Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les rats GAERS (Genetic Absence Epilepsy Rats from Strasbourg) et NEC (Non-Epileptic-Control rats) dérivent de la lignée de rats Wistar-Hannover (WH). Chez les GAERS les premières crises d’épilepsies apparaissent vers l’âge de 25 jours puis leur nombre et leur durée augmentent pour se maintenir à l’âge adulte à raison d’une crise de 20 secondes en moyenne par minute lorsque l’animal est en veille calme. Ce développement spontané des crises d’épilepsies permet d’étudier la période silencieuse avant les premières crises ainsi que la survenue de ces premières crises (l’épileptogènese). De nombreuses études pharmacologiques et électrophysiologiques dans des modèles animaux d’épilepsie révèlent un rôle critique de la transmission dopaminergique dans la susceptibilité aux crises. Les GAERS adultes présentent une surexpression de l’ARNm des récepteurs dopaminergiques D3 comparé aux rats NEC. L’expression ainsi que la fonction du récepteur D3 et celles du transporteur de la dopamine (DAT) sont liées. Le but de ce travail a été de déterminer l’implication du RD3 et du DAT dans le développement de l’épilepsie en mesurant leur expression et fonction chez les GAERS avant l’apparition des premières crises. L’expression et la fonction du RD3 ont été mesurées par autoradiographie au [125I]-PIPAT et induction de bâillement par injection de quinpirole respectivement, dans les 3 lignées de rats (GAERS, NEC and WH) chez des rats adultes, à P14 et P21. L’expression du DAT a été analysée par imagerie SPECT à [123I]-Ioflupane chez les adultes et par autoradiographie au [3H]-GBR12935 chez les adultes, P14 et P21. Par ailleurs l’activité du DAT a été mesurée par capture de dopamine tritiée sur des synaptosomes de striatum, cortex et hippocampe de rats adultes des 3 lignées. La participation du RD3 dans les crises a été évaluée par EEG vidéo après l’injection d’agoniste D3 (quinpirole et PD128907) ou d’antagoniste (SB277011 et SR21502). Les expériences de radiographie ont révélé une surexpression des RD3 chez les GAERS dans les structures connues pour participer à l’initiation des crises (cortex somatosensoriel), à leur contrôle (noyaux accumbens) ainsi que dans d’autres structures (thalamus antérieur, tubercules olfactifs et ilots de calleja), à P14 et P21 comparé aux autres lignées. Ni le SPECT ni l’autoradiographie n’a relevé de modification d’expression du DAT chez les rats adultes, cependant à P14 et P21 le DAT est surexprimé au niveau du striatum. Ces résultats sont accompagnés d’une augmentation de la fonctionnalité du DAT aux 3 âges chez les GAERS compares aux autres lignées. Les agonistes D3 induisent une augmentation des décharges de pointes-ondes sans que les antagonistes aient un effet. De plus l’injection chronique d’aripiprazole (un neuroleptique connu pour sa capacité à stabiliser la libération de dopamine) chez les rats GAERS dès la naissance entraine une diminution des crises associée à une diminution d’expression des RD3. L’utilisation de lentivirus contenant une séquence shRNA anti-RD3 chez les GAERS adultes entraine aussi une diminution du nombre de crises d’épilepsie. Nos résultats suggèrent ainsi que l’augmentation du nombre de RD3 chez le GAERS est concomitante à une augmentation de la sensibilité du système dopaminergique, et cela avant l’apparition des premières crises épileptiques. Cette augmentation au cours de la maturation pourrait participer à l’aggravation progressive des crises d’épilepsie qui est la base de l’épileptogenèse et expliquer le déséquilibre de la tonicité dopaminergique que nous avons démontré chez l’adulte / Genetic Absence Epilepsy Rats from Strasbourg (GAERS) and Non-Epileptic-Control rats (NEC) derive from an original Wistar-Hannover rat strain (WH). The onset age of spike-and-waves discharges in GAERS is about 25 days post-natal (P25). In adult GAERS with fully developed epilepsy, dopamine plays a modulatory role in seizure expression. Adult GAERS display an over-expression of dopaminergic D3-receptors (D3R) mRNA as compared to NEC. Expression and function of D3R and dopamine transporter (DAT) are closely related. The aim of this work was to investigate the putative involvement of D3R and DAT during epileptogenesis by measuring their expression and functionality in GAERS before the onset of epilepsy (P25). D3R expression and functionality was investigated by [125I]-PIPAT autoradiography and quinpirole-induced yawning, respectively, in the three strains of rats (GAERS, NEC and WH) in adults, P14 and P21. DAT expression was investigated in GAERS and NEC by [123I]-Ioflupane SPECT imaging in adults and [3H]-GBR12935 autoradiography in adults, P14 and P21 rats. Furthermore, DAT activity was assessed by 3H-dopamine reuptake in synaptosomal living fractions of striatum, cortex and hippocampus of adult rats in the three strains. The involvement of the D3R was further investigated by video-EEG recording following systemic injections of either D3R agonist (quinpirole and PD128907) or antagonists (SB277011 and SR21502). Autoradiography showed an over-expression of D3R in GAERS in structures known to be involved in seizure initiation (somato-sensory cortex), seizure control (nucleus accumbens,) as well as in other structures (anterior thalamus, olfactory tubercles and islands of Calleja) at P14 and P21, as compared to age-matched NEC and WH. As in adults, this over-expression was associated with a higher number of quinpirole-induced yawns in GAERS at P14 and P21. Neither SPECT imaging nor autoradiographic data revealed any modification in DAT expression between the three strains in adults, however at P14 and P21 DAT is overexpressed in the striatum of GAERS rats. However, we found a consistent increase in 3H-dopamine reuptake in adult GAERS as compared to NEC and WH in the functional assay supporting an increase in dopamine translocation velocity. Administrations of D3R agonists increased spike-and-wave discharges, whereas antagonists had no effect. Furthermore, the chronic injection of aripiprazole (an atypical neuroleptic known to stabilize dopamine release) to GAERS pups reduced the number of seizures in adults along with a decreased expression of D3R. Preliminary data using lentiviral infection with shRNA anti-D3R also support reduced seizure number in adult GAERS rats. Our results suggest that an over-expression of functional D3R already exists before the onset of seizures in GAERS and that, despite a lack of changes in DAT expression, functional changes in this transporter occur in adults. They further support that a profound modification in basal ganglia function together with changes in D3R could be a conditional factor for epileptogenesis. The dopaminergic system appears persistently altered in spontaneous epileptic rats, which could contribute to the development of the chronic epileptic state and may represent a potential new target for antiepileptic therapies and/or improvement of quality of life of epileptic patients.

Mes travaux de thèse ont porté sur l’étude de deux modèles murins d’épilepsies génétiques de l’enfance liées à des mutations des canaux Nav1.1 (impliqués dans l’excitabilité des neurones inhibiteurs) : le Syndrome de Dravet (SD), une épilepsie pharmaco-résistante sévère, et l’Epilepsie Génétique avec Convulsions Fébriles Plus (EGCF+), présentant un phénotype plus modéré.Ils se sont décomposés en 3 axes : - La première partie mettant en évidence un phénomène d’épileptogenèse dans ces modèles murins.- La seconde permettant d’identifier des conditions expérimentales d’induction d'activités épileptiformes spécifiques du modèle murin du SD sur des tranches de cerveau.- La dernière consistant à mettre au point une stratégie pour réduire l’hyperexcitabilité cérébrale / During my thesis, I studied two murine models of childhood genetic epilepsies, caused by mutations of Nav1.1 channels (involved in the excitability of inhibitory neurons): Dravet Syndrome (DS), a severe and drug resistant epilepsy, and Genetic Epilepsy with Febrile Seizures Plus (GEFS+), characterized by a milder phenotype.My work is divided into three parts:- The first one revealed a process of epileptogenesis in these murine models.- In the second, I identified experimental conditions to induce epileptiform activities which are specific of the DS model in brain slices, which could allow pharmacological screens ex-vivo.- The third one was aimed at developing a new strategy to reduce cerebral hyperexcitability

Les crises d'épilepsie proviennent d'une synchronisation pathologique de réseaux neuronaux du cortex. Les crises motrices, générées à partir du cortex moteur primaire, sont souvent pharmaco-résistantes. La résection neurochirurgicale du foyer épileptique est rarement l'option thérapeutique de choix au regard des risques de deficits moteurs potentiellement induits par la résection. Les ganglions de la base ont un rôle important dans la propagation des crises. Des enregistrements par micro-électrode réalisés dans une précédente étude ont montré que les activités des structures d'entrée des ganglions de la base telles que le Putamen, le noyau caudé et le noyau sous-thalamique (NST) sont fortement modifiées pendant des crises motrices. Le taux de décharge moyen des neurones du NST et du Putamen augmente et le pourcentage de neurones oscillants synchronisés avec l'EEG durant la période ictale est plus élevé durant les crises que pendant la période inter-ictale. Des études pilotes chez l'humain ont montré un effet bénéfique potentiel de la stimulation cérébrale profonde (SCP) chronique du NST pour traiter les crises motrices pharmaco-résistantes. Le but de notre étude est d'évaluer les effets thérapeutiques de la SCP des structures d'entrée des ganglions de la base. Nous avons dans un premier temps développé un modèle primate de crise d'épilepsie motrice focale stable et reproductible par injection intra-corticale de pénicilline. Nous avons ensuite caractérisé la pharmaco-résistance du modèle. Nous avons implanté stéréotactiquement des électrodes de SCP dans le NST et le Putamen. Le stimulateur a été placé sous la peau dans le dos de l'animal. Un protocole de stimulation à 130 Hz à un voltage inférieur à l'apparition d'effets secondaires a été réalisé dans le NST. Le stimulateur était mis en marche au moment de l'injection de la pénicilline. Un protocole de stimulation à 0 volt a été réalisé comme condition contrôle. Chaque primate étant son propre contrôle. L'apparition des crises, leur nombre et leur durée ont été comparés par période de 1 heure entre la condition stimulée et non stimulée. Chaque session expérimentale a été menée sur une durée de plus de six heures. Nous avons évalué l'effet préventif de la SCP à haute fréquence (130 Hz) du NST sur les crises motrices. Nous avons également étudié l'effet préventif de la SCP à basse fréquence (5-20 Hz) du Putamen sur ce même modèle. Enfin, sur un autre primate, nous avons étudié l'effet combiné de la SCP du NST à haute fréquence et du Putamen à basse fréquence sur les crises motrices. Résultats : Les effets de la SCP chronique du NST à haute fréquence ont été analysés à partir de 1572 crises apparues au cours de 30 sessions expérimentales chez 3 primates. Les effets de la SCP préventive du NST ont été évalués sur 454 crises motrices durant 10 sessions expérimentales chez un primate. L'effet de la SCP du Putamen à basse fréquence a été analysé sur 289 crises durant 14 sessions chez 2 primates. Enfin l'effet combiné de la SCP du NST et du Putamen a été évalué sur 477 crises durant 10 sessions. Les meilleurs résultats ont été obtenus par SCP chronique du NST. L'apparition de la première crise était significativement retardée lorsque le primate était stimulé. Le temps total passé en situation de crise motrice était diminué en moyenne d'environ 69 % (p ≤0.05) par rapport à la condition non-stimulé au regard de la diminution significative du nombre de crises particulièrement durant les 3 heures après le début de la stimulation. La durée de chaque crise était modérément réduite. Les modes de stimulation mono-polaire ou bi-polaire avaient une efficacité similaire. La SCP préventive du NST n'a pas eu d'effet supérieur à la stimulation chronique du NST. La SCP chronique du Putamen à basse fréquence avait un effet positif mais principalement durant les deux premières heures de stimulation. L'effet combiné de la SCP du NST et du Putamen était inférieur à la SCP chronique du NST ou du Putamen.

Les crises d'épilepsie proviennent d'une synchronisation pathologique de réseaux neuronaux du cortex. Les crises motrices, générées à partir du cortex moteur primaire, sont souvent pharmaco-résistantes. La résection neurochirurgicale du foyer épileptique est rarement l'option thérapeutique de choix au regard des risques de deficits moteurs potentiellement induits par la résection. Les ganglions de la base ont un rôle important dans la propagation des crises. Des enregistrements par micro-électrode réalisés dans une précédente étude ont montré que les activités des structures d'entrée des ganglions de la base telles que le Putamen, le noyau caudé et le noyau sous-thalamique (NST) sont fortement modifiées pendant des crises motrices. Le taux de décharge moyen des neurones du NST et du Putamen augmente et le pourcentage de neurones oscillants synchronisés avec l'EEG durant la période ictale est plus élevé durant les crises que pendant la période inter-ictale. Des études pilotes chez l'humain ont montré un effet bénéfique potentiel de la stimulation cérébrale profonde (SCP) chronique du NST pour traiter les crises motrices pharmaco-résistantes. Le but de notre étude est d'évaluer les effets thérapeutiques de la SCP des structures d'entrée des ganglions de la base. Nous avons dans un premier temps développé un modèle primate de crise d'épilepsie motrice focale stable et reproductible par injection intra-corticale de pénicilline. Nous avons ensuite caractérisé la pharmaco-résistance du modèle. Nous avons implanté stéréotactiquement des électrodes de SCP dans le NST et le Putamen. Le stimulateur a été placé sous la peau dans le dos de l'animal. Un protocole de stimulation à 130 Hz à un voltage inférieur à l'apparition d'effets secondaires a été réalisé dans le NST. Le stimulateur était mis en marche au moment de l'injection de la pénicilline. Un protocole de stimulation à 0 volt a été réalisé comme condition contrôle. Chaque primate étant son propre contrôle. L'apparition des crises, leur nombre et leur durée ont été comparés par période de 1 heure entre la condition stimulée et non stimulée. Chaque session expérimentale a été menée sur une durée de plus de six heures. Nous avons évalué l'effet préventif de la SCP à haute fréquence (130 Hz) du NST sur les crises motrices. Nous avons également étudié l'effet préventif de la SCP à basse fréquence (5-20 Hz) du Putamen sur ce même modèle. Enfin, sur un autre primate, nous avons étudié l'effet combiné de la SCP du NST à haute fréquence et du Putamen à basse fréquence sur les crises motrices. Résultats : Les effets de la SCP chronique du NST à haute fréquence ont été analysés à partir de 1572 crises apparues au cours de 30 sessions expérimentales chez 3 primates. Les effets de la SCP préventive du NST ont été évalués sur 454 crises motrices durant 10 sessions expérimentales chez un primate. L'effet de la SCP du Putamen à basse fréquence a été analysé sur 289 crises durant 14 sessions chez 2 primates. Enfin l'effet combiné de la SCP du NST et du Putamen a été évalué sur 477 crises durant 10 sessions. Les meilleurs résultats ont été obtenus par SCP chronique du NST. L'apparition de la première crise était significativement retardée lorsque le primate était stimulé. Le temps total passé en situation de crise motrice était diminué en moyenne d'environ 69 % (p ≤0.05) par rapport à la condition non-stimulé au regard de la diminution significative du nombre de crises particulièrement durant les 3 heures après le début de la stimulation. La durée de chaque crise était modérément réduite. Les modes de stimulation mono-polaire ou bi-polaire avaient une efficacité similaire. La SCP préventive du NST n'a pas eu d'effet supérieur à la stimulation chronique du NST. La SCP chronique du Putamen à basse fréquence avait un effet positif mais principalement durant les deux premières heures de stimulation. L'effet combiné de la SCP du NST et du Putamen était inférieur à la SCP chronique du NST ou du Putamen. / Epileptic seizures arise from pathological synchronization of neuronal ensemble.Seizures originating from primary motor cortex are often pharmacoresistant, and many times unsuitable for respective surgery because of location of epileptic focus in eloquent area. Basal ganglia play important role in seizure propagation. Micro electrode recordings performed during previous studies indicated that input structures of basal ganglia such as GPe, Putamen and Subthalamic nucleus (STN) are strongly modified during seizures. For example the mean firing rate of neurons of the STN and Putamen increased and the percentage of oscillatory neurons synchronized with the ictal EEG was higher during seizures as compared to interictal periods. Pilot studies in humans have shown the possible beneficial effect of chronic DBS applied to STN in treatment of pharmacoresistant motor seizures. Our study was aimed at studying the therapeutic effect of electrical stimulation of input structures of basal ganglia . We first developed a stable, predictable primate model of focal motor epilepsy by intracortical injection of penicillin and we documented it's pharmacoresistence. We then stereotactically implanted DBS electrodes in the STN and Putamen. The stimulator was embedded at the back of the animals. Subthreshold electrical stimulations at 130 Hz were applied to STN. Stimulator was turned ON when penicillin was injected. Sham stimulation at 0 volt was used as a control situation, each monkey being its own control. The time course, number and duration of seizures occurring in each epochs of 1 h were compared during ON and sham stimulation periods. Each experimental session lasted uptoo 6 hours,We also studied preventive high frequency stimulation of STN and subthershold low frequency stimulation of Putamen with 5 Hz and 20 Hz in the same model .Finally we studied combined effects of high frequency STN and low frequency Putamen stimulation in one monkey Results: Data was analysed from 1572 seizures in 30 experiments in three monkeys for chronic STN stimulation , 454 seizures in 10 experiments in one moneky during preventive STN stimulation ,289 seizures from 14 experiments in two monkeys during LFS putamen stimulation and 477 seizures from 10 sessions during combined STN and Putamen stimulation in one monkey The best results were observed during chronic STN stimulation The occurrence of first seizure was significantly delayed as compared to sham situation. Total time spent in focal seizures was significantly reduced by ≥69% on an average (p ≤0.05) after STN stimulation, due to a significant decrease in the number of seizures especially so during the first 3 hours after stimulation. The duration of individual seizures reduced moderately. Bipolar and monopolar stimulation modes were equally effective Preventive HFS STN (in one specimen) was not found to be superior to acute stimulation. LFS Putamen alone was effective but mainly in first two hours of stimulation .In a combined HFS STN and LFS Putamen stimulation the effect of stimulation in terms of seizure control was modest and poor compared to HFS STN alone or LFS Putamen alone. This study provides original data in primates showing the potential therapeutic effect of chronic HFS-STN DBS to treat focal motor seizures . A discussion explaining these results and comparison with STN DBS in human motor seizures as well as future translational perspective in human therapeutics is provided.

Malgré l’avancée considérable des connaissances sur le génome humain, de nombreuses maladies génétiques restent mal comprises car nous ignorons encore quel gène porte la mutation responsable d’une pathologie spécifique. Notre travail s’intègre dans le cadre de l’étude des maladies génétiques héréditaires monogéniques récessives, maladies rares mais qui ensemble touchent près d’1% de la population globale.<p>Les maladies récessives sont des maladies génétiques dont le phénotype malade ne se déclare que lorsque les deux allèles d’un gène sont mutés, hérités chacun d’un parent porteur. L’approche que nous utilisons pour localiser le gène causal dans le génome est l’analyse de liaison génétique. Les familles consanguines sont le profil idéal pour ce type d’étude car l’hypothèse peut être faite que les enfants atteints ont hérité deux fois de la même mutation, chaque allèle malade provenant d’un parent porteur et hérité d’un ancêtre commun relativement proche Dans cette optique, nous établissons une cartographie d’homozygotie (homozygosity mapping) du génome des patients, c à d que nous recherchons à travers le génome complet des zones d’homozygotie indiquant une identité par descente à partir d’un ancêtre commun (1) en à testant systématiquement un grand nombre de marqueurs génomiques polymorphes (microsatellites d’ADN et SNPs) répartis sur tous les chromosomes dans l’ADN extrait de tous les membres de la famille, atteints et non atteints. Ensuite nous inspectons la région homozygote à la recherche des meilleures gènes candidats, que nous séquençons jusqu’à trouver une mutation dont le rôle causal de la pathologie soit convaincant.<p>Nous avons étudié une famille constituée de 2 boucles de consanguinité avec plusieurs enfants atteints d’épilepsie myoclonique progressive (PME). <p>Nous avons criblé le génome entier des patients au moyen d’un kit permettant l’analyse de 382 microsatellites et avons confronté ces résultats avec ceux d’une analyse sur puce de 10.000 SNPs. Cela nous a permis de mettre en évidence un nouveau locus de PME s’étalant sur une dizaine de cM sur la région centromérique du chromosome 7. La valeur maximale du LOD score que nous avons calculé atteint 4.0 rendant ce locus significatif. Dans cet intervalle, contenant environ 85 gènes annotés, nous avons séquencé le gène KCTD7 car il s’agit de l’acronyme pour K+ Channel Tetramerization Domain 7, spéculant sur une interaction potentielle avec un canal potassique. Ce séquençage a révélé une mutation non sens homozygote chez les atteints, hétérozygotes chez les parents, et totalement absente dans une série de 100 contrôles. Cette mutation, sur l’exon 2 de KCTD7, substitue une arginine par un codon stop, tronquant deux tiers de la protéine (289aa total). L’ensemble de ces résultats ont été repris dans une première publication au journal Annals of Neurology en 2007 (2). <p>Au début de ce travail, le gène KCTD7 était une simple annotation génomique. Son ADNc avait été cloné dans un effort systématique à haut débit et des ESTs (expressed sequence tag) en avaient été caractérisés. La famille des protéines KCTDs sont de petites protéines solubles caractérisées par un domaine d’interaction protéine-protéine appelé BTB/POZ. Ces protéines sont impliquées dans une grande variété de processus biologiques. Certaines sont des adaptateurs spécifiques du complexe multimèrique E3 Ubiquitine Ligase (2), d’autres sont impliquées dans l’assemblage des récepteurs GABAb (3), d’autres encore sont des protéines nucléaires, stimulant l’activité polymérase de l’ADN polδ2 (4).<p>Nous avons montré, en utilisant la technique du Northern Blot, que l’ARNm du gène KCTD7 était exprimé de manière ubiquitaire (cerveau, cœur, foie, poumon, intestin, colon, reins, rate, yeux, muscle). Ceci a été confirmé par PCR après transcription inverse à partir d’ARNs provenant des mêmes tissus chez la souris adulte. Nous avons également montré que ce gène était déjà exprimé durant la vie fœtale par PCR après transcription inverse à partir d’embryon de souris (E6.5 à E14.5).<p>Nos Western Blots ne nous ayant pas permis d’observer la protéine endogène dans les extraits tissulaires totaux, nous avons pensé que la protéine pouvait être rapidement dégradée. Nous avons donc mesuré la demi-vie de la protéine KCTD7 recombinante en cellules COS-7 traitées pour différents temps par la cyclohéximide comme inhibiteur de la synthèse protéique. Cette demi-vie a été évaluée à 6h, ce qui indique que KCTD7 n’est pas une protéine hyper-labile. <p>Puisque nous avions l’hypothèse que KCTD7 puisse interagir avec les canaux ioniques membranaire, nous avons cherché à comprendre sa distribution intracellulaire. Ainsi, nous avons déterminé par immuno-fluorescence que la protéine recombinant KCTD7, marquée par les tags GFP, HIS ou HA, avait une distribution essentiellement périnucléaire en cellules COS-7. Lors des immuno-détections, nous avons utilisé soit l’anticorps contre KCTD7, soit l’anticorps contre le tag, afin de renforcer la validité du marquage. Un signal à la membrane plasmique n’ayant pas été détecté, nous avons postulé que KCTD7 n’interagit sans doute pas directement à cette membrane, que ce soit avec des canaux ioniques membranaires ou des récepteurs de neurotransmetteurs (GABAb). Un modèle de régulateur direct de canaux potassiques associés au réticulum endoplasmique a déjà été proposé pour KCNRG, un membre des protéines KCTDs capable de réguler négativement l’activité des canaux Kv1.1 et Kv1.4 par un contrôle de leur expression à la membrane grâce à leur rétention dans le réticulum endoplasmique (6). <p>A l’instar d’autres protéines de la famille des KCTDs, nous avons montré, par des expériences de co-immunoprécipitation, que KCTD7 était capable de former des homodimères, très probablement grâce à son module d’interaction BTB/POZ comme cela à été montré pour d’autres protéines de la même famille (7). Nous avons également montré par co-immunoprécipitation que KCTD7 interagi avec la Cullin-3 alors qu’il ne lie pas la Cullin-1. Cette protéine fait partie d’un complexe protéique impliqué dans l’ubiquitination de certains substrats. Nous avons montré que KCTD7 n’est pas sujet à l’ubiquitination en cellules COS-7 co-transfectées par KCTD7 et l’ubiquitine-flag, ce qui n’exclu pas qu’il puisse l’être dans un autre système ou d’autres conditions expérimentales. L’ubiquitination, quand elle ne conduit pas son substrat à la dégradation par le protéasome, est un processus qui permet le contrôle de l’expression de nombreuses protéines, dont certains canaux ioniques membranaires (KCNQ2/3 et KNCQ3/5 (8), Kv1.3 (9), Kv1.5 (10) et KCNH2 (11)) et certaines enzymes métaboliques défectueuses dans certaines PME (dont Laforine et Maline (12), Cystatine B (13), β-hexosaminidase (14)). KCTD7 pourrait donc cibler la Cullin-3 vers son substrat et sans être ubiquitiné lui-même. <p>Nous avons étudié plus en détail l’expression de KCTD7 (ARN et protéine) dans le cerveau de souris adulte. Nous avons déterminé à la fois par des expériences d’hybridation in situ (ARN) et d’immunohistochimie (protéine) sur des coupes coronales de cerveau de souris adultes CD1 que KCTD7 semble être spécifiquement localisé dans trois régions distinctes :la couche de cellules mitrales des bulbes olfactifs, le gyrus denté et les régions CA1 et CA3 de l’hippocampe, et enfin la couche de cellules de Purkinje du cervelet. Il apparait que ces zones sont atteintes dans un modèle murin de la maladie d’Unverricht-Lundborg (15), la forme la plus fréquente d’épilepsie myoclonique progressive et très proche du phénotype de nos patients.<p>Enfin, nous avons montré en collaboration avec le laboratoire du professeur Schiffmann par des mesures électrophysiologiques (Patch Clamp en cellule entière) que KCTD7 diminue le potentiel de repos (accroît la polarisation) de la membrane cellulaire de neurones corticaux embryonnaires de souris en cultures primaires, diminuant l’excitabilité neuronale en augmentant la conductance de la membrane plasmique. Ces résultats sont compatibles avec l’idée qu’une perte de fonction de la protéine entraîne une augmentation de l’excitabilité neuronale qui est caractéristique de l’épilepsie. Ces données fonctionnelles sur KCTD7 ont fait l’objet d’un manuscrit actuellement en cours de soumission au journal Molecular and Cellular Neuroscience.<p>Les données que nous avons récoltées sur KCTD7 ont précisé un mécanisme probable d’action de la protéine. Malgré les limitations de nos modèles expérimentaux, nous postulons que le défaut de KCTD7 cause l’épilepsie en modifiant la conductance potassique et par là, le potentiel de repos et l’excitabilité de la membrane plasmique des neurones, peut-être par ubiquitination, via la Culline-3, d’un canal potassique. À notre connaissance, il s’agirait de la première PME dont le défaut primaire serait au niveau du potentiel membranaire. Cette hypothèse cadre bien avec l’observation clinique que les patients les plus atteints étaient ceux dont l’épilepsie était la moins bien contrôlée par le traitement, suggérant une dégénérescence secondaire excito-toxique. <p>La suite logique de notre travail serait la définition plus précise de l’expression sub-cellulaire de KCTD7 en microscopie confocale à fluorescence, de son expression spatiale et temporelle chez la souris et si possible chez l’homme, l’étude de l’ubiquitination de sous-unités de canaux potassiques, et le développement d’un modèle animal, poisson zèbre ou souris, afin, entre autres, d’y tester l’hypothèse que la sévérité de l’hyperexcitabilité neuronale elle-même aggrave le phénotype. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les convulsions fébriles (CF) surviennent chez 2 à 5 % des jeunes enfants. La grande majorité de ces épisodes sont complètement bénins et aucune conséquence ne découle de ces convulsions. Une récente étude a par contre démontré qu'au sein d'une population pédiatrique atteinte d'épilepsie du lobe temporal (ELT), plusieurs enfants ont développé des CF avant l'apparition de ce trouble neurologique. De plus, cette étude a démontré une prévalence élevée de double pathologie chez ces enfants (sclérose de l'hippocampe et malformation corticale), suggérant un lien de causalité entre les CF, la malformation corticale et le développement de l'ELT. En se basant sur ces observations cliniques, la présente étude a pour but d'étudier les changements morphologiques et métaboliques cérébraux survenant suite aux convulsions hyperthermiques chez un modèle raton atteint de dysplasie corticale focale. Pour ce faire, une analyse du changement d'intensité de signal IRM en pondération-T[indice inférieur 2] et de multiples images TEP obtenues à l'aide de différents radiotraceurs([[indice supérieur 18]F]-FDG, [[indice supérieur 13]N]-NH[indice inférieur 3], [[indice supérieur 11]C]-acétoacétate) a été effectuée. De plus, un suivi longitudinal du développement volumétrique de l'hippocampe et des ventricules latéraux a été effectué. Les résultats de cette étude présentent une atteinte plus prononcée de l'hippocampe suite aux convulsions hyperthermiques chez le cerveau avec dysplasie corticale. En effet, 5 h après l'induction des convulsions hyperthermiques, un hyposignal IRM T[indice inférieur 2] est présent dans l'hippocampe de ce groupe comparativement au groupe contrôle atteint de dysplasie corticale seule. Les images TEP acquises pendant des convulsions hyperthermiques prolongées révèlent une inhomogénéité importante de captation du [[indice supérieur 18]F]-FDG au sein des structures cérébrales. L'hippocampe est d'ailleurs la structure avec la plus faible captation de [[indice supérieur 18]F]-FDG. À P38, une atrophie de l'hippocampe dorsal et une dilatation des ventricules latéraux sont mesurées au sein du groupe d'intérêt. Nos observations nous amènent à poser l'hypothèse que les perturbations remarquées chez le rat adulte sont causées par une vascularisation immature et inhomogène de l'hippocampe à P10 causant une atteinte hypoxique durant l'épisode de convulsion fébrile atypique. Ces résultats suggèrent donc que l'hypoxie durant un épisode de convulsions fébrile atypique mérite d'être davantage investiguée afin de développer de nouvelles avenues thérapeutiques pouvant diminuer l'impact des convulsions fébriles atypiques sur le développement cérébral.

La recherche montre que l’insula est impliquée dans le traitement d’informations intéroceptives, émotionnelles et relevant de fonctions exécutives de haut niveau. L’hypothèse des marqueurs somatiques propose que ces fonctions vraisemblablement séparées travaillent plutôt de concert au sein d’un système neural dont le rôle consiste à extraire les messages émotionnels des signaux corporels. Si l’insula exerce effectivement un rôle de modulateur des sensations corporelles et des processus cognitifs découlant de ceux-ci, des lésions au cortex insulaire risquent d’occasionner des altérations au niveau de l’expérience émotionnelle, des fonctions exécutives et de la personnalité. La présente étude a pour but de mesurer ces changements chez 19 patients ayant subi une insulectomie unilatérale dans le cadre de leur traitement de l’épilepsie. Ces patients ont été comparés à un groupe contrôle composé de 19 patients épileptiques ayant subi une résection du lobe temporal. Les participants ont été évalués par l’entremise du Iowa Scales of Personality Change (ISPC), rempli par un proche du patient. Les résultats montrent que les patients du groupe insulaire exhibent des changements qui dénotent une dérégulation émotionnelle à long terme, caractérisée par une augmentation modérée de l’irritabilité, de la labilité émotionnelle, de l’anxiété et de la frugalité, tous des changements qui, outre l’anxiété, n’ont pas été observés chez les patients temporaux. Cependant, pour ce qui est des fonctions exécutives, aucun changement significatif n’a été noté. De plus, la comparaison pré- et post opératoire des scores des deux groupes aux items de l’ISPC ne s’est pas avérée significative. Globalement, les résultats suggèrent que l’insula joue probablement un rôle accessoire au sein du modèle proposé par l’hypothèse des marqueurs somatiques et que les résections unilatérales partielles ou complètes de l’insula ne risquent pas d’occasionner de changements prononcés de la personnalité. / Research has shown that the insula is involved in the processing of information relating to interoceptive, emotional and executive functions. It was proposed that these two seemingly separate functions may work conjointly as part of a large neural circuit tasked with the extraction of emotional information from bodily signals. It was hypothesized that, if the insula does indeed modulate feelings and the cognitive processes which derive from them, insular damage would result in alterations of emotional experience, executive functions and personality. To that effect, we examined such changes in a group of patients (n = 19) who underwent epilepsy surgery involving partial or complete resection of the insula, and compared them to a group of patients who underwent temporal lobe epilepsy surgery (n = 19) as a lesion-control group. Participants were assessed on the Iowa Scales of Personality Change, filled by a close relative at least six months after surgery. While pre- vs. post-surgery changes did not significantly differ between groups on any of the outcome variables, insular resections were associated with mild but significant increases in irritability, emotional lability, anxiety, and frugality postoperatively, which, with the exception of increased anxiety, were not found among temporal patients. Against our initial prediction, the surgery did not lead to executive functioning deficits. Overall, our results support the notion that the insula most likely holds an accessorial role in the model proposed by the somatic marker hypothesis, and that there isn’t a risk of dramatic personality change as a result of the partial or complete unilateral surgical removal of the insula.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le co-transporteur potassium-chlorure 2, KCC2, contrôle la concentration intracellulaire des ion chlorure (Cl-) dans les neurones matures et régule ainsi la force inhibitrice de l'acide γ-amino butyrique (GABA) et de la glycine, principaux neurotransmetteurs inhibiteurs du système nerveux central. Plusieurs troubles neurologiques sont associés à une diminution de l'expression de KCC2, qui se traduit par l'hyperexcitabilité du réseau neuronal. L'objectif de ce travail de thèse était d'identifier et caractériser les éléments structuraux de la protéine qui sont impliqués dans la régulation de son activité d'un point de vue physiologique et pathologique. J'ai développé de nouvelles approches pour enregistrer l'activité de transporteur d'ions ainsi que l'expression membranaire de KCC2. Ces outils m'ont permis de caractériser de nouveaux éléments structuraux qui régulent le fonctionnement de cette protéine, à savoir, son insertion dans la membrane plasmique, son internalisation ou encore son activité intrinsèque de transporteur d'ions. Enfin, nous avons montré que deux mutations (R952H et R1049C), identifiées chez des patients atteints d'épilepsie idiopathique généralisée (EIG), entrainent la diminution de l'expression membranaire de la protéine et de sa fonction de transporteur de Cl- in vitro. Nos résultats changent la vision actuelle du rôle fonctionnel des régions de KCC2, soulignent l'importance d'étudier l'expression membranaire de la protéine, conjointement à son activité de transporteur, et enfin, démontrent pour la première fois que des mutations sur le gène KCC2, retrouvées chez des patients atteints d'EGI, peuvent perturber le fonctionnement du transporteur. / The potassium chloride co-transporter 2, KCC2, controls the intracellular chloride (Cl-) concentration in mature neurons and thus regulates the inhibitory forces of γ-amino butyrique (GABA) and glycine, the major inhibitory neurotransmitters in the central nervous system. Several neurological disorders are associated with down-regulation of KCC2 expression, resulting in hyperexcitability of neural network. The aim of this thesis was to identify and characterize the structural elements of the protein involved in the regulation of its activity under physiological and pathological conditions. I developed new approaches to record ion-transport activity and membrane expression of KCC2. These tools allowed me to characterize new structural elements regulating the functioning of the protein, namely insertion into plasma membrane, internalisation or intrinsic activity of ion-transport. Finally, we showed that two mutations (R952H and R1049C) identified in patients with idiopathic generalized epilepsy (IGE), cause the decrease in membrane protein expression and its function of Cl-transporter in vitro. Our results change the current view on the functional role of KCC2 regions, emphasize the importance of studying membrane protein expression, together with its transporter activity, and finally, demonstrate for the first time that mutations in the KCC2 gene found in patients with EGI, may interfere with transporter function.