Résumé : L’obésité est un enjeu de société de première importance; elle est un facteur de risque de plusieurs maladies et engendre d’importantes dépenses en santé. Outre l’alimentation, la sédentarité et les prédispositions génétiques, il semble que l’environnement fœtal soit un facteur déterminant dans le développement de l’obésité. En effet, il a été démontré que les nouveau-nés exposés à un environnement intra-utérin défavorable ont un risque accru de développer, à l’adolescence et à l’âge adulte, l’obésité ainsi que les désordres métaboliques qui y sont associés. Le diabète gestationnel (DG) est l’une des complications de santé maternelle les plus fréquentes et est associé à un risque accru à long terme pour la santé métabolique de l’enfant. Malgré les nombreuses données probantes épidémiologiques concernant le phénomène de la programmation fœtale associée au DG, les mécanismes moléculaires impliqués ont été très peu étudiés. Il est cependant de plus en plus évident que l’épigénétique soit l’un de ces mécanismes. Cette thèse a pour objectif d’identifier les changements de méthylation de l’ADN, la modification épigénétique la plus stable et la plus connue, chez les nouveau-nés exposés in utero au DG. Dans un premier temps, la méthylation de l’ADN de 44 échantillons de placenta et de sang de cordon a été analysée à l’échelle du génome. Cette approche a permis de démontrer que les gènes épigénétiquement modifiés suite à une exposition au DG sont majoritairement retrouvés dans les voies biologiques associées aux maladies métaboliques. Des analyses dans une cohorte indépendante (n=80) ont confirmé l’effet de la glycémie maternelle sur la méthylation de l’ADN des gènes BRD2, LRP1B et CACNA1D impliqués dans la régulation du métabolisme des lipides et du glucose et du système rénine-angiotensine respectivement. Dans un second temps, l’approche par gènes candidats a démontré que l’exposition au DG est associée à la méthylation de l’ADN de gènes du métabolisme des lipides (LPL et ABCA1) du placenta. L’analyse de la méthylation de la LEP et de l’ADIPOQ dans le sang et les tissus adipeux de sujets sévèrement obèses a permis d’identifier des sites de méthylation pouvant potentiellement être utilisés dans le sang comme marqueur de susceptibilité à l’obésité. L’ensemble des résultats de cette thèse démontrent que le DG modifie le profil épigénétique de gènes impliqués dans les voies biologiques des maladies métaboliques (métabolisme énergétique et des lipides) et supportent l’importance de la méthylation de l’ADN dans la programmation de la santé métabolique du nouveau-né ayant été exposé in utero au DG. / Abstract : Obesity has reached epidemic proportions worldwide in both adult and childhood populations and is now recognized as a major public health issue. Obesity is associated with higher incidence of cardiometabolic complications including type 2 diabetes (T2D), dyslipidemia and hypertension as well as with increased health care costs. The fetal environment now appears, with genetics and the environment, as one cause of the obesity epidemic. Indeed, according to the fetal programming hypothesis, newborns exposed to a detrimental fetal environment are more susceptible to develop obesity, T2D and other related chronic disorders when they become teenagers or adults. Many studies have associated gestational diabetes mellitus (GDM) exposure with these long-term metabolic health risks for the newborn. Although, numerous studies show epidemiological evidence to support the fetal programming hypothesis, only a few studies have been undertaken to understand the underlying molecular mechanisms. However, several studies now suggest that epigenetics may be involved. The objective of this thesis is to study changes in DNA methylation, the more stable and studied epigenetic system, in newborns that have been exposed to GDM in utero. First, a genome-wide DNA methylation analysis (BeadChip) was performed in a sample set of 44 placenta and cord blood samples to identify genes and metabolic pathways dysregulated by GDM. This approach showed that genes epigenetically affected by GDM are predominantly involved in metabolic diseases. The associations between maternal glycemia and DNA methylation levels were confirmed, in an independent birth cohort, for BRD2, LRP1B and CACNA1D gene loci involved in the regulation of lipid and glucose metabolism and the renin-angiotensin system respectively. Then, using a candidate gene approach we reported that DNA methylation levels at gene loci involved in lipid metabolism (LPL and ABCA1) are modified in the placenta following exposure to GDM. Furthermore, analyses of LEP and ADIPOQ DNA methylation levels in blood and adipose tissues of severely obese men and women allowed the identification of CpG sites that might be used in blood as a marker of obesity susceptibility. Altogether the results of this thesis show that GDM affects the epigenetic signature of genes involved in metabolic disease pathways (energy and lipid metabolism) and support the role of DNA methylation in metabolic health programming of the newborn exposed to GDM.

Les marqueurs épigénétiques, en particulier la méthylation de l’ADN des gènes soumis à empreinte parentale, sont sensibles aux changements environnementaux. Les techniques de l’aide médicalisée à la procréation (AMP) nécessitant la manipulation des gamètes et des embryons in vitro et dans la plupart des cas la stimulation hormonale de l’ovulation des patientes, peuvent interférer avec la reprogrammation et/ou le maintien de la méthylation des gènes soumis à empreinte. Afin d’évaluer ce risque nous avons analysé le profil de méthylation de KvDMR1, qui régule l’expression de KCNQ1OT1, dans des ovocytes humains mûris in vivo ou in vitro, provenant de patientes stimulées ou non. Nos résultats montrent que la mise en place de la méthylation au niveau de KvDMR1 se poursuit au cours de la maturation de l’ovocyte après reprise de la méiose, in vivo et in vitro et que la superovulation des patientes en AMP génère des ovocytes épigénétiquement immatures. Par ailleurs, l’étude de la méthylation de KvDMR1 et de H19 DMR (qui régule l’expression d’Igf2 et H19) dans des embryons issus d’ICSI, évolutifs ou présentant un défaut de développement, n’établit pas de lien entre les dérégulations de l’empreinte et l’arrêt du développement embryonnaire au stade blastocyste. / Epigenetic modifications, particularly DNA methylation of imprinted genes are sensible to environment. Techniques of assisted reproduction require in vitro manipulation of gamete and embryos and currently superovulation of patients. These technologies may interfere with eprogramming and maintenance of methylation at imprinted genes. To evaluate such a risk, we have determined the methylation profile of KvDMR1, the region that regulates KCNQ1OT1 imprinted gene, in human oocytes retrieved from stimulated or unstimulated cycles, at different phases of their maturation in vivo or in vitro. Our results show that the timing of establishment of the methylation profile of KvDMR1 covers the maturation phase of 199 oocyte growth, in vivo and in vitro, and that hyperstimulation likely recruits young follicles epigenetically immature. Analysis of the methylation profile of KvDMR1 and H19DMR (DMR of IGF2/H19) in ICSI embryos suggests that imprinting disorders are not responsible of embryo developmental failure prior the blastocyst stage

Le fonctionnement du cortex cérébral nécessite l’action coordonnée de deux des sous-types majeurs de neurones, soient les neurones à projections glutamatergiques et les interneurones GABAergiques. Les interneurones GABAergiques ne constituent que 20 à 30% des cellules corticales par rapport au grand nombre de neurones glutamatergiques. Leur rôle est toutefois prépondérant puisqu’ils modulent fortement la dynamique et la plasticité des réseaux néocorticaux. Il n’est donc pas surprenant que les altérations de développement des circuits GABAergiques soient associées à plusieurs maladies du cerveau, incluant l’épilepsie, le syndrome de Rett et la schizophrénie. La compréhension des mécanismes moléculaires régissant le développement des circuits GABAergiques est une étape essentielle menant vers une meilleure compréhension de la façon dont les anormalités se produisent. Conséquemment, nous nous intéressons au rôle de l’acide polysialique (PSA) dans le développement des synapses GABAergiques. PSA est un homopolymère de chaînons polysialylés en α-2,8, et est exclusivement lié à la molécule d’adhésion aux cellules neuronales (NCAM) dans les cerveaux de mammifères. PSA est impliqué dans plusieurs processus développementaux, y compris la formation et la plasticité des synapses glutamatergiques, mais son rôle dans les réseaux GABAergiques reste à préciser. Les données générées dans le laboratoire du Dr. Di Cristo démontrent que PSA est fortement exprimé post- natalement dans le néocortex des rongeurs, que son abondance diminue au cours du développement, et, faits importants, que son expression dépend de l’activité visuelle i et est inversement corrélée à la maturation des synapses GABAergiques. La présente propose de caractériser les mécanismes moléculaires régulant l’expression de PSA dans le néocortex visuel de la souris. Les enzymes polysialyltransférases ST8SiaII (STX) et ST8SiaIV (PST) sont responsables de la formation de la chaîne de PSA sur NCAM. En contrôlant ainsi la quantité de PSA sur NCAM, ils influenceraient le développement des synapses GABAergiques. Mon projet consiste à déterminer comment l’expression des polysialyltransférases est régulée dans le néocortex visuel des souris durant la période post-natale; ces données sont à la fois inconnues, et cruciales. Nous utilisons un système de cultures organotypiques dont la maturation des synapses GABAergiques est comparable au modèle in vivo. L’analyse de l’expression génique par qPCR a démontré que l’expression des polysialyltransférases diminue au cours du développement; une baisse majeure corrélant avec l’ouverture des yeux chez la souris. Nous avons de plus illustré pour la première fois que l’expression de STX, et non celle de PST, est activité-dépendante, et que ce processus requiert l’activation du récepteur NMDA, une augmentation du niveau de calcium intracellulaire et la protéine kinase C (PKC). Ces données démontrent que STX est l’enzyme régulant préférentiellement le niveau de PSA sur NCAM au cours de la période post-natale dans le cortex visuel des souris. Des données préliminaires d’un second volet de notre investigation suggèrent que l’acétylation des histones et la méthylation de l’ADN pourraient également contribuer à la régulation de la transcription de cette enzyme durant le développement. Plus d’investigations seront toutefois nécessaires afin de confirmer cette hypothèse. En somme, la connaissance des mécanismes par lesquels l’expression des ii polysialyltransférases est modulée est essentielle à la compréhension du processus de maturation des synapses GABAergiques. Ceci permettrait de moduler pharmacologiquement l’expression de ces enzymes; la sur-expression de STX et/ou PST pourrait produire une plus grande quantité de PSA, déstabiliser les synapses GABAergiques, et conséquemment, ré-induire la plasticité cérébrale. / The functioning of the cerebral cortex requires coordinated action of two major neuronal subtypes - the glutamatergic projection neurons and the GABAergic interneurons. GABAergic interneurons represent 20 to 30% of all cortical cells. Even though they are a minor cell population in the cerebral cortex compared to glutamatergic neurons, they are key modulators of network dynamics and plasticity of neocortical circuits. It is therefore not surprising that aberrant development of GABAergic circuits is implicated in many neurodevelopmental disorders including epilepsy, Rett syndrome and schizophrenia. Understanding the molecular mechanisms governing the development of GABAergic inhibitory synapses in neocortex is important towards a better comprehension of how abnormalities in this developmental process can occur. Therefore, we focus specifically on the role of polysialic acid (PSA) in the development of GABAergic synapses. PSA is a α-2,8 polysialylated homopolymer, which is exclusively linked to the Neural Cell Adhesion Molecule (NCAM) in the mammalian brain. It is involved in several developmental processes including formation and plasticity of glutamatergic synapses; however its role in GABAergic circuit formation has not been explored so far. Previously in Dr Di Cristo’s lab, we showed that PSA is strongly expressed post-natally and its expression steadily declines during development in mice neocortex. We also showed that the developmental and activity-dependant regulation of PSA expression is inversely correlated with the maturation of perisomatic GABAergic innervation. Our aim is to characterize the molecular mechanisms regulating PSA expression in mouse iv visual cortex during post-natal development. Two polysialyltransferases, ST8SiaII (STX) and ST8SiaIV (PST), are responsible for PSA attachment to NCAM. By controlling the amount of PSA on NCAM, they can influence GABAergic synapses development. The mechanisms regulating STX and PST expression is crucial but remain still unknown. My research project focused on the mechanisms regulating STX and PST transcription in the mouse postnatal cortex. We used an organotypic culture system, which recapitulates many aspects of GABAergic synapse maturation as observed in vivo. Polysialyltransferases transcript levels were measured by qPCR and showed that STX and PST mRNA levels steadily decline during post-natal development in the mouse cortex; the sharpest reduction in the expression of both enzymes correlate with eye opening. We further demonstrate for the first time that STX mRNA levels is activity-dependant, requires the activation of NMDA receptors, an increase in intracellular Calcium levels and is PKC-dependent. Altogether, we show that the regulation of the expression of STX is the main mechanism responsible for PSA expression levels in the cortex around eyes opening. We next investigated whether epigenetic mechanisms regulate STX transcription and preliminary data suggest that histone acetylation and DNA methylation may contribute to STX expression during development. However, further experiments are required to confirm this hypothesis. In summary, understanding the mechanisms modulating STX and PST expression in the neocortex is essential for the comprehension of their precise role in GABAergic synapse maturation. This knowledge could allow us to modulate pharmacologically the expression of these enzymes; in turn overexpression of STX and PST may re-induce PSA expression, thereby destabilizing GABAergic synapses, and ultimately facilitating cortical plasticity in the adult.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La variation phénotypique est essentielle à la persistance des organismes dans le temps ainsi qu’à la colonisation de nouveaux habitats. Les principales sources de variation phénotypique sont la génétique et l'épigénétique. L'épigénétique a été proposé comme un atout important pour les organismes asexués pour compenser le manque de diversité génétique. L'objectif de cette étude est d'évaluer si l’absence de variation génétique est compensée par l'épigénétique en comparant les profils de méthylation d’individus gynogènes et kleptogènes des hybrides de salamandre à points bleus. Les individus échantillonnés s’organisent en cinq groupes génétiquement différenciés, provenant du même haplome paternel A. jeffersonianum. Deux des cinq groupes sont exclusivement gynogènes, pour des raisons écologiques ou génomiques. Les trois autres groupes sont formés d’individus parfois kleptogènes, car ils présentent une variation génétique plus élevée au sein d’un site qu’entre les sites, en plus de porter des allèles très divergents par rapport à la distribution globale des allèles hybrides, trouvés en haute fréquence dans les populations sympatriques de A. laterale. Les patrons épigénétiques sont variables et distincts entre les cinq groupes génétiques. Les groupes gynogènes sont les seuls à présenter un effet environnemental significatif sur leurs patrons épigénétiques, suggérant que ces individus clonaux doivent être en mesure de maximiser leur potentiel de variation épigénétique pour faire face à des variations environnementales. / Phenotypic variation is critical to the persistence of organisms over time and the colonization of new habitats. The main consistent sources of phenotypic variation are genetics and epigenetics. Epigenetics was proposed as a valuable asset for asexual organisms to compensate or to complete genetic diversity. The objective of this study is to assess whether lack of genetic variation is compensated by epigenetics by comparing methylation patterns of gynogen and kleptogen individuals of the blue-spotted salamander hybrids. Individuals sampled clustered in five genetically differentiated groups, derived from the very same paternal A. jeffersonianum haplome. Two out of the five groups are exclusively gynogenetic, for either ecological or genomic factors. The other three groups occasionally formed kleptogen individuals, since they display a higher genetic variation within sites than among sites, in addition of displaying highly divergent alleles found in high frequency in the sympatric A. laterale populations. Epigenetic patterns are variable and distinct among the five genetic groups. Gynogenetic groups are the only one to display a significant environmental effect on their epigenetic pattern, suggesting clonal individuals must be able to make the most from their epigenetic variation potential to deal with environmental variations.

Chez les plantes et les mammifères, la méthylation de l’ADN est une modification chromatinienne qui joue un rôle pivot dans le maintien de l’intégrité des génomes, notamment au travers de l’extinction épigénétique des éléments transposables (ET). Cependant, dans la mesure où la désamination spontanée des cytosines méthylées, qui peut conduire à des transitions C>T, est plus fréquente que celle des cytosines non méthylées, la méthylation est également intrinsèquement mutagène. Cette mutabilité accrue est de fait très certainement à l’origine de la déplétion en dinucléotides CpG observée dans les génomes de mammifères, naturellement méthylés à ces sites sauf au sein des «îlots CpG». A l’exception de cet effet bien connu, aucune étude à ce jour n’a exploré directement et de façon exhaustive l’impact de la méthylation sur le spectre des mutations spontanées. Dans ce travail, je tire profit d’une population de lignées epiRIL (epigenetic recombinant inbred lines) établie chez la plante Arabidopsis pour évaluer à l’échelle du génome l’impact de la méthylation de l’ADN sur le paysage mutationnel. Les epiRILs dérivent du croisement entre deux parents quasi- isogéniques, l’un sauvage et l’autre porteur d’une mutation conduisant à une réduction de 70% de la méthylation du génome, et il a pu être mis en évidence que des différences parentales de méthylation pouvaient être héritées de façon stable pour >1000 régions le long du génome. Au moyen de données de séquençage disponibles pour >100 epiRIL, j’ai effectué la caractérisation exhaustive des variants ADN (autres qu’ET) uniques à chaque lignée mais également en ségrégation parmi les epiRIL, ce qui constitue à terme une ressource pour les différentes équipes qui utilisent cette population. En analysant le patron de variants uniques, j’ai mis en évidence une réduction spécifique du taux de transitions C>T en lien avec l’hypométhylation stable dans les epiRIL. J’ai aussi pu décrire que si la remobilisation extensive des ET dans cette population a modelé le spectre des insertions et délétions ponctuelles, elle ne se traduit pas pour autant par des réarrangements récurrents. Je présente également les développements méthodologiques mis en place afin d’effectuer la caractérisation de QTL (quantitative trait loci) “épigénétiques” préalablement identifiés dans la population. / In both plants and mammals, DNA methylation plays a pivotal role in ensuring proper genome function and integrity, notably through the epigenetic silencing of transposable elements (TEs). However, as spontaneous deamination of 5- methylcytosine (5mC), which can lead to C>T transitions, is more frequent than that of unmethylated C, DNA methylation is also inherently mutagenic. This higher mutability of 5mC has indeed been proposed to explain the depletion in CpG dinucleotides in mammalian genomes, which are typically methylated at these sites except in socalled CpG islands. Despite this well-characterized effect of DNA methylation, we still lack a comprehensive view of its impact on the whole mutation spectrum in any given organism. Here, I take advantage of a population of so-called epigenetic Recombinant Inbred Lines (epiRILs) established in the flowering plant Arabidopsis thaliana to investigate the impact of DNA methylation on the spectrum of spontaneous mutations genome wide. The epiRIL population derives from a cross between a wild-type individual and a near-isogenic mutation deficient in DNA methylation, and it could be shown that parental differences in DNA methylation are stably inherited for at least 8 generations over >1000 regions across the genome. Building on whole-genome sequencing data available for >100 epiRILs, I performed a thorough characterization of non- TE DNA sequence variants that are either private to one line or segregating in the population, therefore establishing a resource for research groups that make use of the epiRIL population. Based on the pattern of private variants, I show a specific reduction in the rate of C>T transitions in the epiRILs, in line with the heritable hypomethylation in this population. I also describe that the extensive TE remobilisation at play among the epiRILs shapes the spectrum of short insertions and deletions yet does not translate into recurrent large-scale mutation events. On another note, I also present methodological developments aimed towards the identification of causal (epi)variants underlying so-called “epigenetic QTL” (quantitative trait loci) previously described in the epiRIL population.

Le cancer, principale cause de mortalité dans le monde, est un problème majeur de santé publique. Malgré les nombreux traitements disponibles, il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies plus efficaces et moins envahissantes. Aujourd’hui la connaissance du génome humain a dirigé la recherche vers de nouvelles approches: il est possible de moduler la réponse biologique en contrôlant l'accès aux informations génétiques via la régulation épigénétique.L’épigénétique est l’ensemble des modifications de l’expression des gènes n’entraînant pas de modifications dans la séquence d’ADN, qui mènent à un phénotype héritable et stable. Chez les eucaryotes, la régulation épigénétique implique des modifications covalentes de l'ADN (méthylation) et des histones (acétylation, méthylation…). Ces phénomènes modifient la structure de la chromatine, aboutissant à une configuration "ouverte" ou "fermée" permettant la transcription ou la répression de gènes. Dans une situation cancéreuse, le profil épigénétique est modifié ; la méthylation anormale de l’ADN ou des histones mène à la répression de certains gènes comme des gènes suppresseurs de tumeur, ou à l’expression des oncogènes. Contrairement aux changements génétiques irréversibles, les aberrations épigénétiques sont des modifications chimiques réversibles. Ainsi, des molécules capables de rétablir l'équilibre épigénétique représentent des outils thérapeutiques potentiels contre le cancer.La méthylation et l’acétylation sont les modifications épigénétiques les plus étudiées. La méthylation de l’ADN est catalysée par les ADN méthyltransférases (DNMTs), et la méthylation des histones par les histones méthyltransférases (HMTs).Le sujet de ce projet doctoral est porté sur les HMTs et en particulier sur DOT1L (DOT1 like, disruptor of telomericsilencing), responsable des méthylations du résidu Lys79 de l’histone 3 (H3K79), conduisant à la transcription des oncogènes. En effet, des études ont montré que DOT1L est liée à la leucémie et se révèle être une cible intéressante à inhiber. DOT1L comme les DNMT ont un même cofacteur : le SAM (S-adénosyl-L-méthionine). Certains de leurs inhibiteurs présentent un mécanisme d'inhibition commun : ils entrent en compétition avec SAM.Nous présentons la conception basée sur des études de modélisation moléculaire, et la synthèse multi-étapes des séries des molécules formées par 3 motifs principaux : a) un motif aminopyrimidine, b) un motif de type benzimidazole ou phénylurée, liés par c) un groupement phényle ou hétérocyclique. L’activité des composés synthétisés sur DOT1L a été évaluée et des relations structure-activité (RSA) ont été établies. L’activité sur DNMT et d’autres HMTs a été déterminée également afin d’étudier la spécificité de nos composés.Différents structures ont été identifiées comme point de départ pour aboutir à des inhibiteurs sélectives de DOT1L ou à des inhibiteurs mixtes DOT1L/DNMT. Ces molécules sont considérées comme des outils thérapeutiques intéressants dans le traitement du cancer. / Cancer is a serious issue of public health as it is one of the main causes of mortality worldwide. Despite the multiple available treatments, it is necessary to develop more efficient and less invasive therapies against cancer. The knowledge of the human genome and epigenome has directed research to new cancer treatment approaches: it is possible to modulate the biological outcome by controlling the access to the genetic information by means of the epigenetic regulation.Epigenetics are the changes happening on the genome without modifying its DNA sequence, leading to a heritable andstable phenotype. In the eukaryotic chromatin, epigenetic regulation implies covalent modifications of DNA and histones. These chemical modifications remodel the chromatin structure leading to an “opened” or “closed” configuration, which is related to the expression or repression of genes. The epigenetic landscape is altered in cancers; for example, abnormal methylation leads to the silencing of certain genes (such as tumor suppressor genes), or to the over-expression of oncogenes. Unlike genetic alterations that are irreversible, epigenetic aberrations are reversible. Thus, molecules that can reestablish the epigenetic balance represent potent therapeutic tools for cancer treatment.Methylation and acetylation are the most studied epigenetic modifications. DNA methylation is carried out by the DNAmethyltransferases (DNMTs) and histone methylation by the histone methyltransferases (HMTs).This PhD project was focused on the histone methyltransferase DOT1L (DOT1 like, disruptor of telomeric silencing), responsible of methylation of residue Lys79 of histone 3 (H3K79), which leads to the transcription of some oncogenes. Recent studies have shown that DOT1L is implicated in MLL-rearranged leukemia (MLL-r, Myeloid-Lymphoid Leukemia) thus it is a potent target in cancer. As DOT1L and DNMTs share the same cofactor, S-adenosyl-L-methionine (SAM), DNMT and DOT1L inhibitors can present a common inhibition mechanism by competing with SAM.We present herein the in silico – based design, and the multi-step synthesis of some series of molecules containing 3 main moieties: a) an aminopyrimidine motif and b) a benzimidazole or phenylurea motif, linked by c) a phenyl or heterocycle motif. DOT1L activity was determined for the different compounds synthesized and structure-activity relationships (SAR) were established. The activity on DNMT and other HMTs was determined as well, in other to study the DOT1L specificity of our compounds.Different scaffolds were identified to obtain DOT1L-selective or DOT1L/DNMT dual inhibitors. These molecules are interesting therapeutic tools for cancer treatment.

L'une des stratégies mise en œuvre pour améliorer la prise en charge thérapeutique des patients concerne le développement d'outils diagnostiques sensibles et spécifiques. Les aptamères sont des oligonucléotides artificiels obtenus par SELEX avec une très haute affinité ainsi qu'une excellente spécificité pour leurs cibles. L'immobilisation de ces motifs de reconnaissance moléculaire à la surface de nanomatériaux tels que des nanoparticules d'or (AuNPs), dont les propriétés optiques et électroniques sont uniques, permet d'amplifier le signal généré par l'interaction du ligand avec sa cible. Deux systèmes de biosensing ont été élaboré en fonctionnalisant des AuNPs avec des aptamères, l'un dirigé contre la thrombine et le second dirigé contre une marque épigénétique portée par une protéine histone. La réduction des sels d'or aurique précurseurs a été réalisée en présence de PEG4 et a conduit à l'obtention d'une population homodisperse de AuNPs sphériques d'un diamètre moyen de 14 nm et présentant une isotropie de taille et de forme. Ces AuNPs ont ensuite été fonctionnalisées par des bras espaceurs de longueur variable constitués d'unités tétraéthylène glycol successives reliées entre elles par des ponts éthers ou triazoles. L'acide lipoique a été utilisé comme motif d'ancrage à la surface des AuNPs via une liaison covalente Au-S et a été couplé aux différents bras espaceurs via une réaction de Steglich. Les linkers étaient porteurs d'un groupement terminal azoture afin de réaliser le couplage par chimie-click avec les aptamères. La stratégie de détection de la thrombine utilisait les propriétés de quenching de fluorescence des AuNPs alors que la détection de l'histone était colorimétrique et mettait à profit l'effet de résonance plasmonique de surface des nanoparticules d'or. / Improving patients therapeutic care needs the development of sensitive and specific diagnostic tools. Aptamers are synthetic oligonucleotides obtained by SELEX with a very high affinity and excellent specificity for their targets. Grafting of these molecular recognition patterns onto nanomaterials such as gold nanoparticles (GNPs), which unique optical and electronic properties, can amplify the signal induce by the interaction between the ligand and its target. Two biosensing systems have been developed by GNP functionalization with aptamers, one is directed against thrombin and the second against an epigenetic mark carried by a histone protein. Gold precursors was reduced in the presence of PEO4 and led to a homodisperse population of spherical GNP with an average diameter of 14 nm and an isotropy of size and shape. GNP were functionalized with tetraethylene glycol units interconnected by ether or triazoles bridges as a linker. Lipoic acid was used as an anchor moiety onto gold surface via a covalent Au-S bond and was coupled to the spacer through a Steglich reaction. The linkers were functionalized with an azide group to perform the coupling with aptamers by click chemistry. The thrombin sensing strategy used the fluorescence quenching properties of GNPs while the histone detection involved the gold nanoparticle plasmon resonance surface effect.

Les donneurs de méthyles (B12 et folates) régulent le cycle des monocarbones qui joue un rôle primordial dans les régulations épigénétiques/épigénomiques par méthylation. Une carence en donneurs de méthyles produit un retard de croissance intra-utérine et favorise les anomalies du développement, principalement du système nerveux central. De plus, des taux élevés d'homocystéine associés à une telle carence constituent un facteur de risque pour diverses pathologies neurodégénératives. Nous avons étudié les conséquences d'une carence péri-conceptionnelle et gestationnelle sur le développement cérébral embryonnaire de rats Wistar. L'étude morphométrique a montré un retard de croissance des embryons carencés qui affectait également le cerveau, avec une atrophie de structures telles que l'hippocampe, le cortex et la zone subventriculaire. En raison de la forte sensibilité de l'hippocampe, les effets de la carence ont par ailleurs été étudiés sur un modèle cellulaire de progéniteurs neuronaux hippocampiques. L'utilisation de ces deux modèles a permis de montrer in vivo et in vitro la régulation négative par la carence de la voie Stat3, qui influence prolifération et survie, via une régulation épigénomique post-transcriptionnelle impliquant miR-124. La dérégulation du programme neurogénique impliquant les histones désacétylases affecte la différenciation cellulaire. Par ailleurs, nous avons démontré que la carence en donneurs de méthyles était associée à une modification post-traductionnelle correspondant à une N-homocystéinylation irreversible de protéines neuronales, en particulier associées au cytosquelette. Cette modification induit l'agrégation des protéines, phénomène impliqué dans de nombreuses maladies neurodégénératives. La combinaison de ces différents mécanismes apporte un éclairage nouveau sur les défauts de développement et les troubles cognitifs associés à une carence précoce en donneurs de méthyles, soulignant l'importance de la « programmation foetale » dans la survenue de certaines pathologies neurologiques / Methyl donors (B12 and folate) regulate the one-carbon cycle that plays an important role in the epigenetic/epigenomic regulations by methylation. Methyl donor deficiency (MDD) leads to intrauterine growth retardation and promotes neurodevelopmental abnormalities. Also, high levels of homocysteine associated with such a deficiency are a risk factor for various neurodegenerative diseases. We have studied the consequences of a periconceptional and gestational deficiency on the development of the embryonic brain of Wistar rats. Morphometric studies showed retardation in the development of deficient embryos which also affected the brain, with an atrophy of some structures including hippocampus, cortex and subventricular zone. Given the high sensitivity of the hippocampus, the effects of MDD have been additionally studied in a cellular model of hippocampal neuronal progenitors. Using these two models, we showed both in vivo and in vitro the downregulation of Stat3 pathway regulating cell proliferation and survival, through an epigenomic post-transcriptional process involving miR-124. Disruption of the neurogenic program implying histone deacetylases was shown to alter cell differentiation. Furthermore, we showed that methyl donor deficiency was associated with a post-translational modification corresponding to an irreversible N- homocysteinylation of neuronal proteins, especially those associated with the cytoskeleton. Such a process leads to protein aggregation, a phenomenon involved in many neurodegenerative diseases. The combination of these different mechanisms provides new insights into developmental defects and cognitive impairment associated with an early MDD, highlighting the importance of "fetal programming" in the occurrence of some neurological diseases

Les carences précoces en donneurs de méthyles (vitamines B9 et B12 notamment) sont à l’origine de malformations congénitales. Elles exercent un effet délétère sur le développement du cerveau et sont associées à une augmentation de l’incidence de pathologies neurologiques et neurodégénératives à l’âge adulte. Un modèle murin de carence en donneurs de méthyles, le modèle MDD, a été développé au laboratoire et a permis d’étudier la réponse à cette carence, et de mettre en évidence des altérations de la structure cérébrale et des défauts de locomotion chez les ratons issus de mères carencées. Ce comportement est contrôlé par le cervelet, dont on sait que le développement est altéré chez les MDD. En revanche, les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la réponse à la carence dans le cervelet restent peu compris. Afin d’étudier les gènes et voies de signalisation dérégulés chez les MDD, nous avons réalisé l’étude du transcriptome du cervelet des ratons carencés. Puis, nous nous sommes intéressés aux modifications épigénomiques engendrées par la carence en analysant leur miRnome et les modifications des protéines histones dans leur cervelet. Nous avons mis en évidence des altérations des voies wnt, dans le cervelet des femelles carencées, qui n’ont pas été retrouvées chez les mâles. De même, de nombreux gènes impliqués dans le développement et les fonctions synaptiques sont dérégulés chez les femelles. Nous avons aussi montré des variations de plusieurs marques d’acétylation et de méthylation des histones chez les MDD. Enfin, de manière plus ciblée, nous avons mis en évidence un miARN dont l’expression diminue dans le cervelet des ratons carencés : miR-344-5p. Nos premiers résultats semblent indiquer qu’il est impliqué dans le contrôle de la mort cellulaire. Ces résultats montrent l’implication de dérégulations globales dépendantes du sexe mais aussi des altérations ciblées dans la réponse à la carence. Une amélioration de la compréhension de ces mécanismes moléculaires nous permettra de mieux appréhender le lien qui existe entre carence précoce en donneurs de méthyles, développement cérébral et incidence de pathologies à l’âge adulte / Early methyl-donor deficiencies (e.g. B9 and B12 vitamins) can lead to congenital disabilities. They are behind developmental abnormalities of the brain, and are associated with the development of neurological and neurodegenerative diseases at adulthood as well. In the lab, we developed a methyl donor deficiency rat model called MDD. It has allowed us to show structure alterations of several brain areas and also locomotor coordination impairments in pups born from dams fed a MDD diet. Cerebellum is the brain structure involved in the control of this behavior and we know its development is delayed in MDD. However, the molecular mechanisms underlying methyl donor deficiency still remain misunderstood in this brain structure. In order to study genes and signaling pathways dysregulated in MDD, we performed transcriptomic analysis of deficient pups’ cerebellum. We also led miRnome analyses and histone modifications investigations with the purpose of understanding epigenomic modifications caused by MDD. We showed alterations of wnt signaling pathways in female’s cerebellum which we did not find in males. We also found that several genes involved in cerebellum’s development and synaptic function were dysregulated in females. Regarding epigenomic regulation, acetylation and methylation of histone marks were also modified in females. Finally, we chose miR-344-5p as an interesting candidate to study more specific epigenetic modifications. Its expression is decreased in MDD and it seems to be involved in cellular death control, according to our first results. These results shed light on global dysregulations, in a sex-dependent manner, as a consequence of methyl donor deficiency but also more specific alterations. A better understanding of the molecular mechanisms taking place in response to MDD could help us to link methyl donor deficiency, brain development and neurodegenerative pathologies occurrence at adulthood