La mémoire et l’apprentissage sont des phénomènes complexes qui demeurent encore incertains quant aux origines cellulaire et moléculaire. Il est maintenant connu que des changements au niveau des synapses, comme la plasticité synaptique, pourraient déterminer la base cellulaire de la formation de la mémoire. Alors que la potentialisation à long-terme (LTP) représente un renforcement de l’efficacité de transmission synaptique, la dépression à long-terme (LTD) constitue une diminution de l’efficacité des connexions synaptiques. Des études ont mis à jour certains mécanismes qui participent à ce phénomène de plasticité synaptique, notamment, les mécanismes d’induction et d’expression, ainsi que les changements morphologiques des épines dendritiques. La grande majorité des synapses excitatrices glutamatergiques se situe au niveau des épines dendritiques et la présence de la machinerie traductionnelle près de ces protubérances suggère fortement l’existence d’une traduction locale d’ARNm. Ces ARNm seraient d’ailleurs acheminés dans les dendrites par des protéines pouvant lier les ARNm et assurer leur transport jusqu’aux synapses activées. Le rôle des protéines Staufen (Stau1 et Stau2) dans le transport, la localisation et dans la régulation de la traduction de certains ARNm est bien établi. Toutefois, leur rôle précis dans la plasticité synaptique demeure encore inconnu. Ainsi, cette thèse de doctorat évalue l’importance des protéines Staufen pour le transport et la régulation d’ARNm dans la plasticité synaptique. Nous avons identifié des fonctions spécifiques à chaque isoforme; Stau1 et Stau2 étant respectivement impliquées dans la late-LTP et la LTD dépendante des récepteurs mGluR. Cette spécificité s’applique également au rôle que chaque isoforme joue dans la morphogenèse des épines dendritiques, puisque Stau1 semble nécessaire au maintien des épines dendritiques matures, alors que Stau2 serait davantage impliquée dans le développement des épines. D’autre part, nos travaux ont permis de déterminer que la morphogenèse des épines dendritiques dépendante de Stau1 était régulée par une plasticité synaptique endogène dépendante des récepteurs NMDA. Finalement, nous avons précisé les mécanismes de régulation de l’ARNm de la Map1b par Stau2 et démontré l’importance de Stau2 pour la production et l’assemblage des granules contenant les transcrits de la Map1b nécessaires pour la LTD dépendante des mGluR. Les travaux de cette thèse démontrent les rôles spécifiques des protéines Stau1 et Stau2 dans la régulation de la plasticité synaptique par les protéines Stau1 et Stau2. Nos travaux ont permis d’approfondir les connaissances actuelles sur les mécanismes de régulation des ARNm par les protéines Staufen dans la plasticité synaptique. MOTS-CLÉS EN FRANÇAIS: Staufen, hippocampe, plasticité synaptique, granules d’ARN, traduction, épines dendritiques. / Learning and memory are complex processes that are not completly understood at the cellular and molecular levels. It is however accepted that persistent modifications of synaptic connections, like synaptic plasticity, could be responsible for the encoding of new memories. Whereas long-term potentiation (LTP) is classically defined as a persistent and stable enhancement of synaptic connections, long-term depression (LTD) is a reduction in the efficacy of neuronal synapses. Numerous studies have identified some of the mechanisms of this phenomenon, in particular, the induction and expression mechanisms, as well as the changes in dendritic spine morphology. The most abundant type of synapse in the hippocampus is the excitatory glutamatergic synapse made on dendritic spines; the presence of the translational machinery in dendrites near spines strongly supports the concept of local mRNA translation. Moreover, those mRNA are transported in dendrites to activated synapses by RNA binding-proteins (RBP). Staufen proteins (Stau1 and Stau2) function in transport, localization and translational regulation of mRNA are now established. However, their precise roles in synaptic plasticity are still unknown. Thus, this Ph.D. thesis evaluates the importance of Staufen proteins in mRNA transport and regulation in synaptic plasticity. We have identified specific functions for each isoform; while Stau1 is implicated in late-LTP, Stau2 is required for mGluR-LTD. This specificity is also relevant for dendritic spine morphogenesis since Stau1 is involved in mature dendritic spine maintenance while Stau2 participates in dendritic spine morphogenesis at a developmental stage. Moreover, our studies have indicated that Stau1 involvement in spine morphogenesis is dependent on ongoing NMDA receptor-mediated plasticity. Finally, our results suggest that Stau2 is implicated in a particular form of synaptic plasticity through transport and regulation of specific mRNA granules required for mGluR-LTD such as Map1b. Our work uncovers specific roles of Stau1 and Stau2 in regulation of synaptic plasticity. These studies help to better understand mechanisms involving mRNA regulation by Staufen in long-term synaptic plasticity and memory. ENGLISH KEY WORDS: Staufen, hippocampus, synaptic plasticity, RNA granules, translation, dendritic spines

Dans la cellule, chaque ARNm se doit d’être régulé finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais également au niveau de sa traduction, de sa dégradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre l’expression de chaque produit protéique au moment et à l’endroit précis où son action est requise. Lorsqu’un mécanisme physiologique est mis de l’avant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent d’être régulés simultanément. L’un des moyens permettant d’orchestrer un tel processus est de réguler l’action d’une protéine commune associée à chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi l’expression d’un groupe précis d’ARNm peut être régulée finement dans le temps et dans l’espace selon les facteurs protéiques auxquels il est associé. Dans l’optique d’étudier certains de ces complexes ribonucléoprotéiques (mRNP), nous nous sommes intéressés aux isoformes et paralogues de Staufen, une protéine à domaine de liaison à l’ARN double-brin (dsRBD) impliquée dans de nombreux aspects de la régulation post-transcriptionnelle, tels la dégradation, la traduction ou encore la localisation d’ARNm. Chez la drosophile, un seul gène Staufen est exprimé alors que chez les mammifères, il existe deux paralogues de la protéine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possédant divers isoformes produits suite à l’épissage alternatif de leur gène. Stau1 et Stau2 sont identiques à 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffèrent qu’en leur extrémité N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqué, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problématique très intéressante à laquelle nous nous sommes attaqué : ces différentes protéines, quoique très semblables, font-elles partie de complexes ribonucléoprotéiques distincts ayant des fonctions propres à chacun ou, au contraire, vu cette similarité de séquence, travaillent-elles de concert au sein des mêmes complexes ribonucléoprotéiques? Afin d’adresser cette question, nous avons entrepris d’isoler, à partir de cellules HEK293T, les différents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique d’immunoprécipitation. Nous avons isolé les ARNm associés à chaque protéine, les avons identifiés grâce aux micropuces d’ADN et avons confirmé nos résultats par RT-PCR. Malgré la présence d’une population commune d’ARNm associée à Stau1 et Stau2, la majorité des transcrits identifiés furent spécifiques à chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqué que les diverses populations d’ARNm participaient aux mêmes mécanismes de régulation, ce qui suggère que ces deux protéines possèdent des rôles complémentaires dans la mise en œuvre de divers phénomènes cellulaires. Au contraire, les transcrits associés à Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutôt semblables. Ces résultats sont très intéressants, car pour la première fois, nous avons identifié des populations d’ARNm associées aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analysées en parallèle afin d’en faire ressortir les populations spécifiques à chacune de ces protéines. Ensuite, connaissant l’importance de Stau2 dans le transport dendritique d’ARNm, nous avons cherché à caractériser les complexes ribonucléoprotéiques neuronaux associés à celle-ci. Dans un premier temps et à l’aide de la technique d’immunoprécipitation, nous avons identifié une population d’ARNm neuronaux associés à Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une présence d’au moins huit fois supérieure dans le précipité obtenu avec l’anticorps anti-Stau2 par rapport à celui obtenu avec le sérum pré-immun. Ces ARNm codent pour des protéines impliquées dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de métabolisme de l’ARN. De façon intéressante, cette population d’ARNm isolée du cerveau de rat est relativement différente de celle caractérisée des cellules humaines HEK293T. Ceci suggère que la spécificité d’association Stau2-ARNm peut diffèrer d’un tissu à un autre. Dans un deuxième temps, nous avons isolé les protéines présentes dans les complexes ribonucléoprotéiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifiées par analyse en spectrométrie de masse. De cette façon, nous avons identifié au sein des particules de Stau2 des protéines liant l’ARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protéines du cytosquelette (α- et β-tubuline), de même que la protéine peu caractérisée RUFY3. En poussant davantage la caractérisation, nous avons établi que YB1 et PABPC1 étaient associées à Stau2 grâce à la présence de l’ARN, alors que la protéine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernière association semble être modulable par l’action de l’ATP. Ce résultat offre de nombreuses possibilités quant à la régulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette étude suggère un mécanisme de régulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite à la caractérisation des mRNP de Stau, nous avons voulu déterminer au niveau neurophysiologique l’importance de ceux-ci. Comme l’étude de Stau2 avait déjà été entreprise préalablement par un autre laboratoire, nous avons décidé de concentrer notre étude sur le rôle de Stau1. Ainsi, nous avons démontré que celle-ci était nécessaire à la mise en place d’une forme de plasticité synaptique à long terme, la forme tardive de potentialisation à long terme ou L-LTP, dépendante de la transcription et de l’activité des récepteurs NMDA. La transmission de base, de même que la faculté de ces épines à faire de la E-LTP, la forme précoce de potentialisation à long terme, et la dépression à long terme ou LTD sont conservées. Ceci indique que les épines conservent la capacité d’être modulées. Ainsi, l’inhibition de la L-LTP, suite à la sous-expression de Stau1, n’est pas simplement due à la perte d’éléments fonctionnels, mais réside plutôt dans l’incapacité de ceux-ci à induire les changements synaptiques spécifiquement nécessaires à la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 réduit à la fois l’amplitude et la fréquence des mEPSC. Ces résultats concordent avec l’observation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion d’épines allongées et filopodales, des épines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait même, elle diminue le nombre d’épines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons été en mesure de démontrer que l’absence, au niveau neuronal, de la protéine Stau1 induisait un déficit probable dans la localisation et/ou la traduction d’ARNm responsable de la restructuration de l’épine et de facteurs nécessaires à la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons participé à lever le voile sur la composition et l’importance des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifié des populations distinctes et communes d’ARNm associées aux différents isoformes de Stau, à partir des mRNP présents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons réussi à mettre à l’avant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protéique direct, hsc70, partenaire dont l’association est modulable par l’action de l’ATP, ainsi qu’une population neuronale de transcrits d’ARNm. Enfin, nous avons mis en lumière l’importance de Stau1 dans la morphologie des épines dendritiques ainsi que dans le phénomène de la plasticité synaptique. / In the cell, the expression of each mRNA is finely tuned transcriptionally, but also, at the level of translation, degradation and intracellular localisation. These mechanisms of regulation are important in order to control the expression of each translational product at the right time and place. When a physiological phenomenon is activated, the expression of multiple functionally-related mRNAs must be simultaneously regulated. To orchestrate the coordinated expression of all the transcripts that respond to specific cell needs, it is advantageous to regulate the function of a common trans-acting factor that associates with them. Such a mechanism permits to control the fate of a sub-population of mRNAs according to the factors to which they are bound. As a means to learn more about the regulation of mRNAs in ribonucleoprotein complexes (mRNP), we decided to focus our study on the characterisation of Staufen-associated mRNPs. In mammalian cells, two Staufen paralogs, Stau1 and Stau2, are expressed and each gene generates different isoforms through differential splicing. Staufen proteins are double-stranded RNA binding proteins implicated in numerous aspects of the post-transcriptional regulation of mRNAs such as degradation, translation and localisation. Stau1 and Stau2 are similar proteins with an overall percentage identity of around 50%. This percentage increases to near 75% when only the functional double-stranded RNA-binding domains (dsRBD3) are compared. Similarly, Stau2 isoforms, Stau259 and Stau262, are perfectly identical except at the N-terminal extremity where the sequence of Stau262 is extended as compared to that of Stau259. Therefore, their RNA-binding domain 3 are perfectly identical. These observations bring in an interesting problematic. Are those almost identical proteins part of the same mRNP, acting in conjunction or, despite their high similarities, are they part of distinct mRNP participating in specific function? In order to address this question, we decided to immunoprecipitated from HEK293 cells, Stau155, Stau259 and Stau262-associated mRNPs and identify bound mRNAs. Resulting mRNAs isolated from each complex were identified by microarray analysis. There is a predominance of mRNAs involved in cell metabolism, transport, transcription and regulation of cell processes. The presence of at least some of these transcripts in specific mRNP was confirmed by RT-PCR. Despite the presence of a common population of mRNA associated with both Stau1 and Stau2, the majority of the transcripts were specific to each paralog. Interestingly, we observed that transcripts associated with either Stau1 or Stau2 were nevertheless involved in the same pathways of cell regulation, suggesting that both proteins have complementary roles in the same cellular processes. On the other hand, mRNAs associated with Stau259 and Stau262 were more similar. This suggests that these two isoforms might have more overlapping functions. Consistent with a model of post-transcriptional gene regulation, our results show that Stau1- and Stau2-mRNPs associate with distinct but overlapping sets of cellular mRNAs and that these mRNAs are nevertheless involved in common pathways. It is consistent with the high degree of sequence similarity between Stau1 and Stau2 that predicts that they may have conserved convergent functions and with the observation that they are distributed in distinct mRNP complexes in neurites. Knowing the importance of Stau2 in the transport of dendritic mRNA and to further understand the molecular mechanisms by which it modulates synaptic function, we decided to characterise Stau2-containing mRNPs in neurons. Using anti-Stau2 antibody to immunoprecipitate the mRNPs, we have identified a population of more than 1700 transcripts associated with Stau2 in embryonic rat brain. These mRNAs code for proteins involved in cellular processes such as post-translational modification, translation, intracellular transport and RNA metabolism. Interestingly, Stau2-associated mRNAs isolated form rat brains are relatively different from those isolated from HEK293 cells. This result suggests that the specificity of Stau2-mRNA association can differ from one tissue to the other. Similarly, we have identified the proteins presents in Stau2-containing complexes isolated from embryonic rat brains by a proteomic approach. We were able to determine the presence of mRNA-binding proteins (PABPC1, hnRNP H1, YB1 and hsc70), proteins of the cytoskeleton (α- and β -tubulin) and RUFY3 a poorly characterized protein. While PABPC1 and YB1 associate with Stau2-containing mRNPs through RNAs, hsc70 is directly bound to Stau2 and this interaction is regulated by ATP. The presence of the RNA-binding proteins YB1 and PABPC1, both involved in translation regulation, suggests that the expression of Stau2-bound mRNAs may be regulated at the level of translation initiation. Finally, it is well known that synaptic plasticity requires mRNA transport in dendrites and their local translation. Since the study of the neurophysiological role of Stau2 was already in progress we decided to concentrate our energy on the function of Stau1. Therefore, we studied the importance of Stau1 protein at the neurophysiological level, especially looking for a role in synaptic plasticity. We were able to demonstrate that Stau1 is required for the late form of long term synaptic potentiation, L-LTP, a plasticity dependent not only on local translation of mRNAs, but also on newly transcribed and transported mRNAs. Using hippocampal slices, we showed that Stau1 down-regulation by RNA interference prevents the development and/or maintenance of L-LTP. However, neurons displayed normal early-LTP, mGluR1/5-mediated long-term depression, or basal evoked synaptic transmission. In addition, at the cellular level, Stau1 down-regulation shifted spine shape from regular to elongated spines, without changes in spine density. The change in spine shape could be rescued by an RNA interference-resistant Stau1 isoform. Therefore, Stau1 is important for processing and/or transporting in dendrites mRNAs that are critical in regulation of synaptic strength and maintenance of functional connectivity changes underlying hippocampus dependent learning and memory. In conclusion we were able to further reveal the composition and the importance of the Stau1 and Stau2 mRNP. First, we have identified distinct and overlapping population of mRNAs associated to the diverse isoform of Stau, form HEK293 cells. Second, we were able to identify a population of neuronal transcript as well as some proteins factors present in the Stau2 particles. One of which, hsc70, is directly bound to Stau2 and its interaction is regulated by the presence of ATP. Finally, we have demonstrated the importance of Stau1 in the morphology of the dendritic spine as well as its fundamental implication in synaptic plasticity.

La migration radiaire est un des processus clefs de la corticogenèse menant à l’établissement d’un cortex en six couches chez les mammifères. La compréhension de ce mécanisme complexe est nécessaire à une meilleure appréhension du développement cortical. Dans ce travail de thèse, j’ai étudié la migration des neurones pyramidaux du cortex sous deux angles distincts. La 1ère partie se place d’un point de vue développemental en appréciant comment le positionnement laminaire résultant d’une migration normale ou anormale affecte la maturation neuronale. La 2nde partie se concentre sur une pathologie migratoire, l’hétérotopie en bande sous-corticale, et les altérations cognitives parfois associées à cette malformation. Pour ces deux projets, la migration neuronale a été altérée chez le rat par knockdown (KD) in utero de la doublecortine (Dcx), un effecteur majeur de la migration. Les neurones positionnés anormalement présentent une orientation incorrecte, un arbre dendritique moins développé, une spinogenère réduite et une altération morpho-fonctionnelle de la synaptogenèse glutamatergique. De plus, notre étude a mis en évidence l’implication de Dcx dans la dendritogenèse et la régulation fine des synapses glutamatergiques in vivo. Enfin, nous avons utilisé les rats Dcx-KD comme modèle d’hétérotopie en bande afin d’étudier comment un déficit de migration neuronale impacte le fonctionnement du cortex. La caractérisation comportementale, réalisée à l’aide d’une large gamme de tests, n’a pas mis en évidence de déficits majeurs des capacités motrices, somatosensorielles ou cognitives chez ces animaux. / Radial migration is one of the key processes leading to the formation of a six-layered cortex in mammals. Understanding this mechanism is necessary to get a better grasp of cortical development. During my PhD, I studied neuronal migration of pyramidal neurons from two different points of views. The 1st part is related to fundamental biology and assesses how laminar misplacement resulting from migration failure influences neuronal maturation. The 2nd one focuses on pathology by investigating a migration disorder, subcortical band heterotopia, and associated cognitive deficits. For both projects, neuronal migration was impaired in rat through in utero knockdown (KD) of doublecortin (Dcx), a major effector of cortical migration. Misplaced neurons display an abnormal orientation, a simplified dendritic arbor, a decreased spinogenesis and morpho-functional alterations of glutamatergic synaptogenesis. Moreover, our study shows that Dcx plays a role in dendritogenesis, in shaping spine morphology and in fine-tuning glutamatergic synaptogenesis. Finally, we used Dcx-KD rats as an animal model of subcortical band heterotopia to assess how migration failure would impact cortical functions. The behavioral characterization carried out through a wide range of tests did not bring to light any major shortcoming regarding motor, somatosensory or cognitive abilities in these animals. Therefore, although Dcx-KD rats display a SBH and develop spontaneous seizures, it does not seem to recapitulate cognitive deficits found in patients.

L’extraction de l’uranium a eu pour conséquence une remobilisation de cet actinide au niveau des écosystèmes avoisinants les mines. L’utilisation de sels métalliques lors de la réhabilitation des sites miniers et la présence naturelle de métaux ont accentué les niveaux de la contamination métallique dans les hydrosystèmes soumis aux rejets miniers uranifères.Des expériences in situ ont été conduites au niveau de deux anciens sites miniers uranifères français. L’encagement de l’épinoche à trois épines a été employé pour connaître les effets sublétaux de ce mélange métallique, ainsi que sur la susceptibilité de ce poisson envers un stress biologique.Cette pollution, caractérisée par de plus importantes concentrations métalliques (notamment en uranium), a entraîné un stress oxydant chez l’épinoche visible sur plusieurs biomarqueurs, ainsi que d’autres effets dépendants du site d’exposition.La contamination polymétallique a occasionné une augmentation de la susceptibilité des épinoches au stress biologique, en empêchant leurs réponses phagocytaire antioxydante à ce stress. Ces travaux ont permis de renforcer l’intérêt de la technique d’encagement lors d’une étude environnementale, et celui des immunomarqueurs au sein d’une approche multi-biomarqueurs. / Uranium extraction has resulted in a remobilisation of this actinide into mine surrounding ecosystems. Uses of metal salts during mining site rehabilitation, and the natural presence of metals have increased the metal contamination in hydrosystems submitted to mine tailings.In situ experiments were conducted in two former French uranium mining sites. Three-spined stickleback caging was used to determine the sublethal effects of this metal mixture on this freshwater fish, as well as its effects on fish susceptibility to a sudden biological stress.This pollution, characterised by higher metal concentrations (especially for uranium), has led to an oxidative stress in sticklebacks visible through several biomarkers, and other effects dependent on the study site. The polymetallic contamination has modified the stickleback responses to the biological stress, by preventing their phagocytic and antioxidant responses. This work has reinforced the interest of the caging technique during environmental studies and that of immunomarkers in a multi-biomarker approach.

L’encéphalite limbique à auto-anticorps anti-CASPR2 est une atteinte du système nerveux central, caractérisée par la présence des auto-anticorps (autoAcs) dirigé contre CASPR2 dans le sérum et fluide céphalorachidien. La pathologie affecte majoritairement des hommes âgés présentant l’épilepsie comme symptôme prédominant. CASPR2 est une molécule d’adhésion neuronale, connue pour son rôle d’assemblage des canaux Kv1, régulateurs de l’excitabilité neuronale, à la région juxtaparanodale du nœud de Ranvier, une organisation essentielle pour la conduction saltatoire des flux nerveux. Un nombre croissant de données dans la littérature suggère un rôle pour CASPR2 dans des fonctions synaptiques et l’activité neuronale. Ceci pourrait expliquer l’épilepsie, un symptôme neurologique qui trouve son origine dans la perturbation de l’activité neuronale, observée chez les patients avec de l’encéphalite limbique anti-CASPR2. Dans ce travail de thèse, j’ai utilisé des autoAcs de patients comme outil pour investiguer le rôle de CASPR2 dans des neurones normalement développés en culture, permettant aussi d’évaluer l’effet des autoAcs des patients sur les fonctions synaptiques et de révéler des mécanismes physiopathologiques possibles sous-jacents à la maladie. Je me suis d’abord intéressée aux effets des autoAcs des patients sur l’expression et la distribution en surface de CASPR2 et sur l’expression des canaux Kv1.2 dans des neurones hippocampiques matures in vitro. J’ai montré que les neurones inhibiteurs sont positifs pour les canaux Kv1.2 et CASPR2 en surface, et que les autoAcs de patients augmentent l’expression de Kv1.2 et n’induisent pas l’internalisation de CASPR2. Dans un second temps, j’ai analysé les effets des autoAcs de patients sur les synapses excitatrices et inhibitrices dans des neurones hippocampiques immatures et matures in vitro. Dans les neurones immatures, la densité des épines dendritiques et le contenu des récepteurs AMPA sont augmentés, tandis que dans les neurones matures l’altération de la géphyrin suggère une perturbation de la transmission neuronale après traitement avec des autoAcs de patients. Mes résultats permettent de mieux comprendre les fonctions de CASPR2 dans les processus synaptiques et révèlent des mécanismes pathologiques possibles des autoAcs anti-CASPR2 menant à la présentation clinique des patients atteints d’encéphalite limbique anti-CASPR2 / Anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis is a central nervous system disorder, characterized by the presence of autoantibodies (autoAbs) directed against CASPR2 in the serum and cerebrospinal fluid. Elderly men are mostly affected, with epilepsy being the predominant symptom. CASPR2 is a neuronal cell adhesion molecule, known for its role in gathering Kv1 channels, regulators of neuronal excitability, at the juxtaparanodal region of the node of Ranvier, an essential organization for saltatory conduction of nervous influxes. Increasing sets of data in literature point out a role for CASPR2 in synaptic functions and neuronal activity. This could explain the observed epilepsy, a neurological symptom that finds its origin in disturbed neuronal activity, in patients with anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis. In this work, I used patients’ autoAbs as a tool to investigate the role of CASPR2 in normally developed cultured neurons which also allowed me to assess the effects of patients’ autoAbs on synaptic functions and reveal possible physiopathological mechanisms underlying the disease. I first assessed the effects of patients’ autoAbs on CASPR2 surface expression and distribution and on Kv1.2 channel expression in mature in vitro hippocampal neurons. I provided evidence that inhibitory neurons are positive for both Kv1.2 channels and surface CASPR2, and that patients’ autoAbs increase Kv1.2 expression and do not induce CASPR2 internalization. Secondly, I analyzed effects of patients’ autoAbs on excitatory and inhibitory synapses in vitro, in immature and mature hippocampal neurons. In immature neurons, dendritic spine densities and AMPA receptor content are increased, while in mature neurons alteration of gephyrin suggests disturbed neuronal transmission after treatment with patients’ autoAbs. My results allow for a better understanding of CASPR2 functions in synaptic processes and unravel possible pathological mechanisms regarding how anti-CASPR2 autoAbs lead to the clinical presentation of patients with anti-CASPR2 autoimmune limbic encephalitis

Les épines dendritiques sont de petites protrusions post-synaptiques présentant des changements morphologiques corrélés avec la plasticité synaptique. Elles ont pour origine les filopodes dendritiques qui s’élargissent lors du contact avec l’axone. Ces changements morphologiques impliquent une grande variété de molécules dont des protéines associées à l’actine et des protéines d’adhésion. Cependant, comment ces différentes protéines sont coordonnées dans le temps et l’espace est encore largement méconnu. De plus, les techniques de microscopie conventionnelle ne permettent pas d’étudier l’organisation et la dynamique de ces protéines dans les épines dont la taille est proche de la limite de resolution. L’objectif de ma thèse a donc été d’explorer le rôle des protéines associées à l’actine ainsi que celui des protéines d’adhésion N-cadhérines dans l’organisation et la dynamique du cytosquelette d’actine des épines dendritiques. Dans une première étude, nous avons suivi la motilité des filopodes et épines dendritiques de neurones en visualisant l’actine-GFP. Nous avons couplé cette approche avec : 1) une technique de piégeage optique de microsphères recouvertes de N-cadhérines ou des substrats micro-imprimés également recouverts de N-cadhérines afin de contrôler temporellement et spatialement les adhésions cadhérine-cadhérine, 2) la stimulation pharmacologique de la myosine II afin d’induire la contraction F-actine/myosine et 3) l’expression de mutants de N-cadhérine non adhésifs. Nous avons ainsi démontré que la stabilisation des filopodes en épines était dépendante de l’engagement d’un embrayage moléculaire entre les adhésions trans-synaptiques N-cadhérine et le flux rétrograde d’actine généré par les myosines II. Dans une deuxième étude, nous avons utilisé la microscopie super-résolutive (PALM et dSTORM) et le suivi de protéines individuelles (sptPALM) pour étudier l’organisation et la dynamique à l’échelle nanométrique des protéines à l’origine des réseaux d’actine branchés dans les épines. Ainsi, nous avons caractérisé la localisation et la dynamique de l’actine, du complexe Arp2/3, du complexe WAVE, d’IRSp53, de VASP et de Rac-1. Nous avons montré que, contrairement aux structures motiles classiques comme lamellipode, le réseau d’actine branché dans les épines n’ést pas formé aux extrémités protrusives puis incorporé dans un flux rétrograde d’actine. Ce réseau est initié à la PSD puis croît vers l’extérieur afin de générer les protrusions membranaires responsablent des changements morphologiques de l’épine. Nos résultats montrent également qu’un contrôle strict de l’activité de Rac-1 est nécessaire au maintien de la morphologie des épines dendritiques et de l’architecture du réseau d’actine branché. L’ensemble de mon travail souligne l’importance du rôle de l’organisation à l’échelle nanométrique du réseau d’actine branché et des adhésions N-cadhérine dans la dynamique et la formation des épines dendritiques. Ces résultats pourraient avoir un rôle important dans la compréhension des changements morphologiques lors de la plasticité synaptique. / Dendritic spines are tiny post-synaptic protrusions exhibiting changes in morphology correlated with synaptic plasticity. They originate from motile dendritic filopodia, which enlarge after contacting axons. These morphological changes involve a wide number of molecular actors, including actin-binding proteins, and adhesion molecules. However, how these various molecular components are coordinated temporally and spatially to tune changes in spine shape remains unclear. Furthermore, conventional photonic microscopy techniques could not achieved the spatial resolution required to study the dynamic nanoscale organization of these proteins within the micron size dendritic spines. The objective of my Ph.D. was to unravel how actin-binding proteins and N-cadherin adhesion regulate the organization and dynamics of F-actin network in dendritic spines. In a first study, we measured the motility of dendritic filopodia and spines by time lapse imaging of actin-GFP in primary hippocampal neurons. We combined those measurements with: 1) manipulation of N-cadherin coated beads with optical tweezers, or micropatterns to control the timing and location of nascent N-cadherin adhesions, 2) pharmacological stimulation of myosin II to trigger contraction of the F-actin/myosin network and 3) expression of non-adhesive N-cadherin mutants to compete for the interaction between N-cadherin adhesion and F-actin. Using these different approaches we demonstrated that the stabilization of dendritic filopodia into mature spines was dependent on the engagement of a molecular clutch between trans-synaptic N-cadherin adhesions and the myosin driven F-actin flow. In a second study, we used super resolution microscopy (PALM and dSTORM) and single protein tracking (sptPALM) to study the dynamic nanoscale organizations of branched actin networks within dendritic spines. Using these technics, we characterized within dendritic spines, the localization and dynamics of actin, Arp2/3 complex, WAVE complex, IRSp53, VASP and Rac-1. We established that, opposite to classical motile structures such as the lamellipodium, branched F-actin networks in dendritic spines are not formed at the tip of membrane protrusions and incorporated in a retrograde flow. On the contrary, they are growing outwards from the PSD generating membrane protrusions responsible for spine motility. We also show that a thigh control of Rac1 activity is required to maintain dendritic spine morphology and branched actin network organization. Altogether, these studies point out the role of the nanoscale functional organization of F-actin networks and its linkage to adhesion proteins in the regulation of dendritic spine formation and dynamics. These findings may have important implications in the understanding of spine morphology changes driven by synaptic activity.

Le cerveau est un organe complexe composé de neurones et des cellules non-neuronales. La communication entre les neurones a lieu via les synapses, dont le remodelage morphologique est considéré essentiel pour le traitement et le stockage des informations dans le cerveau des mammifères. Récemment, ce point de vue neuro-centré de la fonction synaptique a évolué, en prenant également en compte les processus gliaux à proximité immédiate de la synapse. Cependant, comme leur structure est bien en deçà de la résolution spatiale de la microscopie optique conventionnelle, les progrès dans les enquêtes dans leur environnement physiologique, le cerveau intact, ont été entravés. En effet, on sait peu sur les variations nanométriques de la morphologie des épines dendritiques et l'interaction avec les processus gliaux, et, finalement, comment elles affectent la transmission synaptique in vivo. Dans cette thèse, nous cherchons à visualiser la dynamique de la nano-morphologie des épines dendritiques et les processus gliaux dans le cortex à tonneaux de souris in vivo. Nous avons donc mis en place l’imagerie super-résolution 2P-STED en temps réel, ce qui permet une haute résolution spatiale et la pénétration profonde des tissus, chez la souris anesthésiée in vivo. Nous montrons que la nano-morphologie des épines est diversifiée, variable, mais globalement stable, et que les différences dans la morphologie des épines peut avoir un effet sur leur compartimentation in vivo. En outre, la mise en œuvre de l’imagerie super-résolution en double couleur in vivo et le développement d'une approche de marquage astrocytaire, nous ont permis de fournir la caractérisation à l'échelle nanométrique des interactions neurone-glie. Ces résultats apportent un aperçu sans précédent dans la dynamique de la synapse à l'échelle nanométrique in vivo, et ouvrent la voie à une meilleure compréhension de la façon dont les réarrangements morphologiques des synapses contribuent à la physiologie du cerveau. / The brain is a complex organ consisting of neurons and non-neuronal cells. Communication between neurons takes place via synapses, whose morphological remodeling is thought to be crucial for information processing and storage in the mammalian brain. Recently, this neuro-centric view of synaptic function has evolved, also taking into account the glial processes in close vicinity of the synapse. However, as their structure is well below the spatial resolution of conventional light microscopy, progress in investigating them in a physiological environment, the intact brain, has been impeded. Indeed, little is known on the nanoscale morphological variations of dendritic spines, the interaction with glial processes, and how these affect synaptic transmission in vivo. Here, we aim to visualize the dynamic nano-morphology of dendritic spines in mouse somatosensory cortex in vivo. We implemented super-resolution 2P-STED time-lapse imaging, which allows for high spatial resolution and deep tissue penetration, in anesthetized mice, and show that the nano-morphology of spines is diverse, variable, but on average stable, and that differences in spine morphology can have an effect on spine biochemical compartmentalization in vivo. Moreover, implementation of dual color in vivo super-resolution imaging and a novel astrocytic labeling approach provided the first steps towards nanoscale characterization of neuron-glia interactions in vivo. These findings bring new insights in synapse dynamics at the nanoscale in vivo, and our methodological endeavors help pave the way for a better understanding of how nanoscale aspects of spine morphology and their dynamics might contribute to brain physiology and animal behavior.

La maladie d’Alzheimer est caractérisée par un déclin progressif des capacités cognitives. Les Aßo induisent des dysfonctionnements de la transmission via une altération des récepteurs au glutamate et une perte de synapses.Nos récents résultats démontrent que le VEGF facilite la plasticité synaptique et la mémoire chez des souris via son action sur son récepteur VEGFR2. Nous avons montré que le VEGF stimule l’insertion synaptique des récepteurs glutamatergiques et la formation de synapses, suggérant ainsi un rôle dans la modulation des altérations synaptiques observées dans la maladie d’Alzheimer.Notre objectif est d’étudier le rôle du VEGF, spécifiquement dans la maladie d’Alzheimer. Tout d’abord, nous avons examiné son expression en relation avec les plaques séniles chez des patients et dans un modèle de la maladie d’Alzheimer. Nos résultats ont démontré une colocalisation entre le VEGF et ces plaques.Afin d’examiner plus finement l’interaction Aß-VEGF, nous avons analysé la liaison entre les Aßo et le VEGF en test ELISA et puces à peptides. Nous avons ainsi démontré un potentiel blocage de l’interaction entre le VEGF et son récepteur, menant à des défauts de son activation.Enfin, nous avons examiné si le VEGF prévient les altérations synaptiques par des approches électrophysiologiques, biochimiques et immunocytochimiques. Nos résultats démontrent que lors d’un traitement aux Aßo, le VEGF restaure la LTP, l’expression des récepteurs au glutamate et limite la perte synaptique.Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent que l’interaction Aß-VEGF altère la voie du VEGF chez les patients. De plus, le VEGF réduit la toxicité induite par les Aßo sur les synapses / Alzheimer disease (AD) is characterized by a progressive decline in cognitive abilities. Amyloid-ß oligomers (Aßo) trigger synapse dysfunction through defects in glutamate receptor function and subsequent dendritic spine loss. These synaptic impairments compromise memory and contribute to cognitive deficits.Our recent findings revealed that VEGF facilitates synaptic plasticity and memory in mice through its VEGFR2 receptor in neurons. We showed that VEGF promotes glutamate receptor synaptic insertion and stimulates dendritic spine formation, suggesting it may be a key candidate for alleviating synapse damage in AD.Our objective is to study the role of VEGF in synapse protection in AD models and unravel the underlying mechanisms.First, we examined the VEGF expression pattern in postmortem brain tissue from AD patients and APPPS1 model of AD. Our results showed a partial colocalization between VEGF and Aß plaques in AD patients and APPPS1 brains.To further investigate the Aß-VEGF interaction, we used Elisa assay and peptide arrays and demonstrated that Aßo binds several domains of VEGF, impedding VEGFR2 activation.Finally, we examined whether VEGF can prevent synapse damage induced by Aßo using electrophysiological, biochemical and 3D modelling approaches. Our results demonstrated that VEGF treatments can restore LTP in Aßo-treated hippocampal slices, glutamate receptor content at synapses and increase dendritic spine density.All together, our results suggest that Aß-VEGF interaction may alter VEGF pathway in AD and that VEGF reduces Aßo-induced toxicity at synapses by modulating glutamate receptor expression and promoting spine formation and/or stabilization