Orientador: Pedro Paulo Chaves de Souza / Resumo: A periodontite é resultado do desequilíbrio entre o biofilme bacteriano e a resposta imune do hospedeiro. Componentes bacterianos, como o lipopolissacarídeo (LPS) e as lipoproteínas, são reconhecidos pelo sistema imune e desencadeiam a produção de citocinas que auxiliam no combate à infecção, mas também induzem a destruição tecidual. A participação do LPS na destruição óssea já é bem estabelecida, porém o papel das lipoproteínas na periodontite permanece carente de investigação. Na periodontite, citocinas pró-inflamatórias participam do processo de destruição do tecido ósseo. Neste processo, são secretadas também citocinas osteoprotetoras. Dentre elas, a interleucina 4 (IL-4) é reconhecida pela propriedade de inibir a produção citocinas pró inflamatórias como IL-1, IL-6 e TNF-α. O papel protetor de IL-4 na osteoclastogênese e na doença periodontal induzida por lipoproteína ainda não foi investigado. Nosso estudo foi divido em dois capítulos. No capítulo 1, hipotetizamos que a lipoproteína sintética Pam2CSK4 (PAM2) poderia induzir a reabsorção óssea periodontal. Para isso, foram utilizados camundongos C57bl/6, que receberam injeções a cada 2 dias, por 24 dias, do veículo, LPS de Escherichia. coli ou PAM2, entre o primeiro e segundo molar superior. Após o período experimental, os animais foram eutanasiados e destinados à análise por microCT, análise histológica e imunohistoquímica para marcação dos osteoclastos. A PAM2 apresentou a capacidade de induzir a perda óssea alveolar, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The pathogenesis of periodontitis is a result of imbalance between the bacterial biofilm and the host immune response. Bacterial components such as lipopolysaccharide (LPS) and lipoproteins, activate the immune system leading to periodontal distruction. The participation of LPS in periodontal bone destruction is well established, but there is a lack of information about the role of lipoproteins in periodontitis. In the pathogenesis of periodontitis, these molecular patterns are recognized by host immune system and trigger the production of cytokines that participate of antimicrobial response, but also induce tissue destruction. On the other hand, antinflamatory cytokines produced by Th2 cells, such as IL-4, have an osteoprotective phenotype. The role of IL-4 in lipoprotein-induced periodontitis was not yet investigated. Thus, this thesis was divided in two chapters. In chapter 1, we investigated the role of lipoproteins in the pathogenesis of periodontitis in mice. In this study, we hypothesized that the synthetic lipoprotein Pam2CSK4 (PAM2) can induce periodontal bone resorption. C57bl / 6 mice received bilateral injections every other day for 24 days of: vehicle, Escherichia coli LPS or PAM2, between the first and second upper molars. Twenty-four hours after the last injection, the mice were euthanized and the jaw bones were scanned for micro computed tomography, decalcified and processed for histological analysis and stained for tartrate-resistant acid phosphatase, phenoty... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O trabalho apresentado nesta dissertação trata do desenvolvimento de um mecanismo para adaptação automática de ví?deo MPEG-4 ao vivo, de modo a atender as necessidades ou capacidades atuais de usuários e do sistema. Um dos desafios dessa área é capturar e representar as informações necessárias para realizar a adaptação. Assim, utilizando técnicas da área de computação ciente de contexto, foi desenvolvido um modelo extensível para representação de dispositivos. Também foram desenvolvidos métodos automáticos e semi-automáticos para capturar as informações necessárias. Neste trabalho foi adotado o modelo de recodificação de vídeo, o qual pode gerar atrasos que inviabilizam a adaptação de vídeo ao vivo em aplicações interativas. Assim, este trabalho realizou uma avaliação do impacto causado pela recodificação no atraso total, fim-a-fim, percebido pelo usuário. / This work presents the development of a mechanism to automatically adapt MPEG-4 live video, in a way to response the actual necessities or capacities of users or systems. One of the challanges in this area is to capture and represent the information needed to adapting content. Thus, using context aware computing techniques, an extensible model has been developed, which can be used to represent devices. It has also been developed automatic and semi-automatic methods to capture the needed information. In this work, the transcoding model has been adopted, which may generate latency, making difficult to use transcoding with interactive applications. In this way, this work has evaluated the impact caused by the transcoding when compared to the end-to-end total delay perceived by the user.

Nous avons pour but de développer un système microfluidique en gouttes, capable, à l’échelle de la cellule/bactérie unique, de détecter et de co-localiser plusieurs marqueurs génétiques, en utilisant une version digitale et multiplexée de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Les systèmes de PCR digitale actuellement commercialisés ne le permettent toujours pas. Un tel prototype garantira la présence de multiples marqueurs à l’intérieur d’un même génome, ce qui permettra l’identification du pathogène avec précision et un taux de faux-positifs proche de zéro. Comme première application, nous démontrerons la possibilité de co-localiser quatre gènes de virulence de la souche O157:H7 d’Escherichia coli, un pathogène majeur, qui est détecté dans des échantillons alimentaires ou provenant de fèces cliniques pouvant aussi contenir des E. coli non pathogènes porteuses d’une partie des gènes de virulence. Avant de procéder à des tests TaqMan multicolores en point final, E. coli sera d’abord encapsulée dans des gouttes micrométriques et lysée par la chaleur in situ. Notre objectif est de démontrer que ce test peut être appliqué avec succès à un petit ensemble d’échantillons cliniques ou alimentaires / We aim to develop a prototype of droplet-based microfluidic system capable of detecting and colocalizing multiple genetic markers at the single cell/bacteria level, using the Polymerase Chain Reaction (PCR) in a digital multiplexed version. This cannot be achieved using current commercial digital PCR systems, and should increase the sensitivity and reliability of the detection of pathogens. Importantly, the system will guarantee the presence of multiple markers within the same genome and enable accurate identification, and bring the false positive rate close to zero. As a first application, we will demonstrate the possibility to co-localize 3 virulence genes in the E.coli strain O157:H7, a major foodborne pathogen, which has to be detected in clinical feces samples or food samples, which may also contain non pathogenic E. coli carrying only a subset of these virulence genes. E. Coli will be encapsulated in micrometric droplets, lysed by heating in situ prior performing a multicolour end-point Taqman assay. Our objective is to demonstrate that this test can be successfully applied to real clinical or food samples

The general aim of the present thesis is to undertake a thorough photochemical study on a family of aromatic N-oxides. Specifically, the selected compounds are 4-desoxytirapazamine (DTPZ) and 4-nitroquinoline N-oxide (NQNO), and the study is focused on their photophysical and photochemical characterization, as well as on the interaction of their excited states with other molecules of interest. Both the singlet and triplet excited states of DTPZ have been spectroscopically characterized. Thus, using laser flash photolysis in the femtosecond time scale the transient absorption spectrum corresponding to 1DTPZ* has been observed. In addition, laser flash photolysis in the nanosecond time scale has allowed us to obtain the transient spectrum corresponding to 3DTPZ*. From the fluorescence and phosphorescence emission spectra, the energies of the singlet and triplet excited states have been estimated. Moreover, in the nano-FDL experiments a negative band has been observed and assigned as "P-TYPE delayed fluorescence" based on the influence of different experimental conditions. As regards NQNO, its singlet excited state of (1NQNO*) has also been characterized by different spectroscopic techniques, combining transient absorption with steady state and time-resolved emission spectroscopy. The energy of 1NQNO* has been established from the fluorescence spectrum, whereas its lifetime in the femto-FDL experiments, where a characteristic S1-Sn absorption band is observed. In a first stage, the triplet excited state of NQNO (3NQNO*) has also been characterized by emission spectroscopy. Thus, from the steady-state phosphorescence spectrum the triplet energy has been estimated. Formation of 3NQNO* by intersystem crossing has been monitored by femto-FDL, giving rise to an isosbestic point. The characterization of 3NQNO* has been completed by nano-LFP, using oxygen as well as ¿-carotene as quenchers. In addition, quenching of 3NQNO* electron donors is also observed in aprotic solvents, leading to the radical anion of NQNO (¿-NQNO). If there is a proton source in the medium, protonation of the radical anion results in formation of the neutral radical of NQNO (¿NQNOH). In general, all processes are slower in protic solvents because of the solvation sphere. Moreover, it has been observed by nano-FDL that 3NQNO* is quenched by tryptophan (Trp) via an electron transfer mechanism. In the presence of human serum albumin protein a similar interaction is observed, pointing to a close proximity between NQNO and the Trp residue of HSA and revealing that the N-oxide is indeed located in inside the protein cavities. The singlet excited state of Trp is also quenched by NQNO, leading to formation of an exciplex that emits at longer wavelength than the non-complexed amino acid. The same process is observed in HSA, providing further evidence in support of the proximity between NQNO and the Trp residue of the protein and NQNO. Thus, it is proven that NQNO enters into the protein and is hosted close to the Trp unit of HSA. Finally, pyridine N-oxide, PDZNO and NQNO have been used to generate atomic oxygen (O(3P)) through photochemical cleavage of the N-O bond. Although it has not been possible to achieve the direct detection of this reactive oxygen species, its generation has been evidenced by nano-LFP, using acetonitrile for chemical trapping. Under these conditions, formation of the nitrilium oxide MeCNO is monitored at 340 nm. Alternatively, using PDZNO as source of O(3P) and benzene as solvent, atomic oxygen is trapped by benzene to give phenol, which can be analyzed by gas chromatography. Following this approach, it has been demonstrated that O(3P) is efficiently scavenged by the solar filter BEMT . Incorporation of oxygen to the UV-filter has been demonstrated and occurs mainly at the methoxylated ring. Therefore, BEMT has a double function, acting both as UV-filter and as antioxidant. / Profundizar en el estudio de los N-óxidos es el objetivo de la presente tesis. Así pues, se han seleccionado los compuestos 4-desoxitirapazamina (DTPZ) y 4-nitroquinolina N-óxido (NQNO) para su caracterización fotofísica y fotoquímica y el estudio de las interacciones con diversas moléculas. Se han caracterizado los estados excitados singlete y triplete del compuesto conocido como 4-desoxitirapazamina. Además, por FDL se ha caracterizado las bandas de absorción transitoria S1-Sn y T1-Tn,. También, por espectroscopía de emisión se han caracterizado, las energías de los estados excitados singlete y triplete. Así mismo, se ha descrito una banda adicional observada por nano-FDL y asignada, como fluorescencia retardada de Tipo P. Por otro lado, se ha caracterizado el estado excitado singlete del compuesto 4-nitroquinolina N-óxido por distintas técnicas espectroscópicas de absorción y emisión en estado estacionario y con resolución temporal. Se ha registrado su espectro de fluorescencia y calculado la energía del estado excitado singlete, y por femto-FDL se ha podido caracterizar el espectro de absorción S1-Sn,, así como el tiempo de vida del estado excitado singlete. También, se ha caracterizado el estado excitado triplete de 4-nitroquinolina N-óxido, por espectroscopía de emisión, obteniendo su espectro de fosforescencia y calculando la energía de 3NQNO* y su tiempo de vida. Para completar la caracterización del estado excitado triplete se han utilizado como desactivadores: oxígeno y ¿-caroteno. Siguiendo con la caracterización de NQNO, se ha identificado la reactividad de su estado excitado triplete desde su formación a su desactivación, desencadenando diversos comportamientos según las condiciones. Así se observa que el triplete en presencia de dadores de electrones y en disolvente aprótico da lugar al radical anión tras una transferencia electrónica. Mientras que si en el medio existe un dador de protones, se produce una protonación del radical obteniendo el radical anión protonado de NQNO. Los procesos en disolvente prótico están ralentizados debido a su esfera de solvatación. Por otra parte, se ha observado que el estado excitado triplete de NQNO se desactiva al ser excitado por nano-FDL en presencia de triptófano por un mecanismo de transferencia electrónica, dando lugar al radical protonado de NQNO. En presencia de proteína transportadora albúmina sérica humana se observa una interacción similar, lo que indica que el N-óxido se sitúa dentro de la proteína y mantiene una proximidad espacial con el Trp de la cadena peptídica. Por lo que respecta al estado excitado singlete del Trp, éste se desactiva en presencia de NQNO, dando lugar a la formación de un exciplejo que emite a longitudes de onda mayores a las del singlete del aminoácido. Dicho proceso también ocurre con la albúmina, lo que nos vuelve a indicar que la molécula de NQNO se sitúa dentro de la estructura terciaria de la proteína y próxima a la posición del aminoácido Trp. De forma paralela, se han usado los N-óxidos heterocíclicos PYRNO, PDZNO y NQNO para obtener oxígeno atómico (O(3P)) a partir de la ruptura fotoquímica homolítica del enlace N-O. Aunque no ha sido posible la detección directa de oxígeno atómico, , sí se han desarrollado dos métodos para identificar los productos resultantes de la captura química de O(3P). Así, mediante nano-FDL se ha observado la formación del óxido de acetonitrilo como especie transitoria en las disoluciones de PYRNO, PDZNO y NQNO en acetonitrilo. Por otra parte, a través de la irradiación de PDZNO disuelto en benceno en estado estacionario, se ha detectado la formación de fenol por cromatografía de gases. Además se ha demostrado la gran afinidad del filtro solar bemotrizinol por el oxígeno atómico. También se ha evidenciado la incorporación de oxígeno a la estructura del filtro solar, teniendo lugar la oxidación preferentemente en el sust / Aprofundir a l'estudi dels N-òxids es l'objectiu de la present tesi. Així donç, s'han seleccionat els compostos 4-desoxitirapazamina (DTPZ) y 4-nitroquinolina N-òxid (NQNO) per a la seua caracterització fotofísica i fotoquímica i l'estudi de les interaccions amb diverses molècules. S'han caracteritzat els estats excitats singlet i triplet del compost conegut com a 4-desoxitirapazamina. A més a més, s'han observat per FDL les bandes d'absorció transitòria S1-Sn i T1-Tn. També, s'han caracteritzat les energies dels estat excitats singlet i triplet, així com el temps de vida de fosforescència. Així, s'ha descrit una banda addicional observada com a fluorescència retardada de Tipo P. També, s'ha caracteritzat l'estat excitat singlet del compost 4-nitroquinolina N-òxid per tècniques espectroscòpiques d'absorció y emissió en estat estacionari i amb resolució temporal. S'ha registrat el seu espectre de fluorescència, i per FDL a l'escala ultrarràpida de femtosegons s'ha pogut caracteritzar l'espectre de absorció S1-Sn,, així com el temps de vida. També, s'ha caracteritzat l'estat excitat triplet de 4-nitroquinolina N-òxid, per espectroscopia d'emissió, obtenint el seu espectre de fosforescència y calculant l'energia de 3NQNO* i el seu temps de vida. Per a completar la caracterització del estat excitat triplet s'ha utilitzat desactivadors de l'estat excitat triplet (oxigen y ¿-caroten). Seguint amb la caracterització de NQNO, s'ha identificat la reactivitat del seu estat excitat triplet des de la seua formació (com s'observa a l'isosbèstic per femto-FDL) a la seua desactivació observada per nano-FDL, desencadenant diversos comportaments segons les condicions. Així s'observa que e triplet en presència de donadors d'electrons amb dissolvents apròtics dona lloc al radical anió després d'una transferència electrònica. Mentre que si al medi existeixen donadors de protons, es produeix una protonació del radical i s'obté el radical anió protonat de NQNO. Els processos en dissolvents pròtics està enrederits degut a l'esfera de solvatació. D'altra banda, s'ha observat que l'estat excitat triplet de NQNO es desactiva al ser excitat per nano-FDL en presencia de triptòfan (Trp). Això ocorre per un mecanisme de transferència electrònica, donant lloc al radical protonat de NQNO. En presència de proteïna transportadora albúmina sèrica humana s'observa una interacció similar, el que indica que l' N-òxid es situa dintre de la proteïna i es manté una proximitat espacial amb el Trp de la cadena peptídica. Pel que fa a l'estat excitat singlet de Trp, es desactiva en presencia de NQNO donant lloc a la formació d'un exciplex que emitix a longituds d'ona majors a les del singlet de l'aminoàcid. Aquest procés també ocorre amb la albúmina, el que torna a indicar que la molècula de NQNO es situa dins de la estructura terciària de la proteïna pròxima a la posició del aminoàcid Trp. De forma paral¿lela s'han gastat els N-òxid heterociclics piridina N-òxid (PYRNO), piridazina N-òxid (PDZNO) i NQNO per a obtindre oxigen atòmic (O(3P)) a partir de la ruptura fotoquímica homolítica de l'enllaç N-O. Encara que no ha sigut possible la detecció directa de l'oxigen atòmic, s'han desenvolupat dos mètodes per a identificar els productes resultants de la captura química de O(3P). Així, amb la tècnica espectroscòpica de FDL s'ha observat la formació de l'òxid d'acetonitril com a espècie transitòria a les dissolucions de PYRNO, PDZNO i NQNO en acetonitril. D'altra banda, a través de l'irradació de PDZN dissolt en bencé en estat estacionari s'ha detectat la formació de fenol per cromatografia de gasos. Amés s'ha demostrat la gran afinitat del filtre solar bemotrizinol per l'oxigen atòmic i s'ha evidenciat la incorporació d'oxigen a la estructura del filtre solar a través, produint-se l'oxidació preferentment al substituent metoxilat. Per tant, bemotrizimol utilitzat general / Durán Giner, EDLN. (2017). Fotólisis de N-óxidos heterocíclicos. Caracterización de los estados excitados, reactividad frente a dadores de electrones y generación de oxígeno atómico [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/84286 / TESIS

Le symporteur Na+/I- (NIS) médie le captage de l'iode dans la glande thyroïde et cette propriété est exploitée depuis de nombreuses années en thérapeutique pour traiter les cancers différenciés de la thyroïde à l’iode radioactif 131 (Radiothérapie métabolique ou RAI). Cependant, 5 à 10% des patients deviennent réfractaires à la RAI, ce qui indique un mauvais pronostic. La réduction de l'expression NIS et son internalisation sont caractéristiques de ce processus. La mutation activatrice BRAFV600E est la plus fréquemment identifiée au sein des cancers différenciés de la thyroïde de type papillaires (CPT), qui est le type le plus répandu. Dans les thyrocytes de souris, BRAF muté induit la sécrétion de TGF qui active ensuite la voie Smad ce qui entraîne la répression du NIS. La NADPH oxydase 4 (NOX4), enzyme génératrice d’espèces réactives de l'oxygène (ROS), est un médiateur clé de la signalisation du TGFß dans de nombreux types cellulaires et sa surexpression a été détectée dans le cancer de la thyroïde. L'objectif de ce travail est d'évaluer si NOX4 est un médiateur de la répression NIS induite par BRAFV600E dans des lignées cellulaires thyroïdiennes. En utilisant une lignée cellulaire de thyroïde normal de rat (PC-BRAF), nous avons démontré que le TGF-β ou l'expression BRAFV600E promeut la diminution de l'ARNm NIS ainsi que celle du captage de l'iodure en revanche ils augmentent l’expression de l'ARNm NOX4. Le silençage de Nox4 par siRNA ou un traitement des cellules par SIS3, un inhibiteur de pSmad3, inhibe la répression du NIS médiée par BRAFV600E, indiquant l'implication de la voie Smad3 et de Nox4 dans cette répression. Dans la lignée tumorale BCPAP derivée d’un CPT humain et porteuse de la mutation BRAFV600E, nous avons également observé une augmentation de l'expression de l'ARNm NIS lorsque BRAFV600E ou NOX4 sont inhibés. Dans les cellules BCPAP, un traitement par H2O2 augmente l'expression de la protéine ADN méthyltransférase 1 (DNMT1) dans la fraction cellulaire enrichie en protéines liées à la chromatine. Un traitement par des antioxydants ou le silençage de NOX4 réduise ce recrutement. Le TGF augmente le niveaux de protéines DNMT1 dans la fraction cellulaire enrichie en chromatine, lequel qui est renversé par un traitement par un inhibiteur de NADPH oxydase : le Diphenyleneiodonium (DPI). La méthylation de l'ADN induite par le TGF et l'hypoacétylation de l'histone H3K9/K14, qui sont des marques de répression de la transcription, sont détectées au niveau du promoteur NIS. L’ensemble de ces données suggère que Nox4 est un acteur clé de la signalisation TGF-BRAFV600 et joue un rôle répressif sur l'expression du NIS, probablement par des mécanismes épigénétiques. Cette étude apporte des données fonctionnelles pour le développement de nouveaux outils thérapeutiques. / The co-transporter Na+/ I- (NIS) mediates iodide uptake in thyroid gland which is a key step in hormonal biosynthesis. Iodide accumulation by thyrocytes is the basis of radioiodine therapy (RAI) which is the standard post-surgery therapeutic approach to efficiently eliminate remaining cancer lesions and metastasis of differentiated thyroid cancer (DTC). However, 5-10% of DTC patients become RAI-refractory which is indicative of poor prognosis. Reduced NIS expression and NIS internalization are in this process. BRAFV600E mutation is the most common genetic event in papillary thyroid cancers (PTCs), the most prevalent type of DTC. In rat thyrocytes, BRAFV600E induces secretion of TGFβ that activates Smad pathway resulting in NIS downregulation and overexpression of TGFβ is associated with NIS repression in patients. NADPH oxidase NOX4, a professional reactive oxygen species (ROS) generating enzyme, is a key mediator of TGFβ signaling in many cell types and has been previously demonstrated to be overexpressed thyroid cancers. To better understand the molecular mechanisms involved in PTC loss of iodine avidity, the aim of this work is to evaluate whether NOX4 is a key player of BRAFV600E-mediated NIS repression in thyroid cell lines. Using a normal rat thyroid cell line (PC-BRAF) we demonstrated that TGF-β administration or expression of BRAFV600E resulted in reduced NIS mRNA, reduced iodine uptake and increased NOX4 mRNA expression. NOX4 silencing or treatment with SIS3 an inhibitor of Smad pathway partially inhibited NIS repression indicating the implication of both Smad pathway and NOX4. To confirm this results we used a human thyroid cancer cell lines that harbors BRAFV600E mutation (BCPAP and 8505c) and observed an increase in NIS expression followed by BRAFV600E or NOX4 downregulation. Exogenous H2O2 induced DNA methyl-transferase 1 (DNMT1) enrichment in tight-chromatin protein fraction which was decreased by antioxidants or NOX4 silencing in BCPAP cells. TGF increased DNMT1 protein levels in chromatin-enriched cell fraction which was reversed by NADPH oxidase inhibitor, Diphenyleneiodonium (DPI). TGF-mediated DNA methylation and histone H3K9/K14 hypoacetylation were detected in NIS promoter, which is a repressive transcriptional mark. The data obtained suggest that NOX4 is a mediator of BRAFV600-TGF signaling and has a repressive role over NIS expression probably through epigenetic mechanisms. These results should lead to a better understanding of NIS expression regulation in thyroid cancer, bringing functional data for the development of new therapeutic tools.

In der Baupraxis werden gemischtkörnige Böden oft als Baustoff für Erdbauwerke oder als Baugrund angetroffen. Die Klassifizierung dieser Böden erfolgt gemäß DIN 18196 nach der Korngrößenverteilung. Es fehlt ein Verfahren zur zahlenmäßigen Beschreibung des Zustands auf der Grundlage von definierten experimentellen Grenzwerten. Für Sand-Schluff-Gemische wurden Verfahren zur Modellierung der Grenzporenzahlen entwickelt. In diesem Beitrag werden Ansätze zur Beschreibung des Zustands gemischtkörniger Böden mit plastischem Feinkorn mit dem Bodenzustandsindex vorgestellt. Diese beruhen u. a. auf experimentellen Untersuchungen zur Verdichtbarkeit von zwei Modellmischungen mit unterschiedlichem Feinkorngehalt.

This diploma thesis studied the ability of Cupriavidus malaysiensis, Delftia acidovorans and Azohydromonas lata to produce poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate), [P(3HB-co-4HB)], by using -butyrolactone and 1,4-butanediol as carbon substrates. The objective of this work was the production and characterisation of isolated polyhydroxyalkanoates (PHA). The theoretical part deals with the basic description and classification of polyhydroxyalkanoates. Next, the biosyntheses of the most investigated PHAs were described. The practical section of the work discusses and presents the output of the cultivation of five bacterial strains selected for the production of [P(3HB-co-4HB)], namely, Cupriavidus malaysiensis (DSM 19379), Delftia acidovorans (DSM 39), Delftia acidovorans (CCM 2410), Delftia acidovorans (CCM 283) and Azohydromonas lata (CCM 4448). The effect of the modified cultivation conditions for each of the used bacteria on the PHA production yields was discussed. The produced biomass after the cultivation was characterised spectrophotometrically, gravimetrically and by gas chromatography. Polymers were isolated from the biomass by the extraction in chloroform. The isolated polymers were characterised from the viewpoint of chemical composition, molecular weight and thermal properties by using Attenuated total reflection infrared spectroscopy, Size exclusion chromatography, Differential scanning calorimetry and Thermogravimetric analysis.

Au cours des dernières années, l’immunothérapie a révolutionné le paysage en oncologie. L’anti-CTLA-4 a montré son efficacité sur la survie globale des patients atteints de mélanome métastatique. Cependant, ce traitement présente des limites à son utilisation telles que l'efficacité clinique obtenu chez seulement 20% des patients et la survenue fréquente de colites pouvant être sévères. La recherche de biomarqueurs prédictifs de réponse clinique et/ou de développement de toxicité devient maintenant un enjeu majeur pour sélectionner les patients pouvant avoir un bénéfice à l’utilisation de ces traitements. En partant de l’observation que les colites induites par l’anti-CTLA-4 présentent des similitudes avec les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, nous avons émis l’hypothèse de l’existence d’un microbiote intestinal associé à une dysrégulation du système immunitaire pouvant prédire la réponse clinique et/ou la survenue d’une colite induite par l’anti-CTLA-4. Nous avons montré dans une cohorte de patients atteints de mélanome métastatique et traités par ipilimumab, qu'un microbiote intestinal enrichi en Faecalibacterium et autres Firmicutes est associé à une meilleure survie globale et sans progression ainsi qu'un risque accru de développer une colite. Les patients avec une flore enrichie en Firmicutes présentent également après traitement par ipilimumab, une activation lymphocytaire plus efficace. Par la suite, nous nous sommes intéressés aux métabolites issus du microbiote fécal et leur implication dans la réponse à l'anti-CTLA-4. Le butyrate est le principal métabolite produit par les Firmicutes. Nous avons observé chez la souris, une inhibition de l'efficacité anti-tumorale de l'anti-CTLA-4 lorsqu'elles étaient supplémentées en butyrate. In vivo, nous avons montré que le butyrate inhibe la surexpression sur les cellules dendritiques, des molécules CD80 et CD86 (molécules B7) induite par l'anti-CTLA-4. Cette immaturité des cellules dendritiques entraine un défaut d'activation des lymphocytes T spécifiques d'antigènes dépendant de l'axe CD28/B7 réduisant ainsi l'efficacité anti-tumorale. Chez l'Homme, nous avons valider cette hypothèse en montrant qu'une concentration sérique élevée en butyrate est associée à une diminution de la survie globale et sans progression comparativement aux patients avec un faible niveau de butyrate sérique.Ces travaux mettent en évidence le lien entre la composition du microbiote et les réponses immunologiques au blocage du CTLA-4. Ils apportent une explication sur un lien indirect via le butyrate entre la composition du microbiote intestinal et la réponse anti-tumorale aux immunothérapies. / In the last years, immunotherapy has revolutionized the landscape in oncology. The efficacy of anti-CTLA-4 has been demonstrated by improving overall survival of patients with metastatic melanoma. However, this treatment has limitations to its use such as the clinical efficacy obtained in only 20% of patients and the high incidence of severe colitis. Predictive biomarkers of clinical response and / or toxicity development are mandatory for a better selection of patients who will benefit from this treatment. Based on the observation that anti-CTLA-4-induced colitis has similarities with inflammatory bowel disease, we hypothesized that the gut microbiota associated with dysregulation of the immune system may predict the clinical response and / or occurrence of anti-CTLA-4-induced colitis.In a cohort of patients with metastatic melanoma treated with ipilimumab, we have shown that a gut microbiota enriched with Faecalibacterium and other Firmicutes is associated with a better of overall and progression-free survival as well as an increased risk of developing colitis. Firmicutes-driven microbiota is also associated with an improvement in lymphocyte T activation after ipilimumab treatment. Subsequently, we were interested in microbial metabolites and their involvement in the clinical response to anti-CTLA-4. Butyrate is the main metabolite produced by the Firmicutes. In mice, we observed an inhibition of anti-tumor effect of anti-CTLA-4 in butyrate-supplemented mice. In vivo, we have shown that butyrate inhibits the overexpression on dendritic cells, of CD80 and CD86 molecules (B7molecules) induced by anti-CTLA-4. This immaturity of the dendritic cells leads to a poor signaling of CD28 / B7 axis and activation of antigen-specific T-cells, thereby reducing anti-tumor efficacy. In humans, we validated this hypothesis by showing that a high serum concentration of butyrate is associated with decreased overall and progression-free survival compared to patients with low serum butyrate levels.This studie highlights the link between the composition of gut microbiota and the immunological responses to CTLA-4 blockade. They provide an explanation of an indirect link via butyrate, between the composition of the gut microbiota and the anti-tumor response to immunotherapies.

Ce document de thèse est divisé en deux parties indépendantes, la première partie décrit la synthèse et l'évaluation biologique de nouveaux analogues du composé anti-vasculaire, l'isocombretastatine A-4. Ce travail se situe à l'interface entre la chimie et la biologie.Des réactions séquentielles monotopes mettant en œuvre des réactions de couplage pallado-catalysées entre des N-tosylhydrazones et divers bromure de nitro-aryles et bromure de nitro-biaryles suivies d'une cyclisation réductrice ont conduit à la synthèse d’une chimiothèque d'indoles C2-, C3-, N-aryles et des carbazoles de vinyle avec une variété de substrats. De plus, cette méthodologie a permis d'explorer un nouveau mécanisme de synthèse inattendue d’indoles.L'étude biologique de ces nouvelles séries a montré que huit molécules sont dotées d’activités antiprolifératives intéressantes de l'ordre du nanomolaire contre les cellules humaines de cancer du côlon. Deux molécules ont présenté des activités très prometteuses, ayant des IC50 similaires à celle de l'isoCA-4.Par conséquent, cette partie a contribué à développer de nouvelles approches permettant l’accès rapide et simple à des molécules hautement fonctionnalisées, dont certaines possèdent une activité biologique prometteuse.Par ailleurs, la deuxième partie est liée à la synthèse de nouveaux analogues de thiazole et de benzothiazole de MIM-1 (molécule d'inhibition de Mcl-1) grâce à une série de réactions connues. Plusieurs analogues de benzothiazole ont été obtenus en une seule ou deux étapes, et les composés thiazole ont été obtenus en cinq étapes. La modification des structures des deux séries d'analogues est en cours, afin d’évaluer leur activité antitumorale, but principal de cette partie. / This thesis document is divided into two unrelated parts, the first part reported the synthesis and the biological evaluation of new analogs of the anti-vascular compound, isocombretastatin A-4. This work lies at the chemistry-biology interface.One-pot sequential reactions implementing palladium-catalyzed cross-coupling between N-tosylhydrazones and various nitro-aryl bromides and nitro-biaryl bromides followed by reductive cyclization led to the synthesis of a broad library of C2-, C3-, N-aryl indoles and vinyl carbazoles with vast substrate scope. Moreover, this methodology allowed to explore a new mechanism for the synthesis of indoles through unexpected pathways.Interestingly, the biological evaluation of these new series had identified eight molecules with antiproliferative activities in the nanomolar range against human colon carcinoma, with two molecules showing very promising results by having IC50 similar to that of isoCA-4.Hence, this part contributed to develop new processes for an easy access of highly substituted compounds which could possess promising biological activity.On the other hand, the second part is related to the synthesis of original thiazole and benzothiazole analogs of MIM-1 (Mcl-1 inhibition molecule) through a series of known reactions. Several benzothiazole analogs were obtained in one or two steps, and the thiazole compounds were obtained in five steps. More structural modifications of the two series of analogs is ongoing to achieve the innate goal of this part, which is to evaluate their antitumor activity.

Astrocytes posses a wide range of functions within the brain. In response to ischemic conditions they swell due to increased uptake of osmolytes and they are mainly responsible for cytotoxic edema formation. However, they are also able to regulate their volume by releasing osmolytes together with water via the process of regulatory volume decrease (RVD). The Aquaporin 4 (AQP4) channel and Transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) channel are suspected to be strongly involved in these processes of astrocytic volume regulation. The goal of the present diploma thesis was to clarify the role of both channels in astrocytic swelling in situ. For our experiments we used a subpopulation of green fluorescent protein-labelled astrocytes from AQP4-deficient (AQP4-/- ), TRPV4-deficient (TRPV4-/- ) and control (Ctrl) mice. Cell volume alterations were induced in acute brain slices by hypoosmotic stress or by oxygen-glucose deprivation (OGD). Data were quantified using fluorescence intensity-based approach in the whole cells and in astrocytic endfeet. Our results indicate, that there is no difference in astrocytic swelling or cell volume recovery between astrocytes from AQP4-/- , TRPV4-/- and control mice when exposed to hypoosmotic stress. On the contrary, volume changes induced by OGD varied...