Squamous cell carcinoma of the head and neck (SCCHN), the 6th most common cancer worldwide, has a low 5-year survival. Disease as well as treatment often causes patients severe functional and aesthetic problems. In order to improve treatment and diagnosis at earlier stages of tumour development it is important to learn more about the molecular mechanisms behind the disease. p63, an important regulator of epithelial formation, has been suggested to play a role in the development of SCCHN. Six different isoforms of p63 have been found and shown to have various functions. The aim of the studies in this thesis was to learn more about the role of p63 and proteins connected to p63 in SCCHN. Expression of p63, Cox-2, EGFR, beta-catenin, PP2A and p53 isoforms was mapped in tumours and normal tumour adjacent tissue from patients with SCCHN using western blot or RT-PCR. Results showed no significant difference between tumours and normal tumour adjacent tissue concerning expression of EGFR and beta-catenin. Cox-2 and PP2A showed significantly higher expression in tumours while p63 was more expressed in normal tumour adjacent tissue. However, expression of all these proteins in normal tumour adjacent tissue differed from tissue from disease-free non-smoking individuals. Smoking in itself did not affect expression of these proteins. The p53 isoforms p53, p53beta, p53gamma, ∆133p53, ∆133p53beta and ∆133p53gamma were expressed at RNA level in samples both from tumours and normal tumour adjacent tissue, though most of them at fairly low levels. The functional properties of the different p63 isoforms have not been fully mapped. By establishing stable cell lines over-expressing the different p63 isoforms we investigated their specific effect on tumour cells from SCCHN. Only the ∆Np63 isoforms could be stably over-expressed, whereas no clones over-expressing TAp63 could be established. Using microarray technique, cell lines stably expressing the ∆Np63 isoforms were studied and CD44, Keratins 4, 6, 14, 19 and Cox-2 were found to be regulated by p63. In conclusion, the present project adds new data to the field of p63 and SCCHN. For example, we have shown that clinically normal tumour adjacent tissue is altered compared to normal oral mucosa in non tumour patients, and that smoking does not change expression of p63, Cox-2, EGFR, beta-catenin or PP2A in oral mucosa. Novel p53 isoforms are expressed in SCCHN, and even though levels are very low they should not be overlooked. Furthermore, CD44, keratins 4, 6, 14, 19 and Cox-2 were identified as p63 targets in SCCHN.

Both Notch and the Wnt pathways are key regulators in maintaining the homeostasis in the intestine. Defects on the key tumor suppressor adenomatous polyposis coli, APC a gene in the Wnt pathway is most frequently mutated in colorectal cancer. Previous studies have indicated that there is a crosstalk between these two pathways. We investigate if there is correlation by first using bioinformatics to find Lef1/Tcf sites in several of the Notch pathway gene promoters. Bioinformatically we found that a lot of the genes contained theses sites controlled by the APC's destruction target β-catenin. By using semi quantitative PCR and western blot we found that Hes 1, Hes 7, JAG 2, MAML 1, Notch 2, NUMB, NUMBL, RFNG and LFNG was downregulated in HT29 colon cancer cells carrying a vector containing wild type APC. All but JAG 2 contains at least one Lef1/Tcf site in their promoter region. The results were verified in HT29 cells transfected with siRNA against β-catenin. We also investigated what would happen to the Lef1/Tcf target gene program of the Wnt pathway, if the Notch pathway was inhibited with the gamma-secretase inhibitor DAPT. Results showed no downregulution of β-catenin or its target gene Cyclin D1.Taken together, these results demonstrate that the Wnt pathway can be placed upstream of the Notch pathway and regulates the latter through β-catenin and the Lef1/Tcf target gene program. However, preliminary results indicate that there is no regulation of APC/β-catenin by the Notch pathway.

Colorectal tumors with mutations on Wnt family members show an overexpression of several Notch target genes, suggesting a link between Wnt and Notch signaling pathways. In this work, we have demonstrated that there is a direct relation between Wnt and Notch pathways that it is responsible for the maintenance of the intestinal proliferative compartment and crucial for intestinal tumorigenesis. We have identified two different mechanisms through β-catenin interacts with Notch to activate transcription: 1) β-catenin activates Notch through the transcriptional activation of Notch ligand Jagged1. Jagged1 expression leads the binding to the Notch receptor, promoting its cleavage and activation. This mechanism occurs in human colorectal tumors, with nuclear β-catenin, overexpressed Jagged1 and activated Notch. 2) β-catenin and Notch bind simultaneously to a specific group of gene promoters. We observed that this group of genes is overexpressed in tumours with mutations in Wnt signaling. Moreover, β-catenin and Notch physically interact in the nucleus of colorectal tumour cell lines. We have characterized a group of genes that are double target genes for β-catenin and Notch; in other words, these genes require the activation of both Wnt and Notch signaling pathways. These genes are expressed in the intestinal undifferentiated compartment. The loss of any of these signalling pathways reduced stem cell marker expression, reinforcing the importance of the interaction between both signalling pathways. The study of conditional knockouts mice for Jagged1 indicated that Jagged1 is not required for maintaining the intestinal homeostasis. However, Jagged1 is crucial during the tumorigenic process. Our data opens a new possibility for colorectal treatment, using inhibitors of Notch ligand Jagged1, avoiding side effects in the intestinal normal tissue.

La voie de signalisation Wnt/β-caténine (Wnt canonique) est impliquée dans une grande variété de fonctions biologiques, entre autres dans l’établissement des axes embryonnaires, l’organogenèse et l’homéostasie de cellules souches adultes. En absence de signaux Wnt, un complexe multiprotéique comprenant le suppresseur de tumeur Adenomatous Polyposis Coli (APC) marque la β-caténine pour la dégradation protéasomique. L’activation de la voie Wnt canonique induit un arrêt de la dégradation de la β-caténine, qui s’accumule dans le noyau, où elle active l’expression de gènes cibles de Wnt. Au cours de la myogenèse embryonnaire, processus pendant lequel le muscle squelettique est formé, une partie des cellules pluripotentes du dermomyotome acquièrt l’identité musculaire, se différencie et forme les myofibres, les unités fonctionnelles du muscle squelettique. La myogenèse n’est pas confinée qu’à la période embryonnaire. En effet, elle peut être réactivée dans le muscle adulte suite à une lésion ou dans certaines conditions pathologiques. Dans ce contexte, les cellules souches du muscle squelettique, appelées cellules satellites, sortent de leur quiescence et génèrent des progéniteurs myogéniques qui prolifèrent et se différencient en formant de nouvelles myofibres pour réparer le tissu. De plus, une partie des progéniteurs myogéniques retournent à l’état quiescent, renouvelant ainsi la population de cellules souches résidentes. Le rôle de la voie de signalisation Wnt/β-caténine dans l’engagement des cellules pluripotentes du dermomyotome vers le destin myogénique demeure méconnu. De même, la fonction de la voie Wnt canonique dans les cellules satellites au cours de la régénération du muscle squelettique adulte reste à l’heure actuelle controversée, car différentes approches sont parvenues à des conclusions contradictoires. Grâce à des modèles génétiques murins, nous avons caractérisé le rôle précis de la voie Wnt canonique au cours de la myogenèse embryonnaire et adulte. Nous montrons in vivo que l’hyperactivation constitutive de la voie de signalisation Wnt/β-caténine induite par l’inactivation conditionnelle d’APC, le principal régulateur négatif de la cascade, se traduit par un défaut majeur de formation et de régénération du muscle squelettique. Nos résultats ex vivo et in vitro démontrent que l’hyperactivation de la voie Wnt canonique altère la progression du cycle cellulaire et entraîne la mort par apoptose. De plus, l’inactivation conditionnelle de la β-caténine n’affecte pas la prolifération des progéniteurs myogéniques mais perturbe leur différenciation. Globalement, nos résultats suggèrent deux rôles différents de la voie de signalisation Wnt/β-caténine dans le muscle squelettique. D’une part, l’inhibition de la voie Wnt canonique est nécessaire au cours de l’initiation de la myogenèse pour permettre l’engagement myogénique des cellules pluripotentes du dermomyotome et l’activation des cellules satellites. D’autre part, la voie de signalisation Wnt/β-caténine est requise à la fois dans les progéniteurs musculaires embryonnaires et adultes pour leur différenciation et la formation des myofibres. / The Wnt/β-catenin signaling pathway, also called canonical Wnt signaling, is implicated in a large variety of biological processes, including embryonic axis determination, organogenesis and adult stem cells homeostasis. Canonical Wnt signaling regulates the stability of β-catenin, a transcriptional co-activator that, in absence of Wnt ligands, is targeted to proteasomal degradation by a multiproteic complex comprising the Adenomatous Polyposis Coli (APC) tumor suppressor. Activation of canonical Wnt signaling blocks β-catenin degradation and results in its accumulation into the nucleus, where it induces the expression of Wnt target genes. During embryonic myogenesis, the process of skeletal muscle formation, a proportion of pluripotent dermomyotomal cells restrict their fate to acquire a myogenic identity and differentiate into contractile myofibers, the functional units of skeletal muscle. Myogenesis can take place also in adult skeletal muscle. Indeed, upon acute injury or in pathological conditions, quiescent muscle-specific stem cells, called satellite cells, become activated and give rise to myogenic progenitors that massively proliferate, differentiate and fuse to form new myofibers and restore tissue functionality. In addition, a proportion of proliferating progenitors returns back to quiescence and replenish the pool of satellite cells in order to maintain the regenerative potential of skeletal muscle. The role of canonical Wnt signaling in the cell fate choice that drives multipotent dermomyotomal cells toward the myogenic lineage remains elusive. Similarly, a possible involvement of the Wnt/β-catenin cascade has been hypothesized in satellite cells during adult skeletal muscle regeneration, but different approaches came to contradictory results. In this study, we use genetic mouse models to investigate the precise role of canonical Wnt signaling in embryonic and adult myogenesis. In vivo constitutive overactivation of Wnt/β-catenin signaling following conditional deletion of APC, the major intracellular negative regulator of the pathway, results in complete abrogation of skeletal muscle formation and regeneration. By combining ex vivo and in vitro approaches, we show that canonical Wnt signaling hyperactivation alters cell cycle progression and results in programmed cell death. Conversely, conditional inactivation of β-catenin does not perturb the proliferative ability of myogenic progenitors but rather affects their differentiation. Collectively, our results demonstrate at least two distinct roles of the Wnt/β-catenin cascade in skeletal muscle. First, during myogenic initiation, canonical Wnt signaling must be inhibited to allow proper activation of myogenesis, in particular to elicit myogenic commitment of dermomyotomal cells and activation of adult satellite cells. Second, in myogenic progression, the Wnt/β-catenin pathway is required in both embryonic and adult muscle progenitors for proper differentiation and myofibers formation.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23383号 / 医博第4752号 / 新制||医||1052(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 河本 宏, 教授 髙折 晃史, 教授 金子 新 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Background: The Wnt/β-catenin signalling pathway is activated in arrhythmogenic heart diseases such as myocardial infarction and heart failure, but it is unclear if the pathway regulates cardiac ion channels and thus may play a role in arrhythmogenesis. Previous PCR array screening from our lab showed that the transcript level of the T-type calcium channel gene Cacna1g was reduced in primary culture of neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs) after activation of Wnt/β-catenin signalling with Wnt3a protein (100 ng/ml) or a small molecule activator of the pathway, CHIR (3 µM) (n=3, p<0.01). In this study, we examined the effects of Wnt/β-catenin signalling on T-type calcium channels (Caᴠ3.1), which play a key role in the pacemaker function of the sinoatrial node (SAN). Results: RT-qPCR and western blot demonstrated dose-dependent reductions in Cacna1g mRNA (n=7, p<0.01) and Cav3.1 protein (n=4, p<0.01) in NRVMs after treatment with CHIR (3 μM). There was also a decrease in Cacna1g mRNA in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) after treatment with CHIR (5 μM) (n=4; p<0.001). Patch-clamp recording demonstrated reduced T-type calcium current (ICa,T) in NRVMs after Wnt3a treatment (3 μg/ml) (n=5, p<0.05). In isolated mouse SAN tissue, perfusion with an ICa,T blocker, ML-218 (30 µM), led to dose-dependent reductions in spontaneous beating rate (n=4, p<0.0001) indicating a critical role of ICa,T in SAN pacemaking. In adult rats, activation of Wnt/β-catenin signalling through the application of CHIR in a poloxamer gel to the SAN region did not alter the in vivo heart rate in electrocardiogram (ECG) (n=8, p=0.12). However, ex vivo culture of SAN tissue from the in vivo experiments revealed a reduction intrinsic beating rate in the CHIR treated group (n=7) compared to the control (DMSO) (n=8) (p<0.05). Summary: Wnt/β-catenin signalling inhibits T-type Ca²⁺ current in cardiomyocytes by, at least partly, reduced Cacna1g mRNA and Cav3.1 protein. Activation of Wnt/β-catenin signalling reduces the intrinsic heart rate likely by inhibition of T-type Ca²⁺ current in SAN pacemaker cells.

One of the most common plasticizers used in the production of plastic are phthalates. These chemicals have been associated with many adverse effects including developmental and reproductive anomalies. Early developmental processes targeted by chemicals can have long-lasting effects on individuals. The focus of this study was on investigating the effects of a phthalate monoester mixture on two evolutionarily conserved processes, Wnt/β-catenin signaling and apoptosis, both of which play an important role during development. Focus was also given on the mixture’s effect in metabolic rate. The phthalate mixture used is part of mixture G, a mixture which additionally contains triclosan and three perfluoroalkyl acids. The components of Mixture G were identified in a Swedish pregnancy cohort (SELMA) and were inversely associated with birth weight. The experiments were conducted in zebrafish embryos. Wnt signaling was analyzed in a transgenic zebrafish line, which had the EGFP gene linked to β-catenin regulated promoters, by measuring the fluorescence in the caudal fin. Apoptosis was analyzed through the acridine orange assay and metabolic rate through the transformation of resazurin to resorufin in presence of NADH/NADPH. The results showed a downregulation of Wnt signaling in zebrafish at two days post-fertilization (2 dpf), at a water concentration 100 times higher than the geometric mean serum concentration (100x hsc) of the mothers in the SELMA cohort. An upregulation of apoptosis was found at 1 dpf, at 60x hsc and 100x hsc. An effect on metabolic rate was observed at 100x hsc at 5 dpf. The results indicate that phthalates can disrupt Wnt signaling, induce apoptosis and influence metabolic rate, which along with the various reproductive effects they can induce warrants cause for concern not only for zebrafish embryos but for human fetuses as well.

Resident cardiac Sca-1-positive (+) stem cells may differentiate into cardiomyocytes to improve the function of damaged hearts. However, little is known about the inducers and molecular mechanisms underlying the myogenic conversion of Sca-1+ stem cells. Here we report that sphingosylphosphorylcholine (SPC), a naturally occurring bioactive lipid, induces the myogenic conversion of Sca-1+ stem cells, as evidenced by the increased expression of cardiac transcription factors (Nkx2.5 and GATA4), structural proteins (cardiac Troponin T), transcriptional enhancer (Mef2c) and GATA4 nucleus translocation. First, SPC activated JNK and STAT3, and the JNK inhibitor SP600125 or STAT3 inhibitor stattic impaired the SPC-induced expression of cardiac transcription factors and GATA4 nucleus translocation, which suggests that JNK and STAT3 participated in SPC-promoted cardiac differentiation. Moreover, STAT3 activation was inhibited by SP600125, whereas JNK was inhibited by β-cyclodextrin as a lipid raft breaker, which indicates a lipid raft/JNK/STAT3 pathway involved in SPC-induced myogenic transition. β-Catenin, degraded by activated GSK3β, was inhibited by SPC. Furthermore, GSK3β inhibitors weakened but the β-catenin inhibitor promoted SPC-induced differentiation. We found no crosstalk between the lipid raft/JNK/STAT3 and β-catenin pathway. Our study describes a lipid, SPC, as an endogenic inducer of myogenic conversion in Sca-1+ stem cells with low toxicity and high efficiency for uptake.

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CD97 ist ein G protein-coupled receptor der zu der Gruppe der Adhäsions-GPCRs zuzuordnen ist. CD97 ist im normalen humanen Darmepithel in lateralen Zellkontakten lokalisiert. In transgenen Mäusen, die CD97 selektiv in normalen intestinalen Epithelzellen überexprimieren, werden die adherens junctions durch Stabilisierung des nicht-phosphorylierten membran-gebundenen β-catenins verstärkt. Neben der Epithelzellverband-stabilisierenden Funktion von β-catenin in adherens junctions spielt β-catenin im Zellkern als Aktivator von Transkriptionsfaktoren eine entscheidende Rolle in der kolorektalen Karzinogenese. Diese unterschiedliche zelluläre Verteilung wird über den kanonischen Wnt-Signalweg reguliert. CD97 wird in kolorektalen Karzinomen hochreguliert. Steinert et al. beschrieben, dass insbesondere sogenannte scattered Tumorzellen an der Invasionsfront des kolorektalen Karzinoms CD97 im Vergleich zu Zellen im Tumorzentrum höher exprimieren. Dieses Phänomen geht mit einem höheren Tumorstadium und verstärkter Lymphgefäßinvasion einher. In diesen Zellen wird β-catenin verstärkt im Zytoplasma und im Zellkern exprimiert. Die histologische Lokalisation von CD97 im kolorektalen Normal- und Karzinomgewebe ließ zunächst vermuten, dass CD97 ein direktes β-catenin/Tcf-Zielgen im fehlregulierten Wnt-Signalweg ist. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass CD97 kein Zielgen des kanonischen Wnt-Signalweges ist. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal eine immunhistochemische Studie durchgeführt, die die Lokalisation von CD97 und β-catenin in normalem und malignem kolorektalem Gewebe parallel vergleichend analysiert. Bisher konnte CD97 nur im Kryostat-Schnitt immunhistochemisch dargestellt werden. Die immunhistochemische Darstellung der nukleären Expression von β-catenin ist jedoch nur in Paraffin-eingebetteten Geweben möglich. Somit etablierten wir erstmals eine immunhistochemische Färbemethode, die es erlaubt CD97 in Paraffin-eingebetteten humanen kolorektalen Geweben darzustellen. CD97 wird in allen Schnitten des kolorektalen Normalgewebes exprimiert. Sowohl CD97 als auch β-catenin sind dabei vorwiegend in den lateralen Zellkontakten aber auch im Zytoplasma der Zellen lokalisiert. Die Färbescores von CD97 und β-catenin in den lateralen Zellkontakten der normalen Enterozyten korrelieren signifikant miteinander. In kolorektalen Karzinomen verschwinden dann beide Moleküle simultan aus diesen lateralen Zellkontakten. Während β-catenin daraufhin im Zytoplasma und den Zellkernen der Karzinomzellen erscheint, ist die neu auftretende verstärkte Expression von CD97 auf das Zytoplasma der Karzinomzellen beschränkt. Dieses simultane Auftreten von CD97 im Zytoplasma und von β-catenin im Zellkern maligner kolorektaler Zellen korreliert mit dem Auftreten von scattered Tumorzellen. Die scattered Tumorzellen, auch als tumor buds bezeichnet, besitzen hypo-proliferative und apoptotische Eigenschaften. Diese scattered Tumorzellen an der Invasionsfront der kolorektalen Karzinome unseres Kollektivs exprimieren CD97 jedoch nicht stärker als Zellen im Karzinomzentrum. β-catenin hingegen wird in diesen scattered Tumorzellen vermehrt im Zytoplasma und in den Zellkernen exprimiert. Die Unterschiede der Färbeergebnisse im Vergleich zur Arbeit von Steinert et al. sind zum einen auf die Verwendung von Paraffin- statt Kryostat-Schnitten in unserer Studie und zum anderen auf die Nutzung verschiedener Antikörper gegen CD97, die unterschiedliche Epitope erkennen, zurückzuführen. Wir konnten einen Expressionsgradienten von CD97 entlang der Krypt-Villus-Achse, mit starker Expression im Kryptenbereich und schwächerer Expression in apikalen Bereichen, zeigen. Passend dazu wird nicht-phosphoryliertes membrangebundenes β-catenin in Kryptengrund-nahen Enterozyten stärker exprimiert. Dies ist ein weiterer Hinweis auf eine wahrscheinliche Interaktion von CD97 und nicht-phosphoryliertem membrangebundenem β-catenin. Ebenfalls passend zum hier gezeigten Expressionsgradienten von CD97 entlang der Krypt-Villus-Achse und der Regeneration der Enterozyten aus Kryptengrund-nahen undifferenzierten intestinalen Stammzellen konnte zuletzt gezeigt werden, dass der Vorgang der Apoptose durch CD97 inhibiert wird. Hier konnten wir nachweisen, dass in weiter luminal gelegenen Enterozyten die Expression von CD97 abnimmt. Diese Beobachtung harmoniert mit der Tatsache, dass apoptotische Zelluntergänge, im Sinne der Homöostase der intestinalen Selbsterneuerung, in diesen Enterozyten zunehmen. Dieses apoptotische Verhalten von CD97 könnte eine wichtige Rolle beim Überleben von Tumorzellen spielen. Kürzlich konnten wir in unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass CD97 und β-catenin in den lateralen Zell-Zellkontakten miteinander interagieren. Passend dazu ko-immunpräzipitiert CD97 β-catenin in DLD-1-Zellen und transgenen (Tg-villin-CD97) Zellen und umgekehrt. Obwohl sich wie hier gezeigt die Expression von CD97 und β-catenin in den lateralen Zell-Zellkontakten simultan vermindert und es sich gleichzeitig eine parallele Zunahme der Expression von CD97 und β-catenin im Zytoplasma zeigt, kommt es zu keiner nachweisbaren Interaktion beider Moleküle im Zytoplasma. Passend dazu konnte auch nur in den lateralen Zellkontakten eine Kolokalisation beider Moleküle in der Immunfluoreszens gezeigt werden. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass CD97 weder die Lokalisation noch die Expression von β-catenin beeinflusst. Wie beschrieben stabilisiert CD97 die lateralen Zell-Zellkontakte im normalen Epithelgewebe. Im Gegensatz dazu steht die Funktion von CD97 in malignen Geweben. Die Expression von CD97 korreliert mit dem Vermögen von kolorektalen Tumorzelllinien zur Serum-induzierten Migration und Invasion. Die Serumkomponente Lysophosphatidsäure (LPS) induziert Zellmigration durch eine Dämpfung der LPS-Rezeptor Signaltransduktion über Gα12/13 und RhoA auf das Zytoskelett durch eine Interaktion mit CD97. Für diese durch CD97 verstärkte Zellmigration ist das vollständige CD97-Molekül notwendig. Wie unlängst gezeigt, verhindert die Verkürzung des CTF von CD97 ebenfalls die Interaktion von CD97 und β-catenin. Noch ist unklar, ob die beiden Funktionen von CD97, Zelladhäsion und Regulation der Migration von Tumorzellen, miteinander im Zusammenhang stehen. Die Reduktion von CD97 in den lateralen Zell-Zellkontakten führt zum Auftreten von CD97 im Zytoplasma. Interessanterweise konnte zuletzt in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, dass CD97 nach Zerstörung dieser Zell-Zellkontakte schneller im Zytoplasma erscheint als β-catenin. Dieser Fakt spricht mehr für eine Translokation als für eine Akkumulation bzw. Hinderung des Transports von CD97 zur Zellmembran in Tumorzellen. Es konnte gezeigt werden, dass nach dem Erscheinen von CD97 im Zytoplasma die Kolokalisation und somit auch die Interaktion mit β-catenin nicht mehr nachweisbar ist. Somit stimuliert CD97 nicht die β-catenin-abhängige TCF-vermittelte Aktivität von Transkriptionsfaktoren und es kommt nicht zur Aktivierung von Genen, die Proteine kodieren, welche u.a. die kolorektale Karzinogenese stimulieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CD97 ein multifunktionales Protein ist, dass über eine Interaktion mit β-catenin in adherens junctions in normalen Epithelzellen die Zell-Zelladhäsion reguliert und andererseits über eine Interaktion mit dem LPS-Rezeptor eine wichtige Rolle in Signaltransduktionswegen in Karzinomzellen spielt.