La spermatogenèse est un processus complexe qui dépend de la coopération de nombreux gènes. Son produit final le spermatozoïde, est un sujet d’étude idéal car il renferme à la fois des indices d’événements passés ainsi que des informations qui seront transmises à l'ovocyte lors de la fécondation. L'identification de nouveaux acteurs de la spermatogenèse, des modifications spécifiques de l'ADN du sperme ou la présence de transcrits spécifiques pourraient servir comme biomarqueurs dans le diagnostic de l’infertilité. Cette thèse avait pour but d’analyser le génome, le transcriptome et l’épigénome de spermatozoïdes dans le contexte de l'infertilité masculine. Nous avons identifié de nouvelles causes génétiques et confirmé la présence d'anomalies de méthylation dans le sperme d'hommes infertiles. Nous avons découvert 20 mutations dans le gène SOX8, chez des patients atteints de trouble du développement sexuel ou d'infertilité masculine ou féminine, qui apparaît comme un régulateur du développement et de la fonction gonadique. Par séquençage d’exome, une mutation dans le gène ATAD2 modeleur de la chromatine spécifique de la lignée germinale mâle fut également identifiée. Par RNA-seq et MeDIP-chIP du sperme d’hommes fertiles et infertiles, nous avons caractérisé la signature transcriptionnelle du sperme. La majorité des ARNs spermatiques humain est remarquablement conservée chez les mammifères placentaires suggérant des fonctions ancestrales importantes. Enfin, nos données transcriptomiques et épigénétiques tendent à indiquer qu’une expression et une régulation adéquates des gènes impliqués dans le remodelage de la chromatine constituent un facteur clé pour la fertilité masculine. / Spermatogenesis is a complex process which depends on the cooperation of many genes. The end-product, the spermatozoon, is an ideal subject for study since it carries both clues of the past events and information which will be transmitted to the oocyte at fertilization. The identification of main actors of spermatogenesis, specific modifications of sperm DNAs or sperm specific isoforms could improve our understanding of a such complex mechanism and could serve as a determination of biomarkers or diagnostic tools for fertility. The aim of the project was to go further three omes: genome, epigenome and transcriptome of mature human sperm in the context of male infertility. We identified new genetic causes of male infertility and confirmed the presence of methylation abnormalities in sperm cells of infertile men. Firstly, SOX8 gene was found mutated in a cohort of 20 patients with disorder of sex development and male or female infertility. Similarly, to NR5A1, SOX8 appears to be a novel regulator of gonadal development and function. Then by exome-sequencing, we identified a homozygous nonsense mutation in the male germline-specific chromatin modeler ATAD2. Furthermore, RNA-seq and MeDIP-chIP of sperm from fertile and infertile men along with bioinformatics analyzes of the generated data, enabled us to characterize more deeply the normal sperm transcriptional signature. We also found that the majority of human sperm RNAs are remarkably preserved in placental mammals suggesting crucial ancestral functions. Finally, proper expression and regulation of chromatin remodelers seem to be critical for male fertility, as revealed by both the transcriptomic and the epigenetic data.

Les protéines du groupe Polycomb (PcG) sont des facteurs épigénétiques dont le rôle est de maintenir la répression de leurs gènes cibles au niveau de la chromatine via la modification des protéines histones. EZH2 est une protéine clé dans les mécanismes de régulation puisqu’elle catalyse la mise en place de la marque répressive H3K27me3. Dans le cadre de ma thèse, je me suis intéressée au modèle des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) dans lesquelles, contrairement à d’autres pathologies myéloïdes, des mutations affectant EZH2 ou des membres Polycomb ne sont retrouvées que très rarement (˂1%). Des études ont montré que dans ce type de leucémies, de nombreux gènes cibles d’EZH2 sont dérégulés bien que son activité répressive soit toujours présente, mettant en évidence d’éventuels défauts de recrutement de cette protéine. Parmi les facteurs de transcription susceptibles de réguler l’association des protéines PcG à la chromatine, se trouve PLZF qui est un candidat intéressant. En effet, le laboratoire a mis en évidence une interaction entre PLZF et la protéine Polycomb BMI-1 et a montré que la distribution génomique de PLZF concorde avec celle de certains composants des Polycomb. L’objectif de mon travail de thèse a donc été de déterminer dans quelle mesure PLZF intervient dans le recrutement ou l’activité d’EZH2. / Polycomb group (PcG) proteins are epigenetic factors which play a major role in maintaining epigenetic silencing via histone modifications at the chromatin level. EZH2 is a key regulator that catalyzes the trimethylation of H3K27, which is a repressive mark. During my PhD, I was interested in the acute myeloid leukemia (AML) model in which, unlike other myeloid malignancies, EZH2 or other PcG protein mutations are very rare (˂1%). Studies have shown that in this type of leukemia, many of EZH2 target genes are deregulated although its repressive activity is still present highlighting possible EZH2 recruitment defects. Among the transcription factors that regulate the association of PcG proteins to chromatin, the transcription factor PLZF is an interesting candidate. Indeed, the laboratory has demonstrated an interaction between PLZF and the Polycomb protein BMI -1 and showed that the genomic distribution of PLZF is consistent with that of some Polycomb components. The aim of my thesis was therefore to determine in which extent PLZF is involved in the recruitment or activity of EZH2.

Les éléments transposables d’ADN sont presque ubiquitaires dans le monde vivant et leur mobilité peut être délétère pour le génome. Leur régulation dans les tissus germinaux animaux passe par la voie de silencing des piRNAs (PIWI-interacting RNAs). Les piRNAs sont produits à partir de loci contenant des fragments d’éléments transposables insérés en clusters. Nous étudions l’émergence de ces clusters de piRNAs chez la drosophile.Nous avons activé de novo un cluster de transgènes par héritage maternel de piRNAs homologues. Il s’agit d’un cas de paramutation, ou conversion épigénétique stable et récurrente.Nous avons montré que ce cluster paramuté produit de novo des piRNAs, et étonnement dessiRNAs.J’ai caractérisé de façon fonctionnelle et moléculaire ce phénomène de paramutation par l’utilisation de mutants. J’ai montré que les propriétés de silencing, ainsi que la production depiRNAs et de siRNAs, sont abolies en contexte mutant pour tous les gènes testés de la voie despiRNAs (voies primaire et secondaire). Parallèlement, j’ai étudié un cas de paramutation« partiellement homologue » dans laquelle le cluster reçoit des piRNAs homologues seulement àune partie de sa séquence. J’ai montré qu’il y a production de piRNAs par la totalité du cluster dès la 3e génération.J’ai montré, enfin, que des clusters activés de novo par la chaleur, présentent des propriétés fonctionnelles et moléculaires semblables aux clusters activés par les piRNAsmaternels.Ces travaux apportent des éléments clés pour la compréhension de la mise en place de l’épigénome, tant d’un point de vue mécanistique qu’évolutif. / DNA transposable elements are almost ubiquitous in the living world and their mobility can be deleterious for the genome. Their regulation in germaria is mediated by the piRNAsilencing pathway (PIWI-interacting RNAs). piRNAs are produced by loci formed by clusters of fragments of transposable elements. We are studying the emergence of these piRNA-producing clusters in Drosophila.We have de novo activated a cluster of transgenes via maternal inheritance of homologous piRNAs. This is a case of paramutation i.e. a stable and recurrent epigenetic conversion process.We have shown that this paramutated cluster produces de novo piRNAs and, surprisingly, also siRNAs. I have characterized this paramutation functionally and molecularly, by a mutant approach. I have shown that its silencing properties, as well as piRNA and siRNA production are abolished in mutant contexts for all the genes from the primary and secondary piRNA pathways I have tested. At the same time, I have studied the case of a partially homologous paramutation, in which piRNAs maternally inherited by the cluster are homologous to only a part of its sequence. I have shown that piRNA are produced all along the cluster as early as the 3rdgeneration.Finally, I have shown that a cluster activated de novo by an environmental stress shows the same functional and molecular properties as a cluster paramutated via maternal piRNA inheritance.These studies provide key elements for understanding the emergence of the epigenome from a mechanistic and an evolutionary perspective.

Botrytis cinerea est un champignon nécrotrophe et polyphage capable de provoquer la pourriture grise sur plusieurs centaines d’espèces végétales. Les pertes engendrées par cette maladie sont importantes à travers le monde notamment sur des espèces économiquement importantes comme la tomate, la fraise ou encore la vigne. Parmi les facteurs de virulence identifiés chez B. cinerea se trouvent deux toxines non-hôte spécifiques. Il s'agit du sesquiterpène botrydial et du polycétide acide botcinique. Même si leur rôle redondant dans la nécrotrophie a été démontré, les mécanismes qui gouvernent l’expression des clusters responsables de leur synthèse (respectivement BOT et BOA) restent inconnus. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de thèse était de caractériser les différents mécanismes qui régulent le métabolisme secondaire chez B. cinerea. Je me suis particulièrement intéressé aux clusters BOT et BOA ainsi qu’à un troisième cluster (PKS7) qui, d’après le phénotype d’un mutant d’insertion (ADN-T), pourrait être impliqué dans la nécrotrophie. Grâce à la disponibilité du nouvel assemblage du génome de la souche modèle B05.10, un gène candidat codant un facteur de transcription (FT) putatif a pu être identifié à proximité du cluster BOT. La caractérisation de ce gène a permis de démontrer le rôle majeur de la protéine (BcBot6) dans l’activation des gènes Bcbot et la production subséquente de botrydial. De même, la caractérisation de Bcboa13, un gène codant un FT putatif présent au sein du cluster BOA, a permis de démontrer le rôle de régulateur positif de BcBoa13 envers les gènes Bcboa. A la différence des clusters BOT et BOA, le cluster PKS7 ne contient pas de gène codant pour un potentiel FT spécifique. Afin de confirmer le rôle du métabolite putatif produit par ce cluster et d’identifier sa structure chimique, l’inactivation du gène clé codant une PKS-NRPS (Bcpks7) a été réalisée et des analyses métaboliques ont été initiées. Finalement, la présence au sein des clusters BOT et BOA de nombreux transposons ayant subi des mutations de type RIP (Repeat-Induced Point mutations) ainsi que la position sub-télomérique des clusters BOA et PKS7 nous a amené à nous intéresser au rôle de la structure chromatinienne dans la régulation de ces clusters. Dans ce cadre, trois mutants délétés dans des gènes codant des modificateurs chromatiniens putatifs (les histones méthyltransférases BcDim-5 et BcKmt6 et la protéine hétérochromatinienne BcHp1) ont été générés. L’expression des gènes clés des clusters BOT, BOA et PKS7 chez les mutants Bcdim-5, Bchp1 et Bckmt6 suggère que différents mécanismes chromatiniens interviennent pour le contrôle des clusters BOT et BOA d’une part et du cluster PKS7 d’autre part. L’ensemble des résultats obtenus pendant cette thèse apporte une contribution majeure à la compréhension des mécanismes de régulation spécifiques mais aussi de ceux en lien avec la structure chromatinienne de la production de métabolites phytotoxiques impliqués dans la nécrotrophie chez B. cinerea. / Botrytis cinerea is a necrotrophic polyphagous fungus able to induce the gray mold disease on hundreds of plant species. The resulting losses are important worldwide notably on economically important crops such as tomato, strawberry or grapevine. Among the virulence factors identified in B. cinerea stand two non-host specific toxins: the sesquiterpene botrydial and the polyketide botcinic acid. Although their redundant role in necrotrophy has been shown, the mechanisms governing the clusters responsible for their synthesis (respectively BOT and BOA) remain unknown. In this context, the aim of my PhD project was to characterize the different mechanisms that regulate secondary metabolism in B. cinerea. I particularly focused on BOT and BOA clusters as well as on a third one (PKS7) which, according to the phenotype of an insertion-based mutant (T-DNA), could be involved in necrotrophy. Thanks to the newly assembled genome of the B05.10 wild type strain, a candidate gene encoding a putative transcription factor (TF) could be identified near the BOT cluster. The characterization of this gene allowed pointing out the major role of the protein (BcBot6) in the activation of Bcbot genes and in the subsequent botrydial production. Similarly, the characterization of Bcboa13, a putative TF-encoding gene present into the BOA cluster, allowed demonstrating the positive regulatory role of BcBoa13 on Bcboa genes. Unlike the BOT and BOA clusters, the PKS7 one does not contain any putative TF-encoding gene. In order to confirm the role of the putative metabolite produced by this cluster and to identify its chemical structure, the inactivation of the PKS-NRPS key enzyme-encoding gene (Bcpks7) was conducted and metabolic analyses were initiated. Finally, the presence of many RIP(Repeat-Induced Point mutations)-inactivated transposons within BOT and BOA clusters as well as the subtelomeric location of BOA and PKS7 clusters raised our interest about the role of chromatin structure on those clusters regulation. In this context, three mutants inactivated into putative chromatin modifiers encoding-genes (the histone methyltransferases BcDim-5 and BcKmt6 and the heterochromatin protein BcHp1) were generated. The expression analysis of the key genes of the BOT, BOA and PKS clusters suggests different chromatin-based mechanisms that intervene for the BOT and BOA cluster on one side and on the PKS7 cluster on another. Altogether, the results generated during this PhD project are a major contribution to the comprehension of pathway-specific as well as chromatin-based mechanisms that regulate the production of necrotrophy-involved phytotoxins by B. cinerea.

De nombreux champignons peuvent présenter des instabilités phénotypiques. Chez le champignon filamenteux modèle Podospora anserina, la dégénérescence cellulaire épigénétique Crippled Growth (CG) se caractérise par un ralentissement de la croissance, une pigmentation altérée, un défaut de production de fructifications et d’hyphes aériens. CG est dû à un élément C, infectieux et cytoplasmique, produit durant la phase stationnaire. Deux types de mutants ont été isolés au laboratoire : les mutants IDC, incapables de présenter CG, et les mutants PDC développant plus fréquemment CG. Les premiers ont été particulièrement étudiés et ont permis d’identifier plusieurs acteurs impliqués dans CG : la voie MAPK PaMpk1 et son auto-activation est au coeur du système, la voie MAPK PaMpk2, le complexe NADPH oxydase Nox1 et d’autres petites protéines participent aussi à la régulation de CG en activant la voie PaMpk1. Les travaux présentés ici caractérisent pour la première fois deux mutants PDC : les mutants PDC2205 et PDC2209. PDC2205 est affecté dans le gène PDC1 et code pour une protéine, PDC1, conservée chez les ascomycètes. Cette protéine module CG en inhibant la voie PaMpk1. L’étude du mutant PDC2209, quant à elle, a permis d’identifier un cluster très particulier nommé cluster 2209. Ce dernier code d’une part pour les constituants de la boucle d’activation de PaMpk1, et d’autre part pour des répresseurs de cette boucle. Ces deux types d’éléments, activateurs et répresseurs, semblent s’organiser en au moins deux systèmes toxine/antitoxine. Par ailleurs, ce cluster s’est conservé chez les Sordariales et les Chaetosphaeriales, même s’il présente une histoire évolutive très particulière, subissant de nombreux réarrangements. Ce cluster est donc très important mais sa fonction reste inconnue. / Many fungi display epigenetic instability. In Podospora anserina, the epigenetic cell degeneration “Crippled Growth” (CG) is characterized by slow growth, alteration of pigmentation and inability to differentiate fructifications and aerial hyphae. CG is due to a cytoplasmic and infectious element called C produced during stationary phase. Two types of CG mutants were isolated: IDC mutants impaired in the development of CG and PDC mutants promoting the development of CG. The former have been well studied and all mutants are affected in the MAPK1 pathway, the MAPK2 pathway, the Nox1 NADPH oxidase complex, or in small cysteine-containing proteins probably involved in signal transduction. Here, we present for the first time an analysis of two PDC mutants, the PDC2205 and the PDC2209 strains. PDC2205 is mutated in the PDC1 gene and encodes the PDC1 protein which is conserved in most Ascomycota. This protein regulates CG by inhibiting the PaMpk1 pathway. As for the mutant PDC2209, its analysis has allowed to identify the cluster 2209. This cluster encodes the component of the activation loop of the PaMpk1 and the repressors of the loop. These two types of elements, activators and repressors, seem to be organized in two toxin/antitoxin systems. Besides, this cluster is conserved in the Sordariales and the Chaetosphaeriales with a very specific evolutionary story. So, this cluster is very important, but its function is still unknown.

Le complexe de remodelage de la chromatine NuRD, composé des sous-unités catalytiques CHD3 et CHD4, est un régulateur épigénétique de l’expression génique. Nos résultats montrent que NuRD s’associe avec les facteurs de transcription essentiels du mélanome que sont MITF et SOX10. Cependant, malgré une association physique et une co-localisation génomique, CHD4/NuRD ne semble pas agir comme un cofacteur important pour MITF ou SOX10. Néanmoins, la répression de CHD4 conduit à un ralentissement de la prolifération et déréprime l’expression des enzymes PADI1 et PADI3 dans les cellules de mélanome ainsi que dans de nombreux types de cellules cancéreuses. Ainsi, l’induction de ces enzymes, responsables de la conversion des arginines en citrullines, entraîne la citrullination spécifique de PKM2, une enzyme glycolytique essentielle, diminuant ainsi sa sensibilité aux inhibiteurs allostériques, et donc altérant l’équilibre physiologique entre activateurs et inhibiteurs de l’enzyme. L’ensemble de ce travail de thèse a permis de mettre en évidence une nouvelle voie reliant, d’une part la régulation épigénétique de l’expression de PADI1 et PADI3 par CHD4/NuRD ainsi que la reprogrammation de la régulation allostérique de PKM2 via la citrullination d’arginines, au flux glycolytique et au contrôle de la prolifération des cellules cancéreuses d’autre part. / The Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex is an epigenetic regulator of gene expression that includes two mutually exclusive ATPase subunits CHD3 and CHD4. Our results show that NuRD associates with essential melanoma cell transcription factors namely MITF and SOX10. However, despite their physical association and genomic co-localization, CHD4-NuRD does not appear to act as a cofactor for MITF or SOX10 regulated gene expression. Nevertheless, CHD4 silencing leads to a slow growth phenotype and de-represses the expression of PADI1 (Protein Arginine DeIminase 1) and PADI3, two enzymes involved in converting arginines to citrullines in melanoma and multiple types of cancer cells. Increased expression of PADI1 and PADI3 enhances citrullination of arginines within the key glycolytic regulatory enzyme PKM2 then promoting excessive glycolysis, lowering ATP levels and slowing down proliferation. PKM2 citrullination lowers its sensitivity to allosteric inhibitors thus shifting equilibrium towards allosteric activators thereby bypassing the normal physiological regulation of glycolysis. Overall, our results lead to describe a novel pathway linking, epigenetic regulation of PADI1 and PADI3 expression by CHD4/NuRD and reprogramming of PKM2 allosteric regulation through arginines citrullination, to glycolytic flux and cancer cell proliferation.

Les éléments transposables (ET) sont des éléments génétiques ubiquitaires et potentiellement mobiles dans les génomes eucaryotes. Les génomes hôtes ont développé des mécanismes épigénétiques pour contrôler et prévenir la prolifération des ET. Néanmoins, certains ET semblent capables de s’activer en réponses à des stress ou à des facteurs développementaux. Les méthodes disponibles pour détecter l’activité transpositionnelle d’un ET sont souvent limitées au stade transcriptionnel ou sont adaptées à des génomes de petite taille. Relativement peu d’ET sont actuellement connus pour être actifs et les mécanismes spécifiques qui les contrôlent ne sont pas clairement identifiés.Durant mes travaux de thèse, nous avons développé une stratégie de séquençage à haut débit qui permet la détection d’ADN extrachromosomique circulaire (ADNecc) témoignant notamment de l’activité des ET et de la stabilité d’un génome. Ainsi nous avons pu caractériser chez plusieurs espèces le mobilome, défini comme l’ensemble des ADNecc présents dans un tissu.La technique du mobilome-seq s’est avérée être un outil puissant pour la détection des ET actifs notamment chez le riz asiatique Oryza sativa. Notre analyse du mobilome a permis l’identification d’un rétrotransposon PopRice actif dans l’albumen (tissu nourricier du grain) chez différentes variétés de riz. Pour la première fois chez les plantes, nous avons également détecté des insertions somatiques d’ET par re-séquençage de génome entier. À partir de nos résultats, nous avons combiné nos données mobilomiques avec une analyse GWAS pour proposer des pistes afin d’identifier de nouveaux mécanismes de régulation de cet élément.En parallèle, nous avons appliqué la technique du mobilome-seq à différents organismes animaux et végétaux révélant ainsi des spécificités de mobilome propre à chaque espèce. Nos travaux en collaboration avec d’autres équipes ont notamment contribué à préciser le rôle de l’ARN polymérase II dans le contrôle des ET chez O. sativa et à mettre en évidence le lien entre la présence d’ADNecc viral et la réponse immunitaire chez Drosophila melanogaster.Mes travaux de thèse ouvrent des perspectives pour l’étude du mobilome, ce répertoire génomique encore largement inexploré et qui se révèle être à la fois une source d’information au niveau des mouvements des ET mais aussi de la stabilité des génomes. L’étude future des mobilomes promet d’apporter des réponses sur notre compréhension de la dynamique des génomes. / Transposable elements (TEs) are mobile genetic elements that constitute a major part of eukaryotic genomes. Host genomes have developed epigenetic mechanisms to control and prevent their proliferation. While efficiently silenced by the epigenetic machinery, they can be reactivated upon stress or at precise developmental stages. However, available methods to detect TE activity are often limited to transcriptional level or more adapted to small genomes. Today, only few TEs are known to be active and specific mechanisms controlling TEs are not well defined. 
To address this question during my phD, we developed a strategy of high throughput sequencing that detects extrachromosomal circular DNA (eccDNA) forms which reflect TE activity and genome stability. We characterised mobilomes from different organisms defined as all eccDNA in a cell. 
Our mobilome-seq technique successfully identified active TEs especially in asian rice Oryza sativa. We identified an active retrotransposon PopRice in endosperm tissue from different rice varieties. Interestingly and for the first time in plants, we detected somatic insertions from genome- wide resequencing. We combined our mobilome-seq results with a GWAS analysis to propose new PopRice regulation mechanisms. 
 In a second step, we applied our mobilome seq technique to different animal and plant organisms showing mobilome specificities from each species. Our work in collaboration with different labs help contributed to define role of RNA polymerase II in the control of TEs in O. sativa and have revealed a link between presence of eccDNA from virus and immune response in Drosophila melanogaster. 
Altogether, our mobilome-sequencing method opens the possibility to explore unexplored genomic compartment. Future mobilome analysis represents new possibilities to improve our understanding of dynamics of genomes.

La tumeur de Wilms est la tumeur du rein la plus courante chez les enfants. Actuellement, près de 80 % à 90 % des patients survivent, mais quelques patients ne répondront pas aux traitements ou auront une rechute. L’objectif de ce projet est de caractériser la nouvelle mutation P904L dans le gène DNMT3A retrouvée chez un patient atteint de la tumeur de Wilms qui était en rechute. L’impact de cette nouvelle mutation est encore inconnu, mais des mutations dans le gène de DNMT3A sont fréquemment retrouvées dans le cancer. Le contexte de la mutation dans le patient et sa récurrence dans d’autres cancers et syndrome nous portent à croire que cette mutation affecte la fonction de DNMT3A. La perte de fonction de DNMT3A ainsi que certains de ses mutants sont connus pour altérer des caractéristiques du cancer comme la différenciation et l’immortalisation des cellules. On sait aussi que les tumeurs de Wilms ont des cellules qui gardent un aspect non différencié ou embryonnaire. Nous supposons que l’impact de la mutation P904L sur DNMT3A contribue au développement de la tumeur de Wilms. Pour démontrer l’impact de cette nouvelle mutation sur la protéine et sur le développement tumoral, nous avons utilisé à la fois des tests fonctionnels classiques et le séquençage de nouvelle génération. Puisque DNMT3A est un gène qui affecte la méthylation de l’ADN et régule l’expression, nous avons évalué le profil d’expression de la mutation P904L pour voir son impact sur la fonction du gène DNMT3A. Nos travaux démontrent que la nouvelle mutation P904L cause une perte de fonction de l’enzyme DNMT3A. Cette mutation altère le renouvellement cellulaire et la migration en plus de moduler la réponse à des agents thérapeutiques. Nous avons aussi constaté que la mutation module l’expression génique et que cette modulation est cohérente avec le profil d’expression du patient. En conclusion, nous suggérons trois mécanismes par lesquels le mutant contribue à la progression et au développement de la tumeur de Wilms. Nous démontrons aussi la nécessité d’approfondir nos connaissances sur cette tumeur afin de pouvoir proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients en rechute ou qui ne répondent pas aux traitements classiques. / Wilms tumours are the most common kidney tumour in children. As of now, almost 80 % to 90 % of the patients survive but there is still some who do not respond. This project objective is to study the novel mutation P904L in the DNMT3A gene discovered in a relapse Wilms tumour’s patient. The impact of this variant is unknown, but mutations in DNMT3A are frequently found in cancer. The context of the mutation in the patient and the recurrence of this mutation in other cancers and syndrome make us believe that it is affecting the function of the DNMT3A protein. Loss of function and some mutations of DNMT3A are known to affect crucial characteristics of cancers such as differentiation and immortalization. It is also known that Wilms tumours are made of undifferentiated or embryonic looking cells. We supposed that the impact of the mutation on DNMT3A protein contribute to the development of the tumour. To prove that this new mutation is affecting the protein and the development of the tumour, we used both functional assays and next generation sequencing technologies. Because DNMT3A is a gene affecting the methylation of the DNA and thus regulating gene expression, we used expression profile to assess the impact of the mutation on the enzyme DNMT3A. We demonstrate that the new mutation P904L causes a loss of function of the DNMT3A protein. This mutation affects the self-renew and the migration of the cells. Moreover, it modulates the response to drugs. We also found that the mutation modulates the gene expression in the cell line and this modulation is coherent with the expression pattern of the patient. In conclusion, we suggest three mechanisms by which this new mutant contributes to the development and progression of Wilms tumours. We also show that there is a need to further our knowledge of this tumour in order to propose new therapeutics options to non-responsive patient.

La télomérase est présente dans un nombre limité de cellules, telles que la plupart des cellules cancéreuses où son activité est indispensable pour l’immortalisation de ces dernières. C’est pourquoi cette enzyme a été proposée comme cible prometteuse pour des thérapies anticancéreuses. Ainsi, il est d’un intérêt certain d’identifier les mécanismes par lesquels elle est régulée, notamment via sa sous-unité catalytique, hTERT. Les rétinoïdes sont des inducteurs bien connus de la maturation granulocytaire associée à une répression de hTERT dans les blastes de leucémie aiguë promyélocytaire (LAP). Dans une lignée cellulaire LAP résistant à la maturation induite par les rétinoïdes (NB4-LR1), a précédemment été identifiée une nouvelle voie de répression transcriptionnelle de hTERT en absence de différenciation. De plus, mon laboratoire d’accueil a isolé un variant de la lignée NB4-LR1 résistant à cette répression transcriptionnelle de hTERT, la lignée NB4-LR1SFD. Ensemble, ces lignées cellulaires, qui se comportent différemment face à un traitement à l’ATRA, fournissent un outil unique et puissant pour obtenir plus d’informations sur plusieurs problèmes de la régulation de la biologie moléculaire de la télomérase. Dans cette étude, en utilisant plusieurs approches complémentaires (immunoprécipitation de la chromatine combinée à une technique d’analyse à haut débit du positionnement des nucléosomes et de la méthylation de l’ADN et une approche de FISH), j’ai pu obtenir une vue intégrée des événements épigénétiques qui promeuvent la transition du promoteur de hTERT d’un état silencieux à un état actif et inversement. Cette information sera cruciale pour le développement de stratégies anticancéreuses ciblant l’expression de hTERT. / Telomerase is present in a limited number of cells, most of them cancerous where its activity is crucial for their immortalisation. Thus, that enzyme has been proposed as a promising target for anticancer therapies. Therefore, it is of great interest to identify the mechanisms by which it is regulated, notably through its catalytic subunit hTERT. Retinoids are well-known inducers of granulocytic maturation associated with hTERT repression in acute promyelocytic leukemia (APL) blasts. However, in NB4-LR1, a maturation-resistant APL cell line, was previously identified a new pathway of retinoid-induced hTERT transcriptional repression independent of differentiation. Furthermore, my host lab reported the isolation of a variant of NB4-LR1 cells resistant to this repression: NB4-LR1SFD. These two cell lines, which behave distinctly in response to ATRA treatment, provide a unique and interesting tool to gain further insights into the molecular biology of telomerase regulation. In this thesis project, using several complementary approaches (chromatin immunoprecipitation combined to a high-resolution, single-molecule nucleosome positioning assay and DNA methylation, and a FISH approach) allowed me to shed more light on the integrated epigenetic events that lead to hTERT promoter transition from its silent to its active state and vice versa. The information obtained could be crucial for the development of anticancer strategies targeting hTERT expression.

La santé et la fertilité des vaches laitières sont au cœur des préoccupations de la filière professionnelle dans un objectif d’efficience, de quantité et de qualité de la production de lait. La mise en place d’une lactation performante se superpose aux profonds changements hormonaux et métaboliques de la période postpartum, se traduisant par une balance énergétique négative. Les conséquences en sont souvent une altération de la fertilité et une immunodépression qui accroit la susceptibilité aux pathologies. Dans les élevages, il existe encore une grande variabilité d’état général et de performances chez les vaches laitières malgré la sélection génomique. Il est proposé que des modifications de la méthylation de l’ADN puissent contribuer à cette variabilité phénotypique individuelle. En effet, la méthylation de l’ADN, en tant que processus épigénétique, est impliquée dans la régulation transcriptionnelle des gènes, et présente une certaine plasticité face aux contraintes environnementales. Nous avons fait l’hypothèse que des signatures épigénétiques portées par les cellules du sang, pourraient refléter l’état de santé des vaches et pourraient être modifiées en réponse à différents facteurs intrinsèques (parité, stades physiologiques…) et aux contraintes environnementales. Ces signatures ont été recherchées dans une population de cellules du sang particulière : les monocytes. Ces cellules, accessibles par prélèvements sanguins et purification en présence d’un anticorps spécifique, constituent la première ligne de réponse d’immunité innée face aux infections aigües participant à la dégradation de l’état de santé des vaches en postpartum. Pour tester l’hypothèse de signatures épigénétiques monocytaires, une analyse du méthylome par « Reduced Representation Bisulfite Sequencing », (RRBS) dans diverses situations d’élevage a été réalisée. En utilisant des ADN génomiques de vaches incluses dans plusieurs protocoles, 22 banques ont été construites et séquencées. Leur analyse a été réalisée en utilisant un pipeline d’analyses bioinformatique et biostatistique développé au laboratoire.En moyenne 1 250 000 CpG sont pris en considération et permettent l’identification et la localisation de cytosines différentiellement méthylées (DMC) : i) 27143 DMC en comparant les méthylomes de différents types cellulaires (monocytes versus fibroblastes et PBMC) ii) 4788 DMC en réponse à un challenge nutritionnel basé sur la distribution du complément alimentaire GENIAL®, fabriqué et distribué en élevage par nos partenaires PILARDIERE et XR-Repro. iii) 2615 et 4616 DMC en réponse au challenge infectieux pour le groupe de vaches témoins et le groupe en restriction alimentaire respectivement (protocole coordonné par Christine Leroux et José Pires (RUMINFLAME, INRA, Theix) combinant une restriction alimentaire et un challenge immunitaire, par injection de LipoPolySaccharide). iv) 4420 DMC issues de la comparaison entre méthylomes de vaches à génome constant (issues du transfert nucléaire, clones) et de vaches à génome variable mais de même âge et élevées dans les mêmes conditions que les clones. Pour certaines régions différentiellement méthylées (DMR) ciblant le promoteur de gènes, le statut de méthylation a été confirmé par conversion bisulfite et pyroséquençage. L’expression des gènes associés a été étudiée. Une anti corrélation significative est observée entre méthylation et expression signant la fonctionnalité de ces régions.En comparant les 11 méthylomes monocytaires, il est montré que 21% des CpG sont extrêmement stables et ne présentent qu’une faible variation de méthylation entre échantillons ( 20%). L’ensemble de ces informations peut être pris en considération pour la conception d’un outil d’épigénotypage. A l’avenir, il serait aussi possible d’utiliser cet outil en routine afin d’appréhender les variations du méthylome monocytaire dans différentes conditions d’élevage. / In dairy breeding, the health and fertility of cows are the main concern with the aims to maintain milk quantity and quality and to reduce the interval between calving in a high competitive economical context. Postpartum period is marked by major hormonal and metabolic changes that affect productivity, immune responses and fertility. The consequences of immune response deterioration are an increasing susceptibility to diseases (mastitis, metritis, endometritis…). Genomic selection in livestock improves the performance of the population but does not exclude phenotypic variability at the level of livestock and the individual. It is proposed that DNA methylation could contribute to this individual phenotype variability. Indeed, DNA methylation is an epigenetic process involved in transcriptional regulation of genes displaying certain plasticity in front of environmental constraints.We assumed the epigenetic signatures carried by blood cells, could reflect overall health and could be modified in response to intrinsic factors (parity, stages …) and to environmental changes. These signatures were researched in a particular blood cells subpopulation: the monocytes. These cells, obtained by blood sampling and purification with a specific antibody, are the first line of defense against acute infections participating in health status deterioration of postpartum cows.To test the monocyte epigenetic signatures hypothesis, monocyte methylome were analyzed by « Reduced Representation Bisulfite Sequencing » (RRBS), in various breeding conditions. Using genomic DNA form cows included in several protocols, 22 libraries were constructed and sequenced. Their analyses were accomplished using a « homemade » pipeline which integrates bioinformatics and biostatistics analyses. On average, 1 250 000 CpGs were analyzed in order to identify differentially methylated cytosines (DMCs): i) 27143 DMC by comparison between different cells types (monocytes versus fibroblasts and PBMC) ii) 4788 DMCs in response to nutritional challenge based on the dietary supplement, GENIAL®, produced and distributed in breeding by our partner PILARDIERE and XR-Repro (in collaboration with Marion Boutinaud, INRA, Rennes). iii) 2615 and 4616 DMCs in response to infectious challenge with LipoPolySaccharide injection for control cows group fed normal diet and for dietary restriction cows group, respectively (collaboration with Christine Leroux and José Pires, RUMINFLAME, INRA, Theix; and Gilles Foucras (ENVT, Toulouse)). iv) 4420 DMCs from the comparison between constant genomic cow (Somatic cell nuclear transfer, clones) and variable genomic cows but with the same age and raised in the same conditions than clones.From DMCs, we identified differentially methylated regions (DMRs) defined as region with at least 3 DMCs inside 100 bp. For some DMRs targeting gene promoter, the methylation status was validated by bisulfite conversion and pyrosequencing. Gene associated expression were also investigated. A significant negative correlation has been observed between methylation and expression, highlighting the functional relevance of these DMRs in gene transcription control.By comparing the 11 monocyte methylomes, 21% of CpGs present a remarkable constant methylation level with weak variability between samples (20%).Taking together, these data can provide a list of relevant DMCs for an epigenetic tool conception. In the future, it would be possible to use this tool for a routine analysis in order to grasp monocyte methylome variations in different breeding management.