Primary cilia are nonmotile, hair-shaped organelles that extend from the basal body in the centrosome. The present study is the first investigation of this organelle in the oligodendrocyte lineage in vivo. I used immunohistochemical approaches in normal and cilia-deficient mutant mice to study cilia in relation to oligodendrogenesis and myelination. Primary cilia immunoreactive for Arl13b and ACIII were commonly present in NG2+ oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), in which cilia-associated pathways control proliferation, differentiation, and migration. The loss of primary cilia is generally associated with enhanced Wnt/β-catenin signaling, and Wnt/β-catenin signaling has been shown to promote myelin gene expression. I examined whether the lack of cilia in the oligodendrocyte lineage is associated with elevated Wnt/β-catenin activity. I found that absence of a primary cilium was associated with with higher levels of TCF3, and with β-galactosidase in Axin2-lacZ Wnt reporter mice. This evidence supports the proposal that cilia loss in oligodendrocytes leads to enhanced Wnt/β-catenin activity, which promotes myelination. Cilia are dependent on the centrosome, which assembles microtubules for the cilium, the cytoskeleton, and the mitotic spindle. Centrosomes are the organizing center for microtubule assembly in OPCs, but this function is decentralized in oligodendrocytes. I found that the intensity of centrosomal pericentrin was reduced in oligodendrocytes relative to OPCs, and γ-tubulin was evident in centrosomes of OPCs but not in mature oligodendrocytes. These decreases in centrosomal proteins might contribute to functional differences between OPCs and oligodendrocytes. The importance of cilia in the oligodendrocyte lineage was examined in Tg737orpk mice, which have a hypomorphic IFT88 mutation resulting in decreased cilia numbers and lengths. These mice showed marked, differential decreases in numbers of oligodendrocytes and myelin, yet little or no change in OPC populations. It appears that sufficient cells were available for maturation, but lineage progression was stalled. There were no evident effects of the mutation on Wnt/β-catenin. Factors that might contribute to the abnormalities in the oligodendrocyte lineage of Tg737orpk mice include decreased cilia-dependent Shh mitogenic signaling and dysregulation in cilia-associated pathways such as Notch and Wnt/β-catenin.

4 Abstract The Wnt pathway is one of the major signaling cascades contributing to multiple cellular processes during embryogenesis, and adult tissue homeostasis and regeneration. Moreover, aberrant activation of the Wnt signaling pathway is connected with development of neoplasia, notably colorectal cancer. The aim of the thesis was to identify new ways of the Wnt pathway regulation to understand better physiological as well as non-physiological mechanisms of Wnt signaling. The results are summarized in four publications. The first article deals with TROY, a member of tumor necrosis factor receptor family. We identified TROY as a Wnt target gene during our search for Wnt responsive genes in colorectal cancer cell lines. Additionally, we detected expression of Troy in tumors of two mouse models of intestinal cancer. In the healthy gut, Troy is produced in fast cycling intestinal stem cells where negatively regulates the Wnt pathway. The second study focuses on processing and posttranslational modification of murine Wnt1 and Wnt3a. Wnts are glycosylated and double acetylated by lipid adducts and our results revealed that O-linked acylation of serine is required for the subsequent S-palmitoylation of cysteine. Moreover, acylation of Wnts is connected with their signaling activity which is related to Wnt1 and...

Les carcinomes de la cortico-surrénale (CCS) sont des tumeurs de mauvais pronostic et les thérapies sont encore limitées. La chirurgie reste à ce jour le seul traitement efficace. La compréhension des mécanismes de la tumorigenèse cortico-surrénalienne et l'identification des gènes et des voies de signalisation impliquées sont nécessaires pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces dernières années, plusieurs études de génomique ont été réalisées sur des cohortes indépendantes de CCS et ont mis en évidence l'existence de deux groupes de CCS ayant des profils d’expression génique particuliers et associés à des pronostics de survie différents. Il a aussi été identifié de fréquentes mutations touchant les gènes TP53 et CTNNB1 (β-caténine). De plus, l'activation aberrante de la voie WNT/β-caténine est associée au groupe des CCS agressifs. Enfin, des analyses des altérations génomiques par puce SNP et le séquençage de l’exome de cohortes de CCS a permis de préciser les fréquences des mutations de TP53 (~18%) et CTNNB1 (~14%) mais a aussi mis en évidence des mutations et des délétions homozygotes au niveau du gène ZNRF3 (Zinc And Ring Finger 3) dans environs 20% des CCS. ZNRF3 a été montré comme jouant un rôle de régulateur négatif de la voie WNT/β-caténine. Par conséquent, la voie de signalisation WNT/β-caténine est la voie la plus fréquemment altérée dans les CCS (~40%). L’objectif de mon projet était d’étudier comment l’activation constitutive de la voie WNT/β-caténine pouvait participer à la tumorigenèse cortico-surrénalienne, puis d'essayer de comprendre plus spécifiquement le rôle des altérations de ZNRF3 dans le développement et/ou l'agressivité des CCS. En combinant des analyses de transcriptomes de modèles cellulaires et de cohortes de CCS, nous avons établi une signature robuste cortico-surrénalienne de l'activation de la voie WNT/β-caténine. Parmi les gènes de cette signature, nous avons montré que AFF3 était une cible transcriptionnelle de la β-caténine et qu'il était capable de transmettre en partie les effets oncogèniques de la voie WNT/β-caténine dans les cellules cortico-surrénaliennes. En effet, son invalidation entraîne l'apoptose et diminue la prolifération des cellules cortico-surrénaliennes à l'image de l'invalidation de la β-caténine. La surexpression d’AFF3 altère l’organisation des speckles nucléaires et la localisation de CDK9/CyclinT1 impliqués respectivement dans l'épissage des ARNm et la transcription des gènes. ZNRF3 est le gène le plus fréquemment altéré dans les CCS alors qu'il l'est très peu dans les autres types de cancers. ZNRF3 est une E3 ubiquitin ligase qui entraîne l'internalisation et la dégradation des récepteurs Frizzleds de la voie WNT. Nous avons montré que ZNRF3 agit bien comme un gène suppresseur de tumeur dans les cellules cortico-surénaliennes humaines H295R. En effet la surexpression de ZNRF3 diminue la prolifération et augmente l’apoptose cellulaire de ces cellules. Nous avons aussi montré qu'à l'image d'autres régulateurs négatifs de la voie WNT comme AXIN2, ZNRF3 est un gène cible de la voie WNT/β-caténine dans la corticosurrénale. De manière intéressante, les altérations du gène ZNRF3 ne sont pas retrouvées dans des tumeurs présentant une forte activation de la voie de signalisation WNT/β-caténine, suggérant l'implication d'autres voies de signalisation. Nous avons identifié des partenaires protéiques de ZNRF3 par des expériences d'immunoprécipitation / spectrométrie de masse. Nous avons montré que ZNRF3 interagit avec la sous unité catalytique de la pompe NA+/K+, ATP1A1. Cette interaction altère le fonctionnement de la pompe NA+/K+ conduisant à des modifications du flux de Ca2+ intracellulaire. L'ensemble de ces travaux a permis de mieux comprendre comment la voie WNT/β-caténine participe à l'agressivité des cancers de la corticosurrénale et de montrer qu'AFF3 est essentiel pour les effets oncogéniques de cette voie. (...) / Adrenocortical carcinomas are rare tumors with poor prognostic and limited therapy. Up to now, surgery remains the only curative therapy. A better understanding of tumor biology and molecular prognostic factors would help to select relevant therapeutic targets and to develop innovative therapeutic strategies. In the last years, different genomic studies on independent cohorts of ACC have identified two subgroups of cancers with two distinguished profiles of genes expression and two different survival rates. Frequents alterations of CTNNB1 and TP53 are identified in ACC. Moreover, aberrant activation of WNT/β-catenin pathway in ACC is associated with lower overall survival. Using a combination of genomic approaches, we and others have recently analyzed independent cohorts of ACC. These works confirmed recurrent alterations in CTNNB1 (~14%) and TP53 (~18%), but also revealed new loci not previously reported to be altered in ACC. Strikingly, ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (~20%). ZNRF3 encodes a protein that acts as a negative regulator of Wnt/β-catenin pathway. The Wnt/β-catenin pathway represents the most frequently altered pathway in ACC (~40%). The aim of my project was to study how the aberrant activation of WNT/β-catenin pathway could participate to adrenal tumorigenesis and then to identify more specifically the role of ZNRF3 alterations in development/aggressiness of ACC. By a combination of transcriptomic analysis on two cohorts of ACC and on H295R adrenocortical cells, we identified a list of genes whose expression is correlated to the WNT/β-catenin activation. Among these genes, we show that AFF3 is essential to mediate the effect of activation the WNT/β-catenin pathway in adrenocortical cancer. Indeed, AFF3 is a direct target gene of β-catenin and its silencing in H295R adrenocortical cells induces a decreased cell proliferation and an increased apoptosis similar to that induced by β-catenin silencing. Moreover, AFF3 overexpression altered the structure of nuclear speckles and the localization of CDK9/CyclinT1, which are respectively involved in mRNA splicing and transcription. ZNRF3 (zinc and ring finger 3) was the most frequently altered gene (20%) in ACC. ZNRF3 had never been frequently associated with other tumour types. ZNRF3 encodes a protein that had been described as cell-surface transmembrane E3 ubiquitin ligases, acting as negative regulators of Wnt/β-catenin signaling, by promoting the degradation of Wnt ligand receptors (Frizzled receptors). We show that ZNRF3 act as a tumor suppressor gene in adrenocortical cell line H295R. Indeed the overexpression of ZNRF3 decreases cell proliferation and increases apoptosis. We demonstrate also that ZNRF3 is a target gene of WNT/β-catenin pathway. ZNRF3 alterations have less effect on expression of WNT/β-catenin target genes than CTNNB1 mutations in ACC. Moreover, our results with ZNRF3 overexpression in H295R adrenocortical cells suggest that ZNRF3 is also involved in βcatenin independant-pathway(s) to mediate its effects on apoptosis. Using mass spectrometry analysis, we identified that ZNRF3 interacts with ATP1A1 (ATPase Na+/K+ Transporting Subunit Alpha 1), affecting the activity of the Na+/K+ ATPase pump in adrenocortical cells. These results provide a better understanding of the biological process of WNT/βcatenin pathway activation in ACC with AFF3 as new target of this pathway. Moreover, our data provide insight into the tumor suppressor role of ZNRF3 in ACC and uncovers an additional role of ZNRF3 on Na+/K+ ATPase pump activity.

L’adrénomédulline (AM) est un des principaux facteurs de croissance impliqués dans la formations de nouveaux vaisseaux. L’AM est responsable de la formation de jonctions adhérentes stables entre cellules endothéliales vasculaires via le maintien d’un état déphosphorylé du complexe d’adhésion VE-cadhérine/caténines. La phosphorylation de tyrosines est un évènement régulé par un équilibre entre protéine tyrosine kinases et protéine tyrosine phosphatases (PTP). Peu de choses sont encore connues sur le rôle des PTPs dans les voies de signalisation de l’AM au niveau des cellules endothéliales. La SHP2 a été décrite comme étant capable de déphosphoryler le complexe d’adhésion. Son association avec la β-caténine lui permet de contrôler le niveau de phosphorylation du complexe et de maintenir l’association entre VE-cadhérine et caténines. Nous avons ainsi émis l’hypothèse selon laquelle l’AM puisse agir sur la SHP2 permettant ainsi le contrôle de la formation du complexe d’adhésion VE-cadhérine-β-caténine. Nos travaux ont mis en évidence une augmentation de l’activation de la SHP2 induite par l’AM dans les cellules endothéliales entrainant sa localisation au niveau de la membrane et la stabilisation de l'adhésion cellulaire induite par la VE-cadhérine en réduisant le niveau de phosphorylation de cette dernière. Le blocage de la SHP2 entraine des effets opposés avec une inhibition de la déphosphorylation induite par l’AM de la VE-cadhérine sur les tyrosines 731 et 658. En résumé, l’AM régule l’activité de la SHP2 via sa phosphorylation sur la tyrosine 542 ce qui entraine une stabilisation des contacts cellules-cellules via une diminution de la phosphorylation de la VE-cadhérine. / Adrenomedullin (AM) is one of the main factors in the formation of tumor neo-vessels. It's responsible for stable adherent junction formation between vascular endothelial (VE) cells by maintaining VE-cadherin/catenins adhesion complex in a dephosphorylated status. Indeed, AM blockade induces phosphorylation of VE-cadherin in tyrosine 731, which is followed by disruption of VE-cadherin-mediated cell-cell contacts of endothelial cells (ECs), thereby leading to EC adhesion loss and tumor vessels disruption. Tyrosine phosphorylation events are controlled by the balance of activation of protein tyrosine kinases and protein tyrosine phosphatases (PTPs). Little is known about the role of endogenous PTPs in AM signaling in ECs. SHP2 is capable of dephosphorylating the complex. Its association with β-catenin allows it to control the dephosphorylated steady state of the complex and to maintain the VE-cadherin/β-catenin association. To study the mechanism of AM on the inter-endothelial junction stabilization, we hypothesized that AM may act on SHP2 allowing a control upon formation of VE-cadherin-β-catenin complex. In this study, we found that SHP2 activity is markedly increased by AM. In ECs, AM-induced phospho-SHP2 Y542 activity to localize at the human umbilical vein endothelial cell membrane and stabilizes VE-cadherin-mediated cell-cell adhesions by reducing VE-cadherin tyrosine phosphorylation. SHP2 inhibition causes opposite effects with inhibiting AM-induced dephosphorylation of VE-cadherin at Y731 and Y658. In summary, AM regulates SHP2 activity through phosphorylation of Y542, which stabilizes cell-cell adhesions through reducing tyrosine phosphorylation of VE-cadherin.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-01-29T08:31:16Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Carlos Henrique Pereira - 2014.pdf: 3850945 bytes, checksum: 985b041e7a863070b3fa0562180a40f3 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-01-29T08:33:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Carlos Henrique Pereira - 2014.pdf: 3850945 bytes, checksum: 985b041e7a863070b3fa0562180a40f3 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-29T08:33:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Carlos Henrique Pereira - 2014.pdf: 3850945 bytes, checksum: 985b041e7a863070b3fa0562180a40f3 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-07-07 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Objective: Investigate, on a comparative basis, the expression of the adhesion molecules E-cadherin (E-cad), β-catenin (β-cat) and the proliferation index (Ki-67) at the invasive tumor front (ITF) in Squamous Cell Carcinoma (SCC) and basaloid squamous cell carcinoma (BSCC). Material and Methods: Thirty-five SCC and 16 BSCC cases were evaluated by immunohistochemistry. Clinico-pathological data and survival data were evaluated and compared. Results: There was a low expression of E-cad in the cytoplasmic membrane (p = 0.50) as well as in the nucleus (p = 0.31) for both SCC and BSCC. A high expression of E-cad was seen in the cytoplasm for the SCC group (80%) when compared to the BSCC group (25%) (p<0.01). The expression of β-cat in the cytoplasmic membrane (p = 0.28) and in the cytoplasm (p = 0.44) was low in both SCC and BSCC groups. Both types of carcinoma presented low expressions of β-cat in the nucleus (p = 0.03). The Ki-67 expression was low irrespective of tumor variant. The high expression of E-cad in the cytoplasm was associated with T3/T4 tumors (p = 0.04) in the SCC group and there was no significant association of E-cad, β-cat, Ki-67 with the other clinical variables. In terms of disease-free survival and overall survival, there were no significant differences between SCC and BSCC. Conclusion: The E-cad-β-cat system was found to be dysregulated in both oral SCC and oral BSCC. The Ki-67 cell proliferation index was extremely low in the cases investigated and consequently had no prognostic value. / Objetivo: Investigar comparativamente a expressão das moléculas de adesão E-caderina (E-cad), β-catenina (β-cat) e o índice de proliferação (Ki-67) em Carcinoma Espinocelular (CEC) e Carcinoma escamoso basalóide (CEB). Material e Métodos: Nesse estudo, foram selecionados 35 casos de CEC e 16 casos de CEB e investigados por meio de técnica imuno-histoquímica. A associação das variáveis clinico-patológicas e dados de sobrevida foram avaliados. Resultados: Ambos os grupos tiveram baixa expressão de E-cad em membrana citoplasmática (p=0,50) e núcleo (p=0,31), essa associação não foi estatisticamente significante entre os grupos. Alta expressão de E-cad no citoplasma foi notada no grupo CEC (80%) quando comparado ao grupo CEB (25%), p<0,01. A expressão de β-cat em membrana citoplasmática (p=0,28) e citoplasma (p=0,44) foram baixos em CEC e CEB. Ambos os grupos tiveram baixa expressão de β-cat em núcleo, p=0,03. Não houve diferença estatisticamente significante quanto à expressão de Ki-67 entre os grupos. Alta expressão de E-cad em citoplasma foi associada a tumores T3/T4 (p=0,04) no grupo CEC. Pacientes estilistas apresentaram baixa expressão de β-cat em membrana citoplasmática (p=0,05). Não houve associação entre a expressão de E-cad, β-cat e Ki-67 com as demais variáveis clínicas dos grupos. A sobrevida livre de doença e a sobrevida global não foram estatisticamente significantes na associação entre os grupos CEC e CEB. Conclusão: O sistema E-cad-β-cat encontra-se desregulado tanto nos de CEC quanto nos de CEB de cavidade oral, levando as células epiteliais a perderem o seu fenótipo e promovendo a invasão e progressão tumoral. O índice de Ki-67 foi extremamente baixo não tendo valor prognóstico nos casos avaliados.

Les intégrines sont des protéines transmembranaires, formées d’une sous-unité α et d’une sous-unité β, qui sont impliquées dans de nombreuses caractéristiques du cancer. Mes travaux de thèses ont montré que l’axe intégrine α5β1/AKT est impliqué dans la résistance à l’apoptose des cellules de glioblastome et dans leur migration. L’inhibition fonctionnelle de l’intégrine α5β1 associée à la réactivation de p53 sensibilise les cellules de glioblastome à l’apoptose. Mes résultats ont mis en évidence que les protéines anti-apoptotiques PEA-15 et Survivine sont deux intervenants majeurs dans cette résistance à l’apoptose. La migration dépendante de l’intégrine α5β1 implique la β-caténine. Les résultats obtenus par ce travail de thèse, donnent, par conséquent, des arguments supplémentaires en faveur de l’implication de l’intégrine α5β1 dans l’agressivité des glioblastomes. Ces résultats permettent également de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que des biomarqueurs pertinents pour stratifier les patients potentiellement répondeurs à une stratégie anti-intégrine. / Integrins are αβ membrane localised protein heterodimers involved in numerous hallmarks of cancer. My PhD thesis showed that the integrin α5β1/AKT axis is implicated in glioblastoma cells resistance to apoptosis and migration. The inhibition of α5β1 integrin oncogenic pathway sensitizes glioma cells to p53-reactivation dependent apoptotic cues. My results showed that PEA-15 and Survivin are two anti-apoptotic proteins involved in the resistance to apoptosis. α5β1 integrin dependent migration involves the β-catenin pathway. My results confirm that α5β1 integrin has to be considered as an important player in glioblastoma aggressiveness and resistance to therapy. The results of my thesis also suggest new therapeutic targets and pertinent biomarkers for glioblastoma patient stratification.

La prévalence du syndrome métabolique (MetS) est en constante augmentation dans les pays industrialisés. La stéatose hépatique, caractérisée par une accumulation massive de lipides dans les hépatocytes est une des manifestations du MetS. Parmi les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) associés au MetS et à la stéatose hépatique, le SNP I148M de l’adiponutrine/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) est décrit comme un nouveau marqueur de la stéatose et également de la sévérité des différentes atteintes hépatiques des NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle de l’adiponutrine dans le foie, d’une part, en étudiant sa régulation transcriptionnelle par les facteurs de transcription SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) et ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein) en réponse à l’insuline et au glucose et d’autre part, en étudiant l’impact de sa surexpression sur le métabolisme glucido-lipidique dans le foie de souris. L’adiponutrine est régulée de façon semblable aux enzymes lipogéniques et semble avoir un impact sur le métabolisme lipidique dans le foie. Comme l’adiponutrine, différents SNP des médiateurs de la voie Wnt/β-caténine sont également associés au syndrome métabolique et au diabète. La voie Wnt/β-caténine joue un rôle déterminant dans la zonation du lobule hépatique. Nous nous sommes intéressés à la régulation de cette voie par les conditions nutritionnelles et dans un contexte physiopathologique de stéatose et de résistance à l’insuline. Nos résultats montrent la régulation de cette voie par les hormones pancréatiques (insuline et glucagon) dans le foie favorisant ainsi l’orientation métabolique des hépatocytes en fonction des besoins. De plus, cette voie est dérégulée dans le foie d’animaux résistants à l’insuline, suggérant qu’elle pourrait avoir une fonction dans ce désordre métabolique. / The prevalence of metabolic syndrome (MetS) has increased in industrial countries. The hallmark of MetS in the liver is an excessive accumulation of triglyceride, which is called hepatic steatosis. Different SNP (Single Nucleotide Polymorphism) are associated with hepatic steatosis or MetS. One of them is found on adiponutrin/PNPLA3 (Patatin-like Phospholipase Domain-Containing) gene (SNP I148M) and is now considered as a new marker of hepatic steatosis and severity of NAFLD (Non-alcoholic Fatty Liver diseases). In order to understand the physiological role of adiponutrin in the liver, we studied its transcriptional regulation by SREBP1c (Sterol Responive Element Binding Protein) and ChREBP (Carbohydrate Responsive Element Binding Protein), mediators of insulin and glucose respectively. Moreover, by overexpressing adiponutrin in mice liver, we investigated its role in hepatic carbohydrate and lipid metabolism. We showed that adiponutrin is regulated as lipogenic genes and could have a role lipid metabolism. As for adiponutrin I148M, different SNP are found on substrats of Wnt/β-catenin pathway, a major pathway controlling acinus zonation. We examined the regulation of this pathway by nutritionnal status and in a pathophysiological context of insulin resistance and steatosis. We showed that Wnt/β-catenin pathway is regulated by pancreatic hormones (insulin and glucagon) in the liver in order to adapt hepatocyte phenotype to energetic needs. Moreover, this pathway is dysregulated in insulin resistant mice liver. These data may suggest a link between Wnt/β-catenin pathway deregulation and hepatic metabolic disorders.

Abstract Wnt genes encode secreted signalling molecules that control embryonic development including organogenesis, while dysregulated Wnt signalling is connected to many diseases such as cancer. Specifically, Wnts control a number of cellular processes such as proliferation, adhesion, differentiation and aging. Many Wnt proteins activate the canonical β-catenin signalling pathway that regulates transcription of a still poorly characterized set of target genes. Wnts also transduce their signaling in cells via β-catenin-independent “non-canonical” pathways, which are not well understood. In this study, Wnt-11 signalling mechanisms in a mammalian model cell line and roles of Wnt-11 in heart development were analyzed in detail. In addition the aim was to identify new Wnt target genes by direct chromatin immunoprecipitation and Affymetrix GeneChip assays in the model cells exposed to Wnt-3a. Our studies reveal that Wnt-11 signalling coordinates the activity of key cell signalling pathways, namely the canonical Wnt/β-catenin, the JNK/AP-1, the NF-κB and PI3K/Akt pathways in the CHO cells. Analysis of the Wnt-11-deficient embryos revealed a crucial role in heart organogenesis. Wnt-11 signalling coordinates cell interactions during assembly of the myocardial wall and Wnt-11 localizes the expression of N-cadherin and β-catenin to specific cellular domains in the embryonic ventricular cardiomyocytes. Collectively these studies reveal that the mammalian Wnt-11 behaves as a non-canonical Wnt and that it is a critical factor in the coordination of heart development. Specifically, it controls components of the cell adhesion machinery. Analysis of the Wnt target genes revealed a highly context-dependent profile in the Wnt-regulated genes. Several new putative target genes were discovered. Out of the candidate Wnt target genes, Disabled-2 was identified as a potential new direct target for Wnt signalling.

Nouveau modèle d’étude de l’hépatoblastome in vivo et identification de microARNs régulateurs de la β-caténineL’hépatoblastome (HBL) est le cancer du foie le plus fréquent chez l’enfant. Au niveau moléculaire, il est caractérisé par des mutations activatrices dans le gène de la β-caténine (CTNNB1) entrainant une accumulation de sa protéine et une activation anormale de la voie de signalisation Wnt, responsables de la transformation maligne des cellules hépatiques. Ainsi, la β-caténine est une cible thérapeutique majeure dans l’HBL.Ce manuscrit décrit les deux parties principales de mon projet de thèse, dont l’objectif était d’étudier le rôle de microARNs régulateurs de la β-caténine sur la carcinogenèse de l’HBL.La première partie présente le développement d’un nouveau modèle d’étude in vivo de l’HBL. Ce travail a consisté à réaliser des xénogreffes de cellules dérivées d’HBL sur la membrane chorioallantoidienne (CAM) de l’embryon de poulet, et à étudier le développement des tumeurs par des approches histologiques et moléculaires. Mes résultats montrent que les cellules d’HBL modifient leur phénotype et activent des mécanismes de survie et de prolifération pour former des nodules tumoraux structurés et vascularisés au sein de la CAM. Le traitement des cellules par le cisplatine conduit à un arrêt net de la progression tumorale.La seconde partie présente les résultats concernant la régulation de la β-caténine et des processus oncogéniques par les microARNs dans les cellules d’HBL. Un crible fonctionnel m’a permis d’identifier plusieurs microARNs ayant un effet inhibiteur sur la β-caténine. Quatre microARNs, sous-exprimés dans les tumeurs de patients, bloquent la prolifération cellulaire et l’activité de la voie Wnt in vitro. Le miARN le plus efficace interagit avec l’ARNm de la β-caténine via un site unique localisé dans sa région 3’ non traduite et bloque la croissance des tumeurs d’HBL sur la CAM.Durant ma thèse j’ai développé un nouveau modèle animal d’étude de l’HBL qui permet de modéliser la croissance tumorale et de tester l’impact de molécules thérapeutiques. Ce travail a également permis d’identifier de nouveaux microARNs sous-exprimés dans les tumeurs d’HBL, qui inhibent l’expression de la β-caténine et agissent comme des gènes suppresseurs de tumeur. Ces microARNs constituent de potentielles nouvelles molécules thérapeutiques dans le traitement de l’HBL et pourraient aussi être utilisés comme des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques. / Hepatoblastoma (HBL) is the most common pediatric liver cancer. At molecular level it is characterized by activating mutations in β-catenin gene (CTNNB1) that cause protein accumulation and abnormal Wnt signaling pathway activation leading to malignant transformation of hepatic cells. Therefore, β-catenin is a key therapeutic target in HBL.This manuscript describes two major parts of my thesis project that aimed to understand the role of β-catenin-regulating microRNAs in HBL carcinogenesis.The first part presents the development of a new in vivo HBL model. This work consisted of making HBL-derived cells xenograft on chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) and studying tumor development using histological and molecular approaches. My results show that HBL cells implanted on CAM modify their phenotype and activate survival and proliferation mechanisms to form organized and vascularized tumor nodules. Cell treatment with cisplatin leads to tumor progression arrest.The second part presents results concerning the regulation of β-catenin and oncogenic processes by microRNAs in HBL cells. A functional screening allowed me to identify several microRNAs with an inhibitory effect on β-catenin. Four microRNAs down-regulated in patient tumors inhibit cell proliferation and Wnt pathway activity in vitro. The most efficient microRNA directly interacts with β-catenin mRNA through a unique site localized in 3’ untranslated region and blocks HBL tumor growth on CAM.During my thesis I developed a new animal model to study HBL that allows modelling rapid tumor growth and testing the impact of therapeutic molecules. My work also led to the identification of new microRNAs down-regulated in HBL tumors that inhibit β-catenin expression and act as tumor suppressor genes. Those microRNAs represent new potential therapeutic molecules for HBL treatment and could be also used as diagnostic and prognostic biomarkers.

Les carcinomes cortico-surrénaliens (CCS) sont des tumeurs malignes rares de mauvais pronostic et pour lesquelles les options thérapeutiques efficaces sont inexistantes. Il est donc indispensable de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des CCS, afin d’améliorer leur prise en charge. Les deux altérations les plus fréquentes dans les CCS sont une surexpression du facteur de croissance IGF2 et l'activation constitutive de la voie Wnt/β-caténine. Le laboratoire a mis en évidence le rôle oncogénique de la β-caténine à l'aide d'un modèle murin (souris ΔCat) présentant une activation constitutive de la β-caténine dans la cortico-surrénale. Toutefois, la faible pénétrance du phénotype malin suggère la nécessité d'autres altérations pour la progression tumorale. L’objectif initial de ma thèse était de tester le pouvoir oncogénique de IGF2, seul ou en association avec l’activation constitutive de la β-caténine. Les modèles de surexpression de Igf2 dans la cortico-surrénale nous ont permis de montrer que Igf2 n'initie pas le développement de tumeurs cortico-surrénaliennes. Dans un contexte d'activation de la β-caténine, la surexpression de Igf2 favorise le développement tumoral à des stades tardifs. Toutefois la formation de tumeurs malignes reste un évènement rare. Ces résultats suggèrent donc que la surexpression de Igf2 et l'activation de la β-caténine ne sont pas suffisantes dans notre modèle pour induire le développement de CCS. Une analyse rétrospective des données de transcriptome nous a permis de mettre en évidence une surexpression de l’oncogène putatif et histone méthyl-transférase EZH2, qui est associée à un mauvais pronostic. Mes travaux in vitro suggèrent que EZH2 est surexprimé en réponse à une surexpression des facteurs E2F et qu’il pourrait être impliqué dans le contrôle de la prolifération, de l'apoptose et de certaines caractéristiques tumorales des cellules cortico-surrénaliennes humaines H295R. Des inhibiteurs pharmacologiques étant disponibles, EZH2 pourrait constituer une cible thérapeutique intéressante pour le traitement des CCS. En parallèle de ces travaux, nous avons cherché à identifier les mécanismes impliqués dans la zonation du cortex surrénalien. Au cours du renouvellement tissulaire, les cellules acquièrent d’abord une identité glomérulée puis fasciculée. L'identité de la zone glomérulée repose en partie sur l'activité de la voie Wnt/β-caténine. Cette voie de signalisation induit l'expression de gènes essentiels à l'identité de cette zone et inhibe l'identité fasciculée. La différenciation fasciculée des cellules doit donc reposer en partie, sur l'inhibition de cette voie de signalisation. Nous avons donc émis l'hypothèse que la signalisation PKA, activée dans la zone fasciculée par la liaison de l'ACTH à son récepteur MC2R, s'oppose à l'activité de la β-caténine pour permettre la différenciation fasciculée. A l'aide d'approches pharmacologiques et génétiques, nous avons pu mettre en évidence que l'activation de la PKA inhibe la voie Wnt/β-caténine dans le cortex surrénalien et que ceci est à l'origine d'une perte de la zone glomérulée au profit d'une expansion de la fasciculée. L'effet de la PKA sur la voie Wnt résulte au moins en partie de l'inhibition de l'expression de Wnt4 en réponse à l'activation de la PKA. En effet une diminution d'expression de Wnt4 est observée en réponse à l'activation de la PKA dans la cortico-surrénale et l'invalidation de Wnt4 spécifiquement dans le cortex induit un phénotype proche de celui observé lors de l'activation de la PKA. Au delà des mécanismes moléculaires de la zonation, nous avons également montré que l’effet inhibiteur de la PKA sur la signalisation Wnt était capable de s’opposer aux effets oncogéniques de la β- caténine dans la cortico-surrénale. Ces observations pourraient s’avérer pertinentes, la voie de signalisation ACTH/PKA étant inhibée dans les CCS. / Adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare tumour associated with poor prognosis and for which, efficient therapeutic approaches are not available. It is therefore essential to understand the molecular mechanisms involved in CCS development in order to improve their clinical management. The two most frequent alterations in ACC are overexpression of IGF2 and constitutive activation of β-catenin. Our lab has previously demonstrated the oncogenic activity of β-catenin in the adrenal cortex by developing a mouse model of constitutive β-catenin activation (ΔCat mice). However, the low malignant progression in ΔCat mice suggests that other alterations are necessary for acquisition of malignancy. The initial aim of my thesis was to test the oncogenic potential of IGF2 alone or associated with constitutive β-catenin activation. We showed that overexpression of Igf2 in the adrenal cortex does not trigger adrenal cortex tumourigenesis. In a context of constitutive β-catenin activation, overexpression of Igf2 promotes tumour development at later stages. However the formation of malignant tumours remains a rare event. These data suggest that the overexpression of Igf2 and constitutive activation of β-catenin are not sufficient to trigger malignant tumour progression. Retrospective analysis of available ACC transcriptome data highlighted overexpression of the putative oncogene and histone methyltransferase EZH2 in ACC, which was associated with poor prognosis. My in vitro studies suggest that EZH2 is overexpressed in response to overexpression of E2F transcription factors and that it could be involved in control of proliferation, apoptosis and oncogenic capacities of adrenocortical carcinoma cells H295R. Interestingly, the availability of pharmacologic inhibitors suggests that EZH2 could be a novel therapeutic target for the treatment of ACC. In parallel, we sought to identify the mechanisms involved in zonation of the adrenal cortex. During adrenal cortex renewal, cells first differentiate as glomerulosa before switching to fasciculata as they move within the cortex. Establishment of glomerulosa identity relies on the Wnt/β-catenin pathway, which induces expression of genes involved in glomerulosa differentiation and inhibits fasciculata identity. These data suggest that β-catenin has to be inhibited in order to allow the lineage conversion from glomerulosa to fasciculata. We thus postulated that PKA signalling pathway, which is triggered by ACTH binding to its receptor MC2R in zona fasciculata, played a role in repressing Wnt/β-catenin signalling to allow fasciculata differentiation. Using pharmacologic and genetic models, we have shown that PKA inhibits β-catenin signalling, which leads to loss of zona glomerulosa and expansion of zona fasciculata. The inhibitor effect of PKA on β-catenin pathway could be the result of decreased expression of Wnt4. Indee, a decrease of Wnt4 expression is observed in response to PKA activation and inactivation of Wnt4 in the adrenal cortex phenocopies PKA activation. We have also shown that PKA inhibits oncogenic effects of β-catenin in the adrenal cortex. The observation of decreased ACTH/PKA signalling in ACC suggests that this inhibition could be relevant to human adrenal tumour development.