Les circuits neuronaux sous-tendant la locomotion requièrent d'intégrer à la fois des stimuli sensoriels et l'état physiologique. Cependant, la manière dont ces circuits fonctionnent pendant la locomotion active reste peu comprise. La larve de poisson zèbre est un organisme vertébré idéal pour étudier cette question de part son répertoire locomoteur simple et son accessibilité à la manipulation génétique. Dans le Chapitre 1, je décris le logiciel que nous avons développé afin de nous permettre de traquer les comportements et caractériser automatiquement les modules locomoteurs à haut débit. Les interneurones V2a sont des neurones excitateurs de la moelle épinière et du cerveau postérieur caractérisés par l'expression du facteur de transcription chx10. Afin de tester leur implication dans la locomotion, j'ai, dans le Chapitre 2, validé l'utilisation d'une toxine génétiquement encodée dans le but d'inhiber la population chx10 positive in vivo. Par analyse comportementale, enregistrements de locomotion fictive et imagerie calcique, nous avons montré que les V2as sont impliqués différemment dans la locomotion lente et rapide. Les neurones contactant le liquide céphalorachidien (NcLCRs) relaient des informations sensorielles aux circuits moteurs. Par ciblage génétique, imagerie calcique, pharmacologie et électrophysiologie, j'ai, dans le Chapitre 3, investigué le rôle de l'activité spontanée dans les NcLCRs. J'ai montré que l'ouverture de canaux PKD2L1 représentait une source intrinsèque d'activité spontanée dans les NcLCRs. Ces résultats offrent une meilleure compréhension de la manière dont les interactions dynamiques structurent les sorties locomotrices in vivo. / The neural networks that underlie locomotion are complex and require integration of sensory input and physiological state. However, how these networks function during active locomotion to incorporate sensory input from the environment and the internal state of the animal remains poorly understand. The zebrafish larva is an ideal vertebrate to study these questions thanks to its simple locomotor repertoire, transparency, and amenability to genetic manipulation. In Chapter 1, I describe a program to track behavior at high speeds and automatically characterize locomotor patterns in a high-throughput manner. V2a interneurons are excitatory interneurons in the spinal cord and hindbrain identified by the chx10 transcription factor. In Chapter 2, I validated the use of a genetically-encoded botulinum toxin to silence the chx10 population in vivo. Using fictive locomotor recordings and calcium imaging, I demonstrated that silencing V2as leads to decreased activity in primary motor neurons during fast swimming, corresponding to a lower swimming frequency in V2a-silenced larvae. Cerebrospinal fluid-contacting neurons (CSF-cNs) are intraspinal neurons that relay sensory information to motor circuits. CSF-cNs in diverse species express GABA and the transient receptor potential channel PKD2L1. In Chapter 3, I used genetic targeting, calcium imaging, pharmacology, and electrophysiology to investigate the role of spontaneous activity in CSF-cNs. I showed that single channel opening of PKD2L1 represents an intrinsic source of spontaneous activity in CSF-cNs. These tools and results will allow a more complete picture of how dynamic interactions shape locomotor output in vivo.

Comprendre les mécanismes mis en place au sein du système nerveux pour générer des répertoires locomoteurs complexes reste l'un des grands défis des neurosciences systémiques. Le travail présenté dans ce manuscrit vise à comprendre comment les neurones de la moelle épinière contribuent à la production et à la modulation de l'activité locomotrice. Pour répondre à ce problème, nous utilisons le poisson-zèbre comme organisme modèle et avons développé de nouvelles approches génétiques et optiques afin de disséquer l'architecture du circuit formé par une classe de neurones sensoriels de la moelle et qui est conservée chez tous les vertébrés. Ces neurones sont appelés les neurones au contact du liquide céphalo-rachidien (Nc-LCR) et nous proposons de sonder leur(s) fonction(s) in vivo. Ces neurones sensoriels forment une interface unique entre le liquide céphalo-rachidien et le réseau de neurones impliqué dans le contrôle du mouvement dans la moelle épinière. Cependant, leur diagramme de connectivité demeure complètement inconnu. Afin de comprendre comment ces " Nc-LCR ou CSF-cNs " modulent la locomotion chez les vertébrés, nous avons développé un projet combinant des approches génétiques, électrophysiologiques, d'imagerie, et d'analyse du comportement, afin de cartographier le circuit qu'elles forment avec les neurones de la moelle épinière. Nos résultats montrent que les CSF-cNs projettent sur de nombreux éléments du centre générateur de rythme de la moelle. Notre approche révèle également la capacité des CSF-cNs à moduler la locomotion selon l'état dans lequel se trouve l'animal, une propriété caractéristique des circuits proprioceptifs dans la moelle épinière. / Understanding how the central nervous system generates motor sequences, coordinates limbs and body orientation in an ever-changing environment, while adapting to sensory cues remains a central question in the field of systems neuroscience. The work presented here aims to understand how local sensory neurons in the spinal cord contribute to the production and/ or the modulation of locomotor activity. We focused our work on a conserved class of spinal sensory neurons termed cerebrospinal fluid contacting neurons (CSF-cNs). These neurons lie at the interface between the CSF and spinal interneurons controlling motor output and represent an interesting yet poorly understood sensorimotor loop in the vertebrate spinal cord. However, the connectivity of CSF-cNs remains completely uncharacterized. To understand how CSF-cNs modulate locomotion in vertebrates, we combined genetics, imaging, optogenetics, electrophysiology, and behavior analysis to map the functional connectivity of these sensory neurons and test their function in the zebrafish larva. Our results demonstrate that CSF-cNs target several elements thought to be part of the locomotor central pattern generator in zebrafish, including glutamatergic spinal neurons involved in slow and fast swimming. We show that CSF-cNs can modulate the duration and occurrence of spontaneous locomotor events in a state dependent manner and tune the frequency of evoked fast escape responses. Altogether our work dissecting sensorimotor integration in the spinal cord bridged single cell function in vivo to behavior in zebrafish and should contribute to a better understanding of the role of sensory feedback during locomotion in vertebrates.

Différentes études précédentes ont démontré que IL-1β et PKA peuvent réduire la transmission synaptique inhibitrice dans la LAMINA II de la moelle épinière, en contribuent de cette manière au développement de douleur chronique de tipe inflammatoire. Au niveau des sites post-synaptiques, les changements dans la transmission synaptique (par exemple suivant le relâchement de IL-1β ou après l’activation de PKA), reflètent donc des changements dans les propriétés et/ou dans le nombre des molécules présentes au niveau de la synapse. Au cours de mon doctorat, j’ai pu profiter des techniques basés sur l’imagerie des molécules uniques afin d’étudier les effets de PKA et IL-1β sur la dynamiques et le nombre absolu de GlyR dans les synapses de la moelle épinière. Mes résultats ont montré que PKA et Il-1β peuvent déplacer les GlyR des sites inhibitoires post-synaptiques ciblent différentes sous-unités α du récepteur de la glycine. Comme les sous-unités GlyRα ne se lient pas directement à la géphyrine, ces effets sont vraisemblablement le résultat d’un changement de conformation du GlyR dépendant de la sous-unité. Pendant mon projet, j’ai utilisé la technique de microscopie de super-résolution PALM pour développer une méthode pour déterminer la stœchiométrie des GlyR et le nombre absolu de récepteurs et des molécules d’échafaudage au niveau des synapse de la moelle épinière. Mes résultats décrivent que les GlyR se composent de 3 sous-unités α et de 2 sous-unités β, et proposent qu’une synapse de la moelle épinière contient en moyenne 80 GlyR et 250 molécules de géphyrine. Ces résultats sont essentiels pour mettre en relation l’ampleur des mécanismes de régulation et de plasticité agissant sur la transmission synaptique, avec les changements en nombre de molécules présentes dans les synapses de la moelle épinière. Sur la base de mes découvertes on pourra maintenant étudier les mécanismes structuraux impliqués dans la régulation de la fonction et la dynamique des GlyR dépendantes des sous-unités α que j’ai démontré. / IL-1β and PKA impair glycine receptor-mediated synaptic transmission in the lamina II of the spinal cord, contributing to the development of inflammatory types of chronic pain. At post-synaptic sites, the strength of synaptic transmission depends on the biophysical properties and on the absolute number of receptors expressed. Consequently, changes in synaptic transmission (i.e. following the release of IL-1β or the activation of PKA), reflect changes in the properties and/or number of molecules present at the synapse. During my PhD I have taken advantage of single-molecule based imaging techniques to study the effects of IL-1β and PKA on the dynamics and absolute numbers of GlyRs at spinal cord synapses.My results show for the first time that both Il-1β and PKA displace GlyRs from inhibitory post-synaptic sites, targeting different α-subunit of GlyRs. Specifically, IL-1β reduces GlyR α-containing receptors at spinal cord synapse, whereas PKA affects GlyR α3L subunit. Given that the GlyR α subunits do not bind to the gephyrin scaffold, these effects likely reflect an α-subunit dependent change in GlyR conformation that decreases the affinity of the GlyR subunits for gephryrin. Glycine receptors are composed of α- and β- subunits that assemble into heteropentameric complexes with an unclear stoichiometry. Using super resolution PALM microscopy I have developed a single-molecule counting approach to determine the stoichiometry of GlyRs and the absolute number of receptor and scaffold molecules at spinal cord synapses. According to my results GlyRs is composed by 3 α and 2 β-subunits, and an average spinal cord synapse contains around 80 GlyRs and 250 scaffold molecules. These data are fundamental to relate the magnitude of regulatory and plasticity mechanisms acting on glycinergic transmission, with quantitative changes in molecule numbers at spinal cord synapses. My research has shown how absolute quantitative approaches can help achieve a more detailed insight into the organization of complex molecular assemblies and their dynamic regulation.

Certaines observations suggèrent que les afférences méchano-sensorielles peuvent moduler l’activité des générateurs centraux du rythme locomoteur (ou Central Pattern Generators, CPGs). Cependant, il est impossible d’explorer les circuits neuronaux sous-jacents chez l’animal en mouvement à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques lors d’expériences de locomotion dite « fictive ». Dans cette étude, nous avons enregistré de façon sélective et non-invasive les neurones moteurs et sensoriels dans la moelle épinière pendant la locomotion active en ciblant génétiquement le senseur bioluminescent GFP-Aequorin chez la larve de poisson zèbre. En utilisant l’imagerie calcique à l’échelle des neurones individuels, nous confirmons que les signaux de bioluminescence reflètent bien le recrutement différentiel des groupes de motoneurones spinaux durant la locomotion active. La diminution importante de ces signaux chez des animaux paralysés ou des mutants immobiles démontre que le retour méchano-sensoriel augmente le recrutement des motoneurones spinaux pendant la locomotion active. En accord avec cette observation, nous montrons que les neurones méchano-sensoriels spinaux sont en effet recrutés chez les animaux en mouvement, et que leur inhibition affecte les réflexes d’échappement chez des larves nageant librement. L’ensemble de ces résultats met en lumière la contribution du retour méchano-sensoriel sur la production locomotrice et les différences qui en résultent entre les locomotions active et fictive. / There is converging evidence that mechanosensory feedback modulates the activity of spinal central pattern generators underlying vertebrate locomotion. However, probing the underlying circuits in behaving animals is not possible in “fictive” locomotion electrophysiological recordings. Here, we achieve selective and non-invasive monitoring of spinal motor and sensory neurons during active locomotion by genetically targeting the bioluminescent sensor GFP-Aequorin in larval zebrafish. Using GCaMP imaging of individual neurons, we confirm that bioluminescence signals reflect the differential recruitment of motor pools during motion. Their significant reduction in paralyzed animals and immotile mutants demonstrates that mechanosensory feedback enhances the recruitment of spinal motor neurons during active locomotion. Accordingly, we show that spinal mechanosensory neurons are recruited in moving animals and that their silencing impairs escapes in freely behaving larvae. Altogether, these results shed light on the contribution of mechanosensory feedback to motor output and the resulting differences between active and fictive locomotion.

En état de douleur chronique, la sensibilisation centrale s’accompagne d’une modification de l’équilibre excitation/inhibition en faveur d’une excitation accrue de la corne dorsale de la moelle épinière. Cet équilibre implique des molécules d’adhérence telles que les neuroligines postsynaptiques (NLs). Dans une première partie de notre travail de thèse, nous avons étudié la régulation éventuelle de ces protéines dans un modèle de douleur neuropathique (Spinal Nerve Ligation, SNL) chez le rat. Nos données ont montré une surexpression inattendue de la NL2, généralement associée à l’inhibition, alors que l’expression de la NL1, généralement associée à l’excitation, ne change pas. Le blocage de l’expression de NL2 in vivo par application intrathécale de siRNA, a produit des effets anti-nociceptifs réversant de façon significative l’allodynie mécanique observée chez les rats SNL. L’étude ultérieure des partenaires pré- et postsynaptiques de NL2, a démontré une co-variation spécifique avec PSD95, une protéine d’échafaudage des synapses excitatrices. De plus, une approche par co-immunoprécipitation a mis en évidence une augmentation significative des interactions protéiques NL2 /PSD95 chez les rats SNL. Enfin, cette association inhabituelle en condition neuropathique, est apparue liée à la surexpression spécifique de NL2(-), un variant d’épissage de NL2 normalement minoritaire en condition physiologique. La surexpression, l’augmentation d’association avec PSD95, et l’effet pro-nociceptif inattendu de la NL2 « inhibitrice » en condition de douleur neuropathique, indiquent une permutation fonctionnelle de la NL2 de l’inhibition vers l’excitation modifiant le rapport synaptique en faveur d’une excitation globale plus élevée dans la corne dorsale.Dans une deuxième partie du travail, nous avons exploré le rôle des molécules d’adhérence NLs dans la sensibilisation spinale associée à un autre type de douleur chronique, à savoir la douleur cancéreuse, sur un modèle de cancer de l’os chez le rat. L’étude de l’expression des NLs et de leurs partenaires, a montré une augmentation d’expression spécifique de la NL1 et de S-SCAM, une autre protéine d’échafaudage des synapses excitatrices. D’autre part, d’après la littérature, ce modèle se caractérise par une importante activation gliale dans les cornes dorsales de la moelle épinière, se traduisant notamment par une astrogliose massive. Cependant, nous avons montré que dans le modèle utilisé, il n’y avait aucune variation ni de marqueurs classiques de l’activation astrocytaire (GFAP, S100β), ni des marqueurs microgliaux (OX-42 et Iba1). Au contraire, tous ces paramètres étaient effectivement augmentés dans la corne dorsale ipsilatérale d’animaux neuropathiques. Ces résultats suggèrent que, contrairement à ce qui a été décrit précédemment, la douleur cancéreuse d’origine osseuse n’est pas nécessairement corrélée à une surexpression spinale des marqueurs de la glie réactive, tandis que la douleur neuropathique l’est.En conclusion, nos résultats obtenus dans le modèle de douleur cancéreuse montrent un phénotype concernant des molécules impliquées dans la formation, la spécification et la modulation des synapses, bien différent de celui que nous avons mis en évidence dans le modèle de douleur neuropathique. Nous montrons notamment dans les deux modèles, une implication bien distincte des molécules d’adhérence NLs et de la glie confortant les données de la littérature indiquant que ces deux grandes catégories de douleur chronique ont chacune une signature propre. De plus, nos résultats ouvrent la perspective d’identifier de nouveaux diagnostics et/ou de nouvelles possibilités thérapeutiques, en ciblant spécifiquement les NLs. / In chronic pain states, central sensitization is associated with a modification in the excitation/inhibition balance toward increased excitation in the spinal dorsal horn. This balance involves adhesion molecules such as the postsynaptic Neuroligins (NLs). In a first part of our thesis work, we investigated the putative regulation of these proteins in the Spinal Nerve Ligation (SNL) model of neuropathy in the rat. Our data showed an unexpected upregulation of NL2, usually associated to inhibition, whereas expression of NL1, usually associated to excitation, did not change. The in vivo expression blockade of NL2 by intrathecal injection of siRNAs, produced specific antinociceptive effects, significantly reversing the SNL-induced mechanical allodynia. Subsequent study of pre- and postsynaptic NL2 partners, demonstrated a specific co-variation with PSD95, a scaffolding protein of excitatory synapses. Moreover, a co-immunoprecipitation approach showed a significant increase of NL2/PSD95 protein interactions in SNL rats. Finally, this unusual association in neuropathic conditions, appeared to be linked to specific over-expression of NL2(-), a NL2 splice variant usually a minority in physiological conditions. Over-expression, increased association with PSD95, and unexpected pronociceptive effect of the “inhibitory” NL2 in neuropathic pain condition, suggest a functional shift of NL2 from inhibition to excitation changing the synaptic ratio toward higher overall excitation in the dorsal horn.In a second part of our work, we investigated the role of the NLs adhesion molecules in spinal sensitization associated with another type of chronic pain, namely cancer pain, using a rat model of bone cancer. The study of the expression of NLs and partners, showed a specific increase in the expression of NL1 and S-SCAM, another postsynaptic scaffolding protein at excitatory synapses. Moreover, according to the literature, this model is characterized by a strong glial activation in the spinal dorsal horn, identified especially by a massive astrogliosis. However, we showed that in the bone cancer model used, there was no variation, neither in the classical markers of astrocyte activation (GFAP, S100β), nor in microglial markers (OX-42 et Iba1). On the contrary, all these parameters did actually increase in the ipsilateral dorsal horn of SNL neuropathic rats. These results suggest that, at odd with what was previously described, bone cancer pain is not necessarily correlated with a spinal overexpression of markers of reactive glia, whereas neuropathic pain is.In conclusion, our results obtained with the cancer pain model, show that the molecules involved in the formation, specification and modulation of synapses, yield a phenotypes clearly different to the one evidenced in the model of neuropathic pain. More particularly, we show in the two models, a well distinct involvement of the NL adhesion molecules and of glia, reinforcing reports from the literature, which indicate that the two important categories of chronic pain, cancer and neuropathic, each have a peculiar signature. Moreover, our results raise the possibility that new diagnosis and/or new therapeutic possibilities may emerge from targeting NL expression

Les mouvements locomoteurs rythmiques nécessitent l’intervention de circuits neuronaux qui coordonnent l’activité motrice des deux parties du corps. Ces circuits sont formés majoritairement par les projections des interneurones commissuraux de la moelle épinière. Des facteurs de guidage comme la Nétrine, les Slits jouent un rôle fondamental dans la mise en place de ces projections. Une étude a également montré qu’une signalisation impliquant le récepteur Neuropiline2 (Nrp2) des signaux Sémaphorines de la classe 3 (Sema3), participe au guidage de ces projections et cela uniquement après la traversée de la ligne médiane (Zou et al. 2000). Ma thèse porte sur l’étude fonctionnelle d’un ligand de la Nrp2, la Sema3B dans le développement de ce système de projections. J’ai analysé une souris invalidée pour Sema3B et observé de nombreuses erreurs de trajectoires après la traversée de la ligne médiane. Je me suis ensuite intéressée aux mécanismes sous-jacents au gain de réponse : par une approche pharmacologique et biochimique j’ai pu montrer que le signal de la plaque du plancher inhibe une activité de dégradation dépendante de la calpaine1. L’inhibition de cette voie conduit à la stabilisation d’un co-récepteur de la Nrp2, la Plexine A1 dont l’expression est très faible dans les axones n’ayant pas encore traversé la ligne médiane. Cette régulation permet alors l’assemblage d’un complexe récepteur fonctionnel de Sema3B, comprenant cette Plexine associée à la Nrp2 au niveau des cônes de croissance. J’ai identifié la molécule d’adhérence NrCAM, et le facteur neurotrophique GDNF comme étant les facteurs de la plaque du plancher déclencheurs de la réponse / Rhythmic locomotor movements require neuronal circuits ensuring left-right coordination. Spinal commissural projections participate to left-right coordination of limb movements by mediating reciprocal inhibition in synchrony. Extensive research of the mechanisms governing the formation of commissural pathways focused on dorsally-located spinal commissural neurons, establishing a fundamental role for multiple guidance cues derived for the midline and surrounding tissues, including Netrins, Slits and various morphogens. Semaphorin (Sema2)/Neuropilin-2 (Nrp2) signaling has been proposed to contribute to the guidance of commissural projections in the spinal cord at the post- but not pre-crossing stage (Zou et al, 2000). My PhD project aimed at analyzing the role of a Nrp2 ligand, Sema3B, in the guidance of spinal commissural projections, whose expression is dynamic and restricted to some territories, including the floor plate in which axons cross the midline. Analysis of Sema3B null mice showed that the loss of Sema3B induces a range of guidance defects of post-crossing commissural pathways. I investigated the underlying mechanisms and found that the floor plate signal induces through blockade of a calpain 1-dependant pathway the stabilization of the Nrp2 co-receptor Plexin-A1, and enable the assembly of Nrp2/Plexin-A1 sub-units into functional complexes for Sema3B in post-crossing commissural growth cones. I identified the cell adhesion molecule NrCAM and the neurotrophic factor GDNF as being the floor-platederived signals triggering the gain of response

Alors que les synapses sont des structures relativement stables, les éléments qui la composent sont, eux, en permanent échange dans le temps et dans l'espace. Les composants des densités postsynaptiques sont renouvelés avec des cinétiques caractéristiques de chaque molécule et de chaque sous compartiment synaptique. La compatibilité entre le comportement dynamique des composants de la synapse et son maintien structural et fonctionnel à long terme implique une conception de ces assemblages multimoléculaires en équilibre dynamique. De nombreux paramètres peuvent influencer la dynamique des récepteurs aux neurotransmetteurs (RNT) dans les synapses, y compris l'activité synaptique et les protéines de la matrice extracellulaire. Cependant, le rôle des cellules gliales dans ce mécanisme est inconnu. Mon travail de thèse a porté sur l'exploration d'une possible contribution de la microglie, les cellules immunitaires du système nerveux central, à la stabilité des RNT et à l'efficacité des synapses inhibitrices de la moelle épinière. Mon travail de thèse démontre pour la première fois comment et en quoi la microglie est un partenaire clé de l'équilibre dynamique qui régit la structure et la fonction de la synapse inhibitrice dans la moelle. Par conséquent, il donne un éclairage nouveau sur la façon de concevoir l'efficacité synaptique et sa régulation de façon non neurone autonome. / Whereas synapses are relatively stable structures, their molecular constituents are continuously recycled and exchanged in time and space. Each of the molecules that contribute to build synaptic structures is renewed with specific kinetics, depending on their organisation in the postsynaptic densities. The compatibility between a dynamic behaviour and a long-term maintenance of synapses implies to think synapses as multi-molecular assemblies in a dynamic equilibrium. Several parameters can influence the dynamics of receptors to neurotransmitters(RNT) at synaptic sites, including neuronal activity and extracellular matrix proteins. However,the role of glial cells in this mechanism is unknown. During my thesis work, I explored the roleof microglia, the resident immune cells of the central nervous system, on the lateral diffusion ofRNT and synaptic efficacy at spinal cord inhibitory postsynaptic densities. My work demonstrates for the first time a partnership between microglia and synapses. It shows that immune cells can take part to the regulation of synaptic strength very rapidly but also at basal state, by regulating RNT dynamics. Furthermore it identifies microglia as a key partner for a heterocellular stabilization of synaptic receptors. This work raises the intriguing possibility that the general regulation of network activity may also be explained by a fine modulation of receptors stability at the synapse controlled by microglia.

Les fonctions locomotrices et posturales sont contrôlées par un ensemble de réseaux neuronaux qui doivent interagir afin de produire un comportement locomoteur optimal, adaptable aux contraintes internes et externes de l’organisme. Le maintien d’un équilibre dynamique au cours de la locomotion repose sur des processus internes de coordination entre les réseaux nerveux spinaux et supraspinaux qui commandent les différents segments du corps (membres, tête et tronc). C’est dans ce contexte que nous nous sommes intéressés aux interactions entre la fonction locomotrice et la fonction posturale, sur des préparations réduites de tronc cérébral-moelle épinière de rats nouveau-nés, au sein desquelles les CPGs locomoteurs spinaux et les noyaux vestibulaires sont intacts. Des approches combinées électrophysiologiques, pharmacologiques, neuroanatomique et lésionnelles nous ont permis de mettre en évidence une partie des mécanismes à l’origine du couplage entre les différents réseaux neuronaux étudiés. Dans cette étude nous avons montré que les réseaux locomoteurs lombaires contrôlent l’activité des réseaux thoraciques axiaux, de manière à produire une activation coordonnée des réseaux moteurs des membres et du tronc. Cette coordination est sous influence des entrées supraspinales. Les amines induisent une organisation temporelle spécifique de l’activité des réseaux thoraco-lombo-sacrés, et les informations en provenance des noyaux vestibulaires influencent le rythme locomoteur. Ces données apportent des éléments nouveaux concernant les processus neuronaux à l’origine de la coordination des réseaux moteurs et posturaux. / Locomotor and postural functions are controlled by a set of neural networks that must interact to produce optimal locomotor behavior, adaptable to internal and external constraints of the body. Maintaining a dynamic balance during locomotion is based on internal coordination processes between spinal and supraspinal neuronal networks controlling different parts of the body (limbs, head and trunk). In this context, we have interested in the interactions between locomotor and postural functions, in spinal and supraspinal networks. The experiments were conducted on isolated brainstem-spinal cord preparations from neonatal rats, in which the spinal locomotor CPGs and the vestibular nuclei are intact. Electrophysiological, pharmacological, and neuroanatomical approaches allowed us to highlight some of the mechanisms involved in the coupling of the different neural networks. In this study we showed that the lumbar locomotor networks control the activity of axial thoracic networks, in order to produce a coordinated activation of motors networks of limbs and trunk. This coordination is modulated by amines and information from the vestibular nuclei. These data provide new evidence for spinal mechanisms involved in the coordination of motor and postural networks.

Nous proposons un modèle de l'embryogenèse de la moelle épinière considérée comme un système dynamique constitué d'unités comportementales (les cellules). Pour que cet organe soit fonctionnel, il faut que les neurones des différents types soient mis en place au cours de l'embryogenèse, avec le bon nombre de neurones du bon type au bon endroit. Cette mise en place résulte d'un processus dynamique au cours duquel les progéniteurs neuronaux prolifèrent dans les proportions adéquates avant de se différencier en neurones spécialisés. Les données expérimentales disponibles donnent l'évolution des populations de progéniteurs et de neurones, et la balance globale entre prolifération et différenciation. Un premier modèle est énoncé à l'échelle collective pour rendre compte de la dynamique observée sur toute la durée du processus, avec une évolution de la balance prolifération / différenciation ajustée sur les données expérimentales. Un second modèle introduit une différenciation comportementale des progéniteurs sous la forme d'une perte de leur capacité proliférative. Ce changement comportemental, de type tout-ou-rien à l'échelle cellulaire, se traduit à l'échelle collective par une transition continue de la balance prolifération / différenciation telle qu'observée expérimentalement. Enfin, nous explorons un raffinement de ce modèle où ce changement comportemental est gouverné par l'état du système (rétro-contrôle). Nous examinons les différentes possibilités de rétro-contrôles et nous retenons celle qui rend le mieux compte de la dynamique collective observée. En perspective, nous proposons des pistes pour intégrer la dimension spatiale du phénomène, et pour la prolongation de ce travail vers la modélisation du développement du cortex cérébral. / We consider the developing spinal cord as a dynamical system made of behavioral units (cells). For the adult spinal cord to be functional, different neurons must be of the right kind at the right place. They are issued from a dynamical process of proliferative and differenciating neural progenitors, with a fine control of the balance between proliferation and differentiation. Some experimental data are available for the evolution of progenitors and neurons population and for how the balance progresses with time. Based on these data, we propose a first model at the collective scale to account for these dynamics all along the process. A second model is proposed at the cell scale which includes a loss of proliferative capacity that progressively concerns more and more progenitors. This behavioural switch at cell scale is reflected by a continous progression of the balance proliferation / differentiation at population scale, as it is experimentally observed. Finally, we introduce a feedback control process so that this progression is under the control of the progenitors and neurons populations. Among the multiple possibilities for this feedback, we point out to the most relevant process. We discuss these findings, and how they can be extended to spatialized dynamics and neocortex development.

Les astrocytomes intramédullaires (AIMs) sont des tumeurs très rares du système nerveux central (SNC) dont l’incidence est de moins de 1% des tumeurs primitives du SNC. La nouvelle classification selon l’OMS 2016 des gliomes a radicalement changé le diagnostic histologique en intégrant les données moléculaires dans la pratique quotidienne du diagnostic afin de diminuer la subjectivité inhérente au diagnostic morphologique. Il est donc devenu essentiel d'évaluer ces altérations moléculaires afin d'affiner le pronostic du patient et d'orienter la prise en charge clinique. Cependant, la majorité des études sur les astrocytomes du SNC se concentrent sur les tumeurs cérébrales et peu d'études ont été réalisées, à ce jour, sur les AIMs. Les patients reçoivent généralement des modalités de traitement qui ont été établies pour les tumeurs intracérébrales et aucune guideline n'est disponible concernant l'intégration des altérations moléculaires dans le diagnostic, le pronostic et la gestion clinique des patients porteurs d’AIMs. Récemment, le Centre allemand de recherche sur le cancer (DKFZ) et l'Université de Heidelberg ont mis au point un modèle de classification des tumeurs du SNC basé sur la méthylation de l'ADN (c'est-à-dire le Heidelberg Brain Tumor classifier). Ce classificateur est apparu comme un outil de sous-classification des tumeurs du SNC qui peut potentiellement aider à la définition de nouvelles entités. Cependant, aucune étude liée à la méthylation de l'ADN n'a encore été réalisée spécifiquement sur les AIMs. La présente étude vise à corréler les données cliniques, radiologiques, moléculaires et épigénétiques des AIMs afin d'améliorer les connaissances actuelles sur le pronostic et les profils moléculaires de ces tumeurs. Notre hypothèse est que les AIMs sont biologiquement, cliniquement et moléculairement différents de leurs homologues cérébraux, présentent des biomarqueurs distincts et nécessitent une prise en charge clinique spécifique. Dans notre première étude, nous avons recueilli les données clinico-radiologiques et effectué un séquençage ciblé de nouvelle génération (NGS) pour 61 AIMs afin d'identifier les fusions KIAA1549-BRAF, les mutations dans 33 gènes couramment impliqués dans les gliomes ainsi que la co-délétion 1p/19q. Nous avons également effectué une multiplex droplet digital PCR étudiant les altérations moléculaires du gène FGFR1. Cent dix-sept astrocytomes cérébraux ont également été analysés à titre de comparaison. Nous avons observé que l'évaluation du caractère infiltrant/bien délimité utilisé comme première étape du diagnostic différentiel dans la classification de l’OMS de 2016 des astrocytomes n'est pas adaptée aux AIMs, car aucune différence significative en termes de caractère bien délimité/infiltrant n'a été rapportée entre les AIMs de grade I et II. Nous avons observé qu'il n'y a pas d'impact pronostique du grading des AIMs de bas-grade en grade I et grade II en opposition au traitement chirurgical. La fusion KIAA1549-BRAF, l'altération moléculaire la plus fréquemment observée dans les AIMs pilocytiques de grade I, a été décrite dans 38% des AIMs pilocytiques de grade I, mais avec des fréquences et des breakpoints différents de ceux observés dans la cohorte des astrocytomes cérébraux. Nous n’avons pas observé d’altérations moléculaires dans 19% des AIMs pilocytiques de grade I. Alors que les mutations IDH sont les altérations moléculaires les plus fréquentes dans les astrocytomes diffus de grade II cérébraux, des mutations non-classiques d’IDH ont été observées dans seulement deux cas d’AIMs diffus de grade II et associées à un pronostic plus mauvais en comparaison à ce qui est classiquement décrit dans le cerveau. De plus, seuls deux cas ont subi une évolution anaplasique, dont un cas d'AIM diffus de grade II IDH-muté. Les AIMs diffus de grade II IDH-wt étaient associés à un bon pronostic et associés à des altérations moléculaires de la voie MAPK (mutation BRAF V600E et altération moléculaire de FGFR1) similaires aux gliomes diffus de type pédiatrique. Cependant, 57 % des AIMs diffus de grade II n'ont pas présenté d'altérations moléculaires. En revanche, tous les AIMs de haut-grade présentaient au moins une altération moléculaire, la plus fréquente étant la mutation H3F3A K27M associée à un pronostic significativement plus mauvais (survie globale et survie sans récidive/progression de la maladie). Dans le but de ne pas seulement analyser les altérations moléculaires hotspots, mais des biomarqueurs plus larges, nous avons décidé de réaliser une analyse épigénétique des AIMs. L’étude du profil de méthylation de l’ADN évalue 850.000 CpGs spécifiques sur l’ensemble du génome et représente par conséquent une stratégie puissante permettant de mieux caractériser le profil moléculaire de ces tumeurs. Parmi les 61 échantillons, 23 ont été analysés d’un point de vue épigénétique. En utilisant le « Heidelberg Brain Tumor classifier », parmi les 16 échantillons contributifs, seuls trois cas, uniquement des AIMs de haut-grade, ont été correctement classés avec le score calibré recommandé (cs ≥ 0.9). La majorité des cas restants, principalement représentés par des AIMs de bas-grade, ont été soit considérés comme des cas "sans correspondance" (cs < 0,3, n=7), soit classés avec un cs faible (allant de 0,32 à 0,53, n=6), comprenant des classifications incohérentes. Afin d’améliorer la précision diagnostique, nous avons utilisé différentes analyses non-supervisées combinant les cas de notre série et les cas sélectionnés de la cohorte de référence d’Heidelberg. Tout d'abord, cette analyse a démontré que presque tous les plus proches voisins de notre série d’AIMs étaient localisés en intramédullaire. Cela a souligné le rôle de la localisation dans la classification des tumeurs cérébrales. Tous les AIMs H3F3A K27M-mutés se sont classés avec la classe de méthylation (MC) de référence gliome diffus de ligne médiane mutée H3K27M (DMG_K27M) alors que AIMs H3F3A K27M-wt étaient associés à la classe de méthylation de référence astrocytomes pilocytiques anaplasiques (ANA_PA). Comme était suggéré par les altérations moléculaires dans notre première étude, et bien que le « Heidelberg Brain Tumor classifier » n'ait pas réussi à classer les AIMs pilocytiques de grade I, les analyses non-supervisées ont identifié une nouvelle classe de méthylation distincte appelé « astrocytome pilocytique de la moëlle » ("PA_SPINE").En conclusion, ce paysage clinique, morphologique et moléculaire des AIMs suggèrent que les algorithmes diagnostiques classiquement utilisés pour les astrocytomes cérébraux doivent être adaptés pour les AIMs. L'évaluation du caractère infiltrant/bien délimité et le grading des AIMs de grade I et II ne semblent pas avoir les mêmes implications que dans le cerveau. La majorité des AIMs de bas-grade sont IDH-wt et ont un profil clinique et moléculaire plus proche de celui des gliomes diffus de type pédiatrique. Presque que tous les AIMs de haut-grade sont inclus dans l’entité DMG K27M de la classification de l’OMS de 2016 caractérisée à la fois par la mutation spécifique (H3F3A K27M) et la localisation de la ligne médiane. Même si notre cohorte ne comprenait que seize cas, nous sommes capables de proposer des hypothèses concernant une classification spécifique de la méthylation de l’ADN des AIMs avec une CM spécifique « PA_SPINE » et une association des AIMs de haut-grade H3F3A K27M-wt avec la CM de référence ANA_PA. Pris ensemble, ces résultats suggèrent fortement qu'une classification spécifique des AIMs doit être implémentée. / Intramedullary astrocytomas (IMAs) are very rare central nervous system (CNS) tumors with an incidence of less than 1% of all CNS tumors. The 2016 WHO (World Health Organization) Classification drastically changed the histopathological diagnosis by integrating molecular data into daily diagnostic practice in order to decrease the inherent subjectivity of the morphological diagnosis. It has therefore become essential to assess these molecular alterations in order to refine the patient's prognosis and guide the clinical management. However, the majority of studies on CNS astrocytomas focus on brain tumors and few studies have been performed, to date, on IMAs. Patients usually receive modalities of treatment that established for intracerebral tumors and currently no guidelines are available regarding the use of molecular alterations in the diagnosis, prognosis and in the clinical management of patients with IMAs. Recently, the German Cancer Research Centre (DKFZ) and Heidelberg University developed a DNA methylation-based classification model for CNS tumors (i.e. Heidelberg Brain Tumor classifier). This classifier has emerged as a tool that can be used to subclassify CNS tumors that may potentially help in the definition of new entities. However, no DNA methylation-related studies have yet been performed specifically on IMAs. The present study aims to study the correlation between the clinical, radiological, molecular and epigenetic data of IMAs to improve the current knowledge on the prognosis and the molecular profile of these tumors. Our hypothesis is that IMAs are biologically, clinically and molecularly different from their brain counterparts and need specific clinical management and biomarkers.In the first study, we collected clinico-radiological data and performed targeted Next-Generation Sequencing for 61 IMAs to identify KIAA1549-BRAF fusions, mutations in 33 genes commonly implicated in gliomas and 1p/19q codeletion. We also performed FGFR1 multiplex droplet digital PCR assay. One hundred seventeen brain astrocytomas were also analysed for comparison. We observed that assessing the infiltrative/well-circumscribed pattern of the tumor, which is used as a first differential diagnosis step in the 2016 WHO classification for astrocytomas, is not adapted for IMAs since no significant differences in terms of infiltrative/well-circumscribed pattern were noted between grade I and grade II IMAs.We reported that the prognostic impact of the grading of LG IMAs into grade I and grade II is not associated with different prognosis, in contrast to the surgical treatment. KIAA1549-BRAF fusion, the most frequently observed in grade I pilocytic IMAs, was described in 38% of grade I pilocytic IMAs but with different frequencies and breakpoints than those observed in the brain astrocytoma cohort. We did not observe any pathogenic molecular alterations in 19% of grade I pilocytic IMAs. While IDH mutations are the most frequent mutations in brain grade II diffuse astrocytomas, non-canonical IDH mutations were only observed in two grade II diffuse IMAs and were associated with a worse prognosis than what is classically described in the brain. Moreover, only two cases underwent anaplastic evolution, including one IDH-mutant IMA case. IDH wild-type (wt) grade II diffuse IMAs were associated with a good prognosis and harbored MAPK molecular alterations (i.e. BRAF V600E mutation and FGFR1 molecular alteration) similar to the pediatric-type diffuse gliomas. However, 57% of the grade II diffuse IMAs did not harbor molecular alterations. In contrast, all of the HG IMAs presented at least one molecular alteration, with the most frequent one being the H3F3A K27M mutation which was significantly associated with worse outcomes (overall survival and event-free survival). In order to not only analyze the molecular hotspot alterations but a broader biomarker landscape, we decided to apply epigenetic analysis to IMAs. This DNA methylation profiling assesses the methylation level of 850,000 specific CpGs sites all across the genome and therefore represents a powerful strategy to further characterize the molecular profile of tumors. From 61 cases, 23 IMA samples were therefore epigenetically characterized. Using the Heidelberg Brain Tumor classifier, only three HG IMAs, among the 16 contributive samples, were correctly classified with the recommended calibrated score (cs ≥ 0.9). The majority of the remaining cases, mainly represented by LG IMAs, were either considered as “no-match” cases (cs < 0.3, n=7), or classified with a low cs (ranging from 0.32 to 0.53, n=6), including inconsistent classification. In order to improve diagnostic accuracy, we applied different unsupervised analyses to combine cases from our series and a selected Heidelberg reference cohort. First, this analysis demonstrated that nearly all the nearest neighbors of IMA cases were intramedullary located. This emphasized the major role of location in classifying brain tumors. All H3F3A K27M-mutated IMAs clustered with the diffuse midline glioma, H3K27M-mutant (DMG_K27M) reference methylation class (MC) while H3F3A K27M-wt IMAs were strongly related to anaplastic pilocytic astrocytoma (ANA_PA) reference MC. As suggested by their molecular alterations observed in our first study, and while the Heidelberg Brain Tumor classifier did not succeed in classifying grade I pilocytic IMAs, the unsupervised analysis identified new distinct MC called “spine pilocytic astrocytoma” (“PA_SPINE”).In conclusion, these specific clinico-morphological and molecular landscapes of IMAs suggest that the diagnostic algorithms commonly used for brain astrocytomas must be adapted for IMAs. Assessment of the infiltrative/well-delineated pattern and grading LG in grade I and grade II seem to not have the same implications than in the brain. The majority of LG IMAs are IDH-wt and have a clinical and molecular profile more closely to pediatric-type diffuse gliomas. Nearly all HG IMAs are included in the 2016 WHO classification DMG K27M entity which is characterized by both specific mutation (H3F3A K27M) and midline location. Even though our cohort included only sixteen cases, we are able to propose hypotheses for a specific methylation classification of IMAs with a specific PA_SPINE MC and an association of H3F3A K27M-wt HG IMAs with ANA_PA reference MC. Taken together, these results highly suggest that a specific classification for IMAs has to be implemented. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished