, and a luciferase reporter to murine liver. Tumor regression was evaluated using in vivo bioluminescent imaging, and tumor landscape characterized using RNA sequencing, ATAC sequencing and DNA foot-printing. Here I show that YAP1 withdrawal in mice mediates >90% tumor regression with survival for 230+ days. Mechanistically, YAP1 withdrawal promotes apoptosis in a subset of tumor cells and in remaining cells induces a cell fate switch driving therapeutic differentiation of HB tumors into Ki-67 negative “hbHep cells.” hbHep cells have hepatocyte-like morphology and partially restored mature hepatocyte gene expression. YAP1 withdrawal drives formation of hbHeps by modulating liver differentiation transcription factor (TF) occupancy. Indeed, tumor-derived hbHeps, consistent with their reprogrammed transcriptional landscape, regain partial hepatocyte function and can rescue liver damage in mice. Conclusions: YAP1 withdrawal, without modulation of oncogenic β-Catenin, significantly regresses hepatoblastoma, providing the first in vivo data to support YAP1 as a therapeutic target for HB. Modulating YAP1 expression alone is sufficient to drive long-term regression in hepatoblastoma because it promotes cell death in a subset of tumor cells and modulates transcription factor occupancy to reverse the fate of residual tumor cells to mimic functional hepatocytes.