En 1859 les physicien et chimiste allemands G. Kirchhoff et R. Bunsen ont découvert que chaque élément chimique dispose d'une signature spectrale unique. Suite à cela, la spectrométrie s'est imposée comme un outil d'analyse majeur y compris en astrophysique (notamment grâce à l'italien A. Secchi). Ainsi la plus grande partie des informations dont nous disposons sur les objets astrophysiques proviennent de l'analyse spectrale ; la découverte des premières planètes extra-solaires est même due à celle-ci. Depuis ses débuts, cette technique a trouvé de nombreuses applications dans des domaines aussi variés que la médecine, la détection de gaz ou encore l'étude des polluants. Dans cette thèse nous nous proposons d'étudier et de développer un nouveau type de spectromètres nommés SWIFTS (pour Stationary Wave Integrated Fourier Transform Spectrometer) basés sur la détection d'une onde stationnaire obtenue à l'intérieur d'un guide optique. Pour ce faire, nous utilisons une technique originale dite de " détection évanescente ". Dans cette thèse nous étudions et modélisons les performances d'un tel spectromètre notamment en utilisant une méthode matricielle et une méthode de décomposition dans le domaine de Fourier. Les premiers prototypes ont été réalisés dans les bandes I et R du système photométrique de Johnson, ces bandes ayant été choisies pour la facilité d'obtention de détecteurs et guides optiques efficaces. Étant donné les technologies disponibles, ces prototypes ne peuvent atteindre l'efficacité théorique maximale d'un SWIFTS (environ 73%) ; néanmoins elles nous ont permis de mesurer des résolutions de l'ordre du cm-1 sur un large domaine spectral (650 nm à 900 nm).

Les astrocytes sont capables de sécréter des gliotransmetteurs en réponse à une stimulation qui engendre l'augmentation de la concentration calcique intra-cellulaire. Différents mécanismes de sécrétion ont été proposés, parmi lesquels l'exocytose régulée. Mais les expériences menées dans le but d'observer la fusion d'organelles individuels dans des astrocytes en culture ont conduit à des résultats contradictoires, notamment en terme d'identité des vésicules libérables. Nos expériences préliminaires nous ont convaincus que les conflits sur l'identité des organelles libérables sont dus à de fausses colocalisations à cause du recouvrement spectral des marqueurs fluorescents utilisés et de la présence d'autofluorescence dans les astrocytes en culture. Nous avons donc adapté la décomposition spectrale à l'identification rigoureuse d'organelles individuels et au suivi de leur exocytose. La décomposition spectrale permet la séparation de sources de fluorescence mal séparées et ainsi l'étude de l'expression et de la colocalisation de protéines fluorescentes, même en présence d'autofluorescence. Nous avons à cette occasion introduit un intervalle de confiance du résultat de l'estimation des quantités de colorants. Appliquée au marquage des organelles astrocytaires avec la EGFP et l'acridine orange, cette méthode a montré que l'apparente colocalisation entre ces marqueurs reflète en fait la présence d'acridine orange plus intense que la EGFP et coexistant dans les mêmes organelles sous deux formes verte et rouge. A l'aide de la décomposition spectrale et de la microscopie à onde évanescente, nous avons ensuite montré que les organelles autofluorescents dans les astrocytes sont en majorité des lysosomes capables de fusionner lors d'une stimu\-lation qui engendre l'augmentation du calcium intra-cellulaire. Ces lysosomes sont peut-être les organelles majoritairement responsables de l'exocytose dans les astrocytes en culture.

Dans cette thèse, nous adressons trois projets avec l’application de microfluidique Avec le Vélocimétrie de Réflexion Totale Interne, nous avons réalisés le nanoPTV des fluides à 800 nm près de parois du solide. Nous arrivons à une précision sans précédent, par la détermination précise de la position du parois, et par la simulation de Langevin, en tenant compte des nombreux sources de biais physique, comme le mouvement Brownien, effet du cisaillement, la répulsion électrostatique entres les particules et le parois, et la défocalisation de la lentille. Nous obtenons ±5 nm and ± 10 nm de précision sur la longueur de glissement pour la solution de sucrose et de l’eau. La condition de non-glissement sur la surface hydrophile est confirmée, et un glissement sur la surface hydrophobe est observé. Nous collaborons avec A. Leshansky pour étudier la formation des gouttes sur une intersection entre un canal confiné et un réservoir profond. Cette phénomène est appelé le «step emulsificaiton». La dynamique de la formation des gouttes est étudiée expérimentalement de façon approfondie. La théorie est basée sur la dynamique des fluides dans un canal Hele-Shaw, avec les effets de forces capillaires. Nous arrivons à expliquer le mécanique du fluides derrière la formation des gouttes, inclus les taille des gouttes. Nous collaborons avec un groupe des entreprises pétrolières (AEC), pour étudier le mouvement des nano particules dans un micro model de milieux poreux. Ces particules sont supposé de faire transition une fois en contact avec l’huile ou expériencer un changement de la température. L’injection des particules dans les réservoirs de l’huile et de gaz permet de collecter l’information sur la distribution et la quantité de l’huile et de gaz. Avant l’application en mass dans l’industrie, c’est favorable de les tester dans un micro model, qui possèdes une structures similaire aux pores des roches. Nous avons testé les nano particules synthétisés par les autres membres de l’AEC, et confirmé que l’idée du micro model est une méthode efficace de prédire la performance des particules sous sol. / In this work, we have addressed three projects with the application of Microfluidics: With the technology of Total Internal Reflection Velocimetry, we realised the nano-PTV of fluid flow within 800 nm close to solid surface. We achieved unprecedented accuracy of measurement compared with the state of art, by determining precisely the wall position, and by Langevin simulation, which takes into account of the sources of biases, such as Brownian motion, shear stress, electrostatic repulsion between particles and the wall, effect of out of focus, etc. We achieved ±5 nm and ± 10 nm accuracy on the slip length determination for sucrose solution and for water. The no-slip condition on hydrophilic surface is confirmed, and a positive slip length on hydrophobic surface is clearly illustrated. This result demonstrated that the nano-PTV by TIRF is a quantitative methodology for the study of fluid flow near solid surface. We collaborated with A. Leshansky to study quantitatively the mechanism of step emulsification. The dispersed fluid and continuous fluid are co-flowing in a confined Hele-Shaw channel, before going into an unconfined pool. Drops are formed at the intersection between shallow channel and the pool. Two phases - step emulsification and large drops - are distinguished based on a well defined capillary number. We found good agreement between experiments and theory, on the step emulsification droplet size, dispersed fluid pinching dynamics, and on the shape of free interface between dispersed fluid and continuous fluid prior to pinching. We collaborated with a group of petroleum companies (AEC), to develop a technology which has potential application to the Enhanced Oil Recovery. Nano particles synthesized by the AEC is supposed to perform phase transition or deliver signals once in touch with oil. The principal idea consists in sending these nano particles into the porous media underground along with the injection fluids, and recollect them on the production well side. According to the information they deliver, the distribution of oil may be mapped. We constructed a micro model based on microfluidic technology, which mimics the complex structure of porous media of rocks. The AEC synthesized nano particles are injected into the micro model, their motion and retention can be observed in real time. This work provides important information on the particle motion in porous media, which cannot be realised in conventional core experiments.

Dans cette thèse, nous résolvons un problème inverse de type Cauchy associé à l'opérateur biharmonique. Pour des données compatibles, comme ce problème est mal posé au sens d'Hadamard, nous utilisons la méthode de régularisation évanescente. Elle est itérative. Son originalité est de faire intervenir, à chaque itération, un problème d'optimisation bien posé qui dépend d'un terme de régularisation dont les effets se dissipent à la limite du processus itératif. Cette limite n'est autre que la solution du problème de Cauchy. Pour adapter des algorithmes élaborés pour les problèmes de Cauchy associés au laplacien, nous factorisons le problème initial en deux problèmes inverses de Cauchy pour l'opérateur harmonique. Les résultats principaux sont la convergence de la solution discrète vers la solution continue et l'efficacité de la méthode à gérer numériquement, via les éléments finis, le problème factorisé sur différents domaines, même lorsque les données sont bruitées.

Les enzymes de réparation de l'ADN sont des facteurs essentiels pour assurer l'intégrité du génome. Ainsi, la compréhension de la dynamique de leurs mécanismes d'interaction est capitale. NucS est une nucléase récemment découverte chez l'archée Pyrococcus abyssi, qui interagit avec des structures branchées de l'ADN à simple brin libre, appelées flaps. Sa caractérisation biochimique a mis en évidence une affinité nanomolaire pour l'ADN simple brin, avec l'existence de deux sites de liaison (site I et II) ainsi qu'une activité bidirectionnelle caractérisée par la capacité à cliver les flaps 5' et 3'. Les mécanismes qui sont à l'origine de cette activité, notamment ses modalités de chargement, de localisation et de dissociation, restent toutefois peu connus. Afin de sonder la dynamique des interactions de NucS avec son substrat, nous avons mis en place un microscope à illumination en onde évanescente permettant la détection et le suivi des événements d'interaction individuels entre la protéine marquée avec un fluorophore et un substrat d'ADN attaché à la surface. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique de colocalisation qui permet de positionner une protéine individuelle par rapport à son substrat avec une précision de 50 nm pour des durées arbitraires. Nous avons alors étudié la cinétique d'association et de dissociation des complexes NucS-ADN individuels afin de résoudre les mécanismes qui régulent l'activité de l'enzyme dans différentes conditions. Dans des conditions où le clivage est inhibé, nous avons montré que l'association était dépendante du site I, bidirectionnelle et symétrique pour les flaps 3' et 5' et que la dissociation était orientée avec une affinité supérieure pour les flap 5'. Nous avons également montré que la dissociation suivait une cinétique du premier ordre indépendante de la diffusion de NucS sur le flap. Ceci indique que, dans ces conditions non clivantes, NucS s'associe et/ou se dissocie à des positions arbitraires sur le flap. Par la suite, nous avons étudié la cinétique d'association et de dissociation du complexe NucS-ADN à 45 ◦ C en présence du cofacteur de la réparation PCNA. Nous avons démontré que PCNA augmente la vitesse d'association de NucS avec les substrats 3' et 5'. Ceci indique que PCNA agit comme une plateforme qui facilite la reconnaissance de la lésion, avec un chargement ciblé de NucS à la jonction. De plus, nous avons montré que PCNA déstabilise le complexe NucS-ADN, vraisemblablement en exerçant une force pour plier l'ADN afin d'amener l'extrémité du flap vers le site II. Dans le cas de flaps 5', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme en deux étapes, qui est indépendant de la longueur du flap. Ceci nous a permis de proposer un modèle où NucS se charge par son site I directement à la jonction, courbe le substrat pour capturer l'extrémité simple brin par le site II pour le cliver. Dans le cas d'un flap 3', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme du premier ordre ce qui est probablement dû à la rapidité de la seconde étape dans le mécanisme proposé pour les flaps 5'. Nos résultats constituent ainsi une nouvelle contribution à la caractérisation intramoléculaire des interactions NucS-ADN. Les méthodes que nous avons développées constituent en outre un moyen original pour sonder la cinétique des interactions entre biomolécules et pourront être appliquées à de multiples systèmes.

Certaines protéines qui interagissent avec l'ADN sont capables de trouver rapidement une séquence spécifique de quelques paires de bases. Pour expliquer ce phénomène connu des biologistes depuis longtemps, plusieurs mécanismes de localisation appelés diffusion facilitée ont été proposés. Tous supposent une association initiale à de l'ADN non spécifique, suivie d'une translocation le long de l'ADN jusqu'au site de reconnaissance. Le mécanisme qui sous-tend cette translocation est toujours discuté. Il pourrait impliquer une diffusion linéaire (sliding) et/ou une série de sauts (jumping). <br />Pour élucider ce mécanisme, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence par onde évanescente pour visualiser l'interaction non spécifique de l'enzyme de restriction EcoRV. Dans nos expériences in vitro, l'ADN est étiré au dessus d'une surface et les enzymes sont couplées à des fluorophores. Nous avons ainsi visualisé les processus de sliding et de jumping et mesuré le coefficient de diffusion 1D des enzymes (D1 ~ 0,01 µm2.s-1) ainsi que le nombre de saut par interaction (~ 20). Un modèle simple a permis à partir des résultats expérimentaux de caractériser la diffusion facilitée d'EcoRV.

La nécessité de délivrer des médicaments directement dans les cellules est grandissante avec le développement des thérapies géniques. Les peptides pénétrants (Cell Penetrating Peptides : CPP) représentent une possibilité pour administrer ces médicaments dans les cellules sans effet délétère sur la membrane. Ce sont des peptides d’une dizaine d’acides aminés, généralement cationiques. Ils sont capables de traverser la membrane cellulaire, et conservent cette propriété lorsqu’une cargaison leur est attachée. Cependant, leurs mécanismes d’entrée ne sont toujours pas tous connus. Nous avons caractérisé quelques aspects des mécanismes permettant aux CPP de traverser directement la membrane plasmique à l’aide de trois techniques biophysiques. i) Nous avons ainsi pu mettre en évidence le rôle des sulfates d’héparane comme partenaire d’adhésion forte du CPP pénétratine, à l’aide d’un outil de mesure de force : le Biomembrane Force Probe. ii) Nous avons montré la possibilité pour la pénétratine de franchir la bicouche lipidique (sans mécanisme cellulaire actif) si celle-ci est suffisamment riche en lipides chargés négativement. Ce passage a été étudié sur bicouches modèles, formées à l’interface entre gouttelettes obtenues par émulsion inverse dans de l’huile en présence de lipides. iii) Pour visualiser la translocation de CPP à l’échelle de la molécule unique nous avons développé un montage original de microscopie à onde évanescente sur bicouche suspendue. / Gene therapy relies on an efficient and specific delivery of drugs into targeted cells. For this purpose, the use of carriers that will help the drugs to cross the membrane, without introducing deleterious effect due to the membrane disruption, are promising. A family of such carriers is known as Cell Penetrating Peptides (CPPs). These peptides are short, about ten amino acids, and often cationic. They are able to translocate through the membrane with different cargos and deliver them into the cytosol. However the mechanisms are still, to a great extent, unknown. We used three biophysical techniques to gain insights into the mechanisms leading to the translocation of a CPP. i) We found the heparan sulfates to be the strongest partner of the CPP penetratin at the cell surface. This adhesion has been pointed out using the Biomembrane Force Probe, a force measuring tool. ii) We evidenced the translocation of penetratin through the lipid bilayer (without any cell mechanism) as long as it contains enough negatively charged lipids. This has been carried out using model bilayers formed at the interface between droplets generated by an inverted emulsion: water in an oil and lipid mixture. iii) To view the translocation of CPPs at the single molecule level we developed a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM) on a suspended bilayer.

Dans cette thèse, nous adressons trois projets avec l'application de microfluidique Avec le Vélocimétrie de Réflexion Totale Interne, nous avons réalisés le nanoPTV des fluides à 800 nm près de parois du solide. Nous arrivons à une précision sans précédent, par la détermination précise de la position du parois, et par la simulation de Langevin, en tenant compte des nombreux sources de biais physique, comme le mouvement Brownien, effet du cisaillement, la répulsion électrostatique entres les particules et le parois, et la défocalisation de la lentille. Nous obtenons ±5 nm and ± 10 nm de précision sur la longueur de glissement pour la solution de sucrose et de l'eau. La condition de non-glissement sur la surface hydrophile est confirmée, et un glissement sur la surface hydrophobe est observé. Nous collaborons avec A. Leshansky pour étudier la formation des gouttes sur une intersection entre un canal confiné et un réservoir profond. Cette phénomène est appelé le "step emulsificaiton". La dynamique de la formation des gouttes est étudiée expérimentalement de façon approfondie. La théorie est basée sur la dynamique des fluides dans un canal Hele-Shaw, avec les effets de forces capillaires. Nous arrivons à expliquer le mécanique du fluides derrière la formation des gouttes, inclus les taille des gouttes. Nous collaborons avec un groupe des entreprises pétrolières (AEC), pour étudier le mouvement des nano particules dans un micro model de milieux poreux. Ces particules sont supposé de faire transition une fois en contact avec l'huile ou expériencer un changement de la température. L'injection des particules dans les réservoirs de l'huile et de gaz permet de collecter l'information sur la distribution et la quantité de l'huile et de gaz. Avant l'application en mass dans l'industrie, c'est favorable de les tester dans un micro model, qui possèdes une structures similaire aux pores des roches. Nous avons testé les nano particules synthétisés par les autres membres de l'AEC, et confirmé que l'idée du micro model est une méthode efficace de prédire la performance des particules sous sol.

Dans ce travail, nous étudions les surfaces dont les composantes irréductibles sont des surfaces toriques. En particulier, nous donnons une formule pour calculer l'obstruction d'Euler locale de ces surfaces. Comme application de cette formule, nous calculons l'obstruction d'Euler locale pour certaines familles de surfaces déterminantales. De plus, nous définissons et donnons une formule pour calculer la caractéristique d'Euler évanescente d'une surface torique normale $X_{sigma}$. Nous montrons que ce nombre est relié à la seconde multiplicité polaire de $X_{sigma}$. Nous présentons aussi une formule pour l'obstruction d'Euler d'une fonction $f: X_{sigma} to mathbb{C}$ et pour le nombre de Brasselet d'une telle fonction. Comme application de ce résultat nous calculons l'obstruction d'Euler d'un type de polynôme sur une famille de surfaces déterminantales. / In this work we study surfaces with the property that their irreducible components are toric surfaces. In particular, we present a formula to compute the local Euler obstruction of such surfaces. As an application of this formula we compute the local Euler obstruction for some families of determinantal surfaces. Furthermore, we define the vanishing Euler characteristic of a normal toric surface $X_{sigma}$, we give a formula to compute it, and we relate this number with the second polar multiplicity of $X_{sigma}$. We also present a formula for the Euler obstruction of a function $f: X_{sigma} to mathbb{C}$ and for the Brasselet number of it. As an application of this result we compute the Euler obstruction of a type of polynomial on a family of determinantal surfaces.

La sécrétion régulée d'hormones est un processus décomposable en plusieurs étapes : migration des granules de sécrétion (GS) vers la membrane plasmique (MP), accostage et arrimage des GS à la MP, exocytose ou fusion des GS avec la MP permettant la libération du contenu des GS dans le milieu extracellulaire. Bien que très utiles, les méthodes électrophysiologiques et électrochimiques ne donnent d'informations ni sur la localisation ou les mouvements des GS avant fusion, ni sur le devenir de la membrane des GS après fusion. Plusieurs techniques d'imagerie in vivo cherchent à répondre à ces questions. La mieux adaptée est la microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente (TIRFM) qui permet d'observer les mouvements de GS individuels à proximité immédiate de la MP. Nous avons appliqué cette approche à l'étude de la sécrétion des cellules BON (lignée dérivée d'un carcinome). Leur stimulation a été faite par la technique du Ca cagé, appliquée pour la première fois en microscopie TIRF. Après exocytose, nous avons observé et quantifié le phénomène de persistance de la forme d'une partie des GS, ainsi que l'exocytose séquentielle de GS situés plus à distance de la MP. De manière surprenante, l'exocytose séquentielle représente ~25% des événements d'exocytose. L'analyse détaillée des trajectoires en 3 dimensions des GS avant leur fusion nous a montré qu'environ 40% des GS effectuent une transition de 20 nm vers la MP, puis fusionnent dans un délai de ~3 s. Cette observation originale de la transition entre l'accostage et l'arrimage des GS pourrait être la traduction d'évènements moléculaires impliqués dans l'amorçage des GS, nécessaire à la fusion.