- / -

Η μελέτη αυτή αφορά το σχεδιασμό των μιγμάτων πρωτεΐνης/πολυηλεκτρολύτη και τις αλληλεπιδράσεις τους σε φυσιολογικές συνθήκες. Η παρακάτω έρευνα περιλαμβάνει σύμπλοκα αλβουμίνης ορού βοοειδούς (BSA) με ένα σύνολο κατιονικών ομοπολυμερών και συμπολυμερών πολύ (3-μεθακρυλαμιδο-προπυλο- τριμεθυλαμμωνιο-χλωριδιο) -co- (Ν, Ν-διμεθυλακρυλαμίδιο), με διαφορετικό μοριακό βάρος και σύσταση σε ομάδες πολυ (Ν, Ν- διμεθυλακρυλαμιδίου) (PDMAM). Μετρήσεις UV-VIS φασματομετρίας, η σκέδαση φωτός και ζ-δυναμικό συμμετείχαν στο χαρακτηρισμό των συσσωματωμάτων ως μία συνάρτηση της αναλογίας φορτίου r +/- , του pΗ και της ιοντικής ισχύος. Τα αποτελέσματα έδειξαν το σχηματισμό αντίθετων φορτισμένων συμπλόκων, σε pΗ υψηλότερο από 4.9, το ισοηλεκτρικό σημείο της BSA. Τέτοια σωματίδια βρέθηκαν να εξαρτώνται από την πυκνότητα φορτίου της επιφάνειας της πρωτεΐνης η οποία επηρεάζει σημαντικά τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις. Ως αποτέλεσμα, για ένα ομοπολυμερές PMAPTAC ο σχηματισμός αδιάλυτων συμπλοκών ευνοείται για υψηλές τιμές pΗ, όπου η πυκνότητα επιφανειακού φορτίου της πρωτεΐνης είναι μέγιστη. Αντίθετα, αύξηση της ιοντικής ισχύος οδηγεί σε καταστολή των απώσεων μακράς εμβέλειας μεταξύ των αρνητικά φορτισμένων περιοχών του πολυηλεκτρολύτη και της πρωτεΐνης, εξαιτίας τοπικών ηλεκτροστατικών επιδράσεων. Οι διαφορές στο σχηματισμό συμπλόκου επιβεβαιώθηκαν με σύγκριση δύο PMAPTAC ομοπολυμερών με διαφορετικά μοριακά βάρη σε σταθερό pΗ. Αυτά τα συσσωματώματα έδειξαν διαφορές στο μέγεθος και τις επιφανειακές ιδιότητες οδηγούμενες από την πυκνότητα φορτίου του πολυηλεκτρολύτη. Έτσι, τα μεγαλύτερα σωματίδια ελήφθησαν από το πολυκατιόν με υψηλότερο μοριακό βάρος σε pΗ 7,40. Ακόμα, ο ρυθμός κατανάλωσης της BSA για το σχηματισμό συμπλόκου με τον πολυηλεκτρολύτη ήταν παρόμοιος για όλες τις περιπτώσεις διαφορετικού pH δίνοντας έτσι το γεγονός ότι η καταβύθιση της BSA είναι ανεξάρτητη του pH. Η προσθήκη ουδέτερα υδρόφιλου PDMAM επεκτείνει το πιθανό μηχανισμό συμπλοκοποίησης. Με τη σύγκριση μιας σειράς από συμπολυμερή που φέρουν διαφορετικό αριθμό των υδρόφιλων ομάδων DMAM, μόνο διαλυτά σύμπλοκα πολυηλεκτρολύτη / πρωτεΐνης σχηματίζονται με υδροδυναμικά μεγέθη <50 nm. Η συμπεριφορά αυτή έχει αποδοθεί στην παρουσία των υδρόφιλων μονάδων DMAM που απλά δρα ως προστατευτικό εξωτερικό κέλυφος των συσσωματωμάτων εμποδίζοντας περαιτέρω συσσωμάτωση. Συνεπώς, από τα σύμπλοκα που σχηματίζονται από το συμπολυμερές με την διαφορετική περιεκτικότητα DMAM, ισχυρότερη προτίμηση ένωσης με την πρωτεΐνη έδειξε το συμπολυμερές με τη χαμηλότερη περιεκτικότητα DMAM. Αυτό δείχνει τη σημασία των υδρόφιλων ομάδων οι οποίες παρεμποδίζουν στερεοχημικά την πρόσβαση ή έκθεση των ιόντων στην επιφάνεια του συμπλόκου. Ακόμα, το υδρόφιλο εξωτερικό κέλυφος είναι είτε μικρότερο, είτε λιγότερο πυκνό, γεγονός που επιτρέπει την αναδιάταξη των σωματιδίων έτσι ώστε περισσότερα φορτία να είναι παρών στην επιφάνεια του 4 συσσωματώματος που μπορεί περαιτέρω να αλληλεπιδρούν με το κατιονικό πολυηλεκτρολύτη. Έτσι, το σύστημα που παρουσιάζεται εδώ δίνει μία εις βάθος μελέτη των πιθανών μηχανισμών των αλληλεπιδράσεων πολυηλεκτρολύτη με πρωτεΐνες. Επιπλέον, ο σχηματισμός συμπλοκών μικρής κλίμακας σταθερών σε υδατικό διάλυμα επιτεύχθηκε με ρύθμιση παραμέτρων, όπως το μοριακό βάρος, η αναλογία φορτίου και της ισορροπίας υδρόφιλου / υδρόφοβου. Επιπρόσθετα, τα συστήματα ήταν σε συμφωνία με περιβαλλοντικές συνθήκες όπως το pΗ και την ιοντική ισχύ. Τέτοια σωματίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για παροχή φαρμάκου με καλή σταθερότητα σε φυσιολογικές συνθήκες που μπορεί να οδηγηθεί μέσω της ροής του αίματος. Επιπλέον, η ευαισθησία στο pΗ των συστημάτων αυτών τα καθιστά εξαιρετικούς υποψηφίους για θεραπεία του καρκίνου, όπου οι διαφορές στο pH μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων μπορούν να δώσουν ιδέες για απελευθέρωση στοχευόμενου φαρμάκου. / This study concerns the design of protein/polyelectrolyte mixtures for complexion at physiological conditions. The concept herein involves bovine serum albumin (BSA) complexes with a set of cationic homopolymers and copolymers of poly (MAPTAC)-co -poly (N, N-dimethylacrylamide), with different molecular weight and composition in poly (N, N-dimethylacrylamide) (PDMAM) groups. UVVIS spectrometry, Light Scattering measurements and zeta-potential were involved in the characterization of the aggregates as a function of charge ratio r +/- , pH and ionic strength. The results revealed the formation of oppositely charged complexes, at pH higher than 4.9, the isoelectric point of BSA. Such particles were found dependent on the charge density of the protein surface which strongly influences the electrostatic interactions. As a result, for a PMAPTAC homopolymer the formation of insoluble complexes is favored for high pH values, where the surface charge density of the protein is maximum. Contrarily, enhancement of ionic strength conditions had led to suppression of long-range repulsion between polycation and protein negative domains due to electrostatic screening effects. The differences in the complexation were confirmed by comparing two PMAPTAC homopolymers with different molecular weights at constant pH. These aggregates showed differences in size and surface properties dictated by the charge density of the polyelectrolyte. Thus, larger particles were obtained from the polycation with higher molecular weight at pH 7.4. Interestingly, the rate of BSA consumption for polyelectrolyte formation was identical for all the occasions of pH leading to the conclusion that the consumption of BSA is independent of pH. Addition of neutral hydrophilic PDMAM extended the possible complexation mechanism. By comparing a set of copolymers bearing different content of hydrophilic DMAM groups, only soluble polyelectrolyte/ protein complexes were formed with hydrodynamic sizes < 50 nm. This behavior has been ascribed to the presence of the hydrophilic DMAM units that acts as a protective hydrated outer shell of the aggregates refraining further aggregation. Accordingly, the complexes formed from the copolymer with the different DMAM content have shown 2 stronger protein affinity for the copolymer with the lowest DMAM content. This illustrates the importance of hydrophilic groups which sterically hinder the access and/or exposure of ions to the surface of the complex. Thus the hydrophilic outer shell is either shorter or less dense, fact that allows rearrangement of the particles so that more charges are present on the surface of the aggregate that can further interact with the cationic polyelectrolyte. Thus, the system presented herein represents an in depth study of possible mechanisms of polyelectrolyte interactions with proteins. Furthermore, the formation of nano-scaled complexes stable in aqueous solution was achieved by tuning molecular parameters such as molecular weight, charge ratio and hydrophilic/hydrophobic balance. Additionally, the systems had presented responsiveness to environmental stimuli such as pH and ionic strength. Such particles can be used for drug delivery with good stability at physiological conditions which can lead to long circulation in the blood stream. Moreover, the pH sensitivity of these systems makes them excellent aspirants for cancer therapy where differences in tumor and normal cell pH is a concept for targeted drug delivery.

Η πρωτεΐνη YKL-40 είναι μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη, μέλος της οικογένειας των γλυκοπρωτεϊνών που ομοιάζουν με χιτινάση. Περιέχει καλά συντηρημένες περιοχές που προσδένουν χιτίνη, στερείται όμως της ενζυματικής δράσης της χιτινάσης εξαιτίας μιας σημειακής μετάλλαξης στην καταλυτική περιοχή. Από την υπάρχουσα βιβλιογραφία φαίνεται να εμπλέκεται στη διαδικασία της φλεγμονής αλλά και στη δημιουργία ίνωσης και νεοαγγειογένεσης. Στην παρούσα μελέτη, θελήσαμε να διερευνήσουμε την έκφραση της YKL-40 με την τεχνική της ανοσοιστοχημείας σε μιτροειδείς βαλβίδες του ανθρώπου με ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις ( βλεννώδη εκφύλιση ,ινωση ,νεοαγγειογένεση ασβέστωση ) και να συσχετίσουμε την πιθανή έκφραση της πρωτεϊνης με την παρουσία και την σοβαρότητα αυτών των αλλοιώσεων καθώς και με άλλες κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους της νόσου Χρησιμοποιήθηκαν συνολικά δείγματα από 71 περιστατικά μιτροειδών βαλβίδων μονιμοποιημένα σε ουδέτερη φορμόλη 10% και εγκλεισμένα σε παραφίνη. Εκ των οποίων τα 52 ήταν παθολογικά και τα 19 ήταν φυσιολογικά. Εφαρμόσθηκε η τεχνική της ανοσοιστοχημείας και τα αντισώματα YKL-40, VEGFA, CD31, CD68 και A-SMA. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του στατιστικού πακέτου SPSS 10.0 for Windows. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι η πρωτεΐνη YKL-40 υπερεκφράζεται στις παθολογικές βαλβίδες (στα μακροφάγα, στα ενδοθηλιακά και στα διάμεσα βαλβιδικά κύτταρ ) και ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της σχετίζονται με τη σοβαρότητα των ιστοπαθολογικών αλλοιώσεων. Μόνο σε 2 από τις 19 φυσιολογικές βαλβίδες παρατηρήθηκε θετική ανοσοϊστοχημική χρώση, στις υπόλοιπες 17 ήταν αρνητική. Η ανοσοϊστοχημική χρώση της πρωτεΐνης YKL-40 στις μιτροειδείς βαλβίδες είχε στατιστικά σημαντική σχέση με την ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης A-SMA, της πρωτεΐνης VEGFA, με την παρουσία μακροφάγων και την μέση αγγειακή πυκνότητα.Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης YKL-40 ήταν μεγαλύτερα στις γυναίκες με νόσο μιτροειδούς βαλβίδας και σχετίζονται στατιστικά σημαντικά με την ηλικία. Με βάση τα ανωτέρω αποτελέσματα, μπορούμε να εισηγηθούμε ένα πιθανό ρόλο της πρωτεΐνης YKL-40 στην παθογένεια της νόσου της μιτροειδούς βαλβίδας , καθώς φάνηκε να εκφράζεται από διάφορους κυτταρικούς τύπους στις παθολογικές βαλβίδες σε σχέση με τις φυσιολογικές όπου δεν παρατηρήθηκε ανοσοθετικότητα του μορίου. Η έκφραση της πρωτεΐνης YKL-40 είχε θετική συσχέτιση με την έκφραση της a-SMA στα διάμεσα κύτταρα της βαλβίδας γεγονός που πιθανολογεί το ενδεχόμενο η πρωτεϊνη YKL-40 να προκαλεί ενεργοποίηση των διάμεσων βαλβιδικών κυττάρων με αποτέλεσμα την παραγωγή πρωτεϊνών εξωκυτταρίου ουσίας με τελική κατάληξη τη δημιουργία βλεννώδους εκφύλισης και ίνωσης . Επιπροσθέτως θα μπορούσαμε να υποθέσουμε λογω της θετικής συσχέτισης της έκφρασης της πρωτεΐνης YKL-40 με την έκφραση του VEGFA από τα βαλβιδικα κύτταρα και τα μακροφαγα ότι η πρωτεΐνη YKL-40 πιθανόν να επάγει την έκφραση του VEGFA από τα κύτταρα αυτά. Επιπρόσθετα, όπως η υπάρχουσα βιβλιογραφία υποστηρίζει, τόσο ξεχωριστά όσο και συνεργικά ο VEGFA και η YKL-40 είναι δυνατον να προκαλούν ενεργοποίηση, χημειοταξία και μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων εντός της γλωχίνας και σχηματισμό νέων αγγείων. Τα νέα αυτά αγγεία θα μπορούσαν να λειτουργήσουν θετικά ως προς την φλεγμονώδη διαδικασία προσκομίζοντας στις ήδη παχυσμένες βαλβίδες θρεπτικά συστατικά καθώς και μόρια και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Η παρουσία των μακροφάγων στις παθολογικές βαλβίδες φαίνεται να παίζει κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη των φλεγμονωδών αλλοιώσεων. Η στατιστικά σημαντική σχέση των μακροφάγων με την πρωτεΐνη YKL-40, σε συνδυασμό με την υπάρχουσα βιβλιογραφία που υποστηρίζει τόσο την έκκριση της πρωτεΐνης από τα μακροφάγα, όσο και την επίδραση της σε αυτά, μας επιτρέπει να υποθέσουμε και ένα παρόμοιο μηχανισμό στη νόσο της μιτροειδούς βαλβίδας. Αν και τα αποτελεσματα της παρουσας μελέτης είναι ενδεικτικά πιθανης συμμετοχής της YKL-40 στην νόσο της μιτροειδούς βαλβίδας χρειάζονται πολύ περισσοτερες μελέτες για να αποσαφηνισθεί ο ακριβής ρόλος της πρωτεΐνης YKL-40 στη παθογενεια της συγκεκριμένης νόσου / The protein YKL-40 is a secreted protein, a member of the family of chitinase-like glycoprotein. The protein YKL-40 contains well conserved regions that bind chitin, but lacks the enzymatic chitinase activity, because of a point mutation in the catalytic region. From the existing scientific literature it seems to be involved in the immigration and macrophage activation process in the site of inflammation. It is also possible to participate in the process of neoangiogenesis and fibrosis. Scientists argue that the protein YKL-40 participates in many diseases which are characterized by development of inflammation and has been proposed to use the protein YKL-40 as an indicator of prognosis, recurrence and treatment response in serum of patients with inflammatory diseases and malignancies. In this study, as the disease of the mitral valve is characterized by development of inflammation and because of existing studies that suggest that the protein YKL-40 induces the expression of VEGF-A protein and also has angiogenetic activity itself, we wanted to investigate the possible positive immunohistochemical staining of protein YKL-40 comparing physiological and pathological histological sections of mitral valve. A total sample of 71 cases was used. The 19 of them were normal and the 52 had lesions. The material was fixed tissue samples in 10% neutral formalin and embedded in paraffin. The 36 came from autopsy material and the remaining 35 of mitral valve replacement surgery. The kind of methodology that was followed was the indirect immunohistochemical method of streptavidin-DAB. The antibodies used were against the protein YKL-40, VEGF-A, CD31 (vascular endothelium), CD68 (macrophages) and A-SMA (activated valve interstitial cells). The statistical analysis was performed using the statistical package SPSS 10.0 for Windows. The study gave the following results: The protein YKL-40 is overexpressed in the pathological valves and its levels was related to the severity of the lesions. Cytoplasmic immunopositivity was present in macrophages, endothelial cells of the outer layers of the valves and the valves’ vessels and valve interstitial cells. Only 2 of the 19 normal valves had positive immunohistochemical stain of the protein YKL-40. Sufficient number of CD68 -positive macrophage was observed in the valves which presented histopathological lesions. The number of macrophages was significantly correlated with the severity of lesions. It was demonstrated the presence of vessels in pathological valves by immunohistochemical staining against the protein CD31. The average microvessel density was correlated with the severity of histological lesions. Pathological valves observed strong immunohistochemical expression of the protein A-SMA in the cells of the matrix. The expression of protein A-SMA was correlated significantly with the severity of lesions. The VEGF-A protein was overexpressed in pathological valves and was related to the severity of histopathological lesions. The cells which had positive immunostaining for the VEGF-A protein were macrophages, endothelial cells of valve blood vessels and valve interstitial cells. Immunohistochemical staining of the protein YKL-40 in the mitral valve was statistically significant compared to the immunohistochemical expression of the protein A-SMA, the protein VEGF-A, with the presence of macrophages and average microvessel density. The expression levels of the protein YKL-40 was higher in women with mitral valve disease and significantly associated with age. According to the previous comments, we propose the possible role of the protein YKL-40 in the pathogenesis of mitral valve disease. The protein YKL-40 seems to be expressed from multiple cellular types in pathological valves. As a different, the normal valves had non immunopositivity of the molecule. The YKL-40 protein was immunohistochemical localization in cells with morphological characteristics similar to those that were stained positive for a-SMA. Therefore, there is possibility that the presence of the protein YKL-40 in the valve interstitial cells is associated with increased cellularity of diseased valves, via the possible increase of the proliferation and activation of valve interstitial cells. As a result, the produce of ECM proteins causes mucous degeneration and fibrosis. Additionally we will assume that the protein YKL-40 is likely to induce the expression of VEGF-A from valve interstitial cells and/or macrophages during the pathogenesis of mitral valve disease. As the present bibliography consider, both separately and synergistically the protein YKL-40 is able to cause activation, chemo taxis and migration of endothelial cells within the cusp and neovascularization. These new vessels could operate positively to the inflammatory process by providing the thickened valves nutrients and molecules and cells of the immune system. The presence of macrophages at the valve lesions seems to play a major role at the inflammation procedure. Both of the statistically significant colleration between macrophages and protein YKL_40 and the current bibliography that suggests the expression of the protein YKL-40 from macrophages and the effect of the protein on them, make us to hypothesize that there is a similar mechanism at the mitral valve disease to. More research is required in order to make clear the exact role of protein YKL-40 in the mitral valve disease.

Η ανάπτυξη πρωτεϊνικών κρυστάλλων, κατάλληλων για κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ, είναι γνωστό ότι είναι το βασικό στοιχείο του προσδιορισμού της πρωτεϊνικής δομής. Οι κρυσταλλογράφοι αντιμετωπίζουν σε καθημερινή βάση προβλήματα όπως η ποσότητα της πρωτεΐνης, η διαθεσιμότητα της υψηλής ποιότητας κρυστάλλων πρωτεΐνης και ο έλεγχος του μεγέθους του κρυστάλλου. Πολλές προσπάθειες έχουν γίνει για να βελτιωθεί η διαδικασία κρυστάλλωσης με τη χρήση των μαγνητικών πεδίων, της ηλεκτρό-εστίασης, και των εσωτερικών ή εξωτερικών ηλεκτρικών πεδίων. Τα ηλεκτρικά πεδία αποτελούν μια σημαντική μεθοδολογική πρόοδο και έχουν χρησιμοποιηθεί προκειμένου να ενισχυθεί η δημιουργία και ανάπτυξη πυρήνων κρυστάλλωσης. Σε αυτή την εργασία διερευνήθηκε η επίδραση της ασύρματης μεταγωγής ρεύματος κατά την κρυστάλλωση της λυσοζύμης, της ριβονουκλεάσης Α και της ινσουλίνης χρησιμοποιώντας μια πρωτότυπη συσκευή παραγωγής ιόντων. Η μέθοδος διάχυσης ατμών χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις πειραματικές διατάξεις. Η ποιότητα των κρυστάλλων και η τρισδιάστατη δομή των πρωτεϊνών που καλλιεργήθηκαν με και χωρίς την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου αναλύθηκαν μέσω της περίθλασης ακτίνων-Χ. Οι κρύσταλλοι εμφανίστηκαν νωρίτερα στα δείγματα που εκτέθηκαν στο ηλεκτρικό πεδίο σε σχέση με τα μη εκτεθειμένα δείγματα κάτω από ταυτόσημες συνθήκες. Επιπλέον, οι κρύσταλλοι πρωτεΐνης που ελήφθησαν σε μικρότερους χρόνους ήταν μεγαλύτεροι σε μέγεθος. Αρκετά ενδιαφέρον ήταν ότι η ποιότητα των κρυστάλλων που αναπτύχθηκαν στις εκτεθειμένες σταγόνες ήταν η ίδια, αν όχι καλύτερη από, εκείνη των κρυστάλλων που αναπτύχθηκαν στις μη εκτεθειμένες σταγόνες σε κάποιο ηλεκτρικό πεδίο. Η διαδικασία πυρήνωσης φαίνεται να διαφέρει μετά από την έκθεση σε κάποιο ηλεκτρικό πεδίο από ότι η μη έκθεση σε αυτό υπό ταυτόσημες συνθήκες. Η χρήση της πρωτότυπης συσκευής ασύρματης μεταγωγής ρεύματος φαίνεται να επάγει τον προσανατολισμό των πολικών μορίων της πρωτεΐνης, ευνοώντας έτσι την κρυστάλλωση. Η χρήση της συσκευής προσφέρει το πλεονέκτημα ότι παρέχει φορτισμένα σωματίδια πάνω σε ολόκληρη την εκτεθειμένη επιφάνεια του διαλύματος κρυστάλλωσης, ενώ ταυτόχρονα ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο μόλυνσης. Επίσης, η συσκευή αυτή είναι πολύ απλούστερη και ευκολότερη στη χρήση από ό,τι άλλες συσκευές με κλασικά ηλεκτρόδια. / The growth of protein crystals, suitable for X-ray crystallography is known to be the basic element of the protein structure determination. Crystallographers face problems such as the amount of the protein, the availability of high-quality protein crystals and the control of the crystal size in a daily basis. Many efforts have been made to improve crystallization process with the use of magnetic fields, electro–focusing, and internal or external electric fields. The electric fields consist a significant methodological advancement and have been used in order to enhance nucleation and crystal growth. In this work, the influence of a non-contact current transfer upon the crystallization of Lysozyme, Rnase A and Insulin was investigated using a prototype ion-generator device. The vapor diffusion method was used in both hanging and sitting drop setups. The crystal quality and the three-dimensional structure of lysozyme grown with and without the EF influence were analyzed by means of X-ray diffraction. Crystals appeared earlier in samples exposed to NCCT than in non-exposed samples under identical conditions. Furthermore, protein crystals that were obtained after shorter times were larger in size when grown after exposure to NCCT device. More interestingly, the quality of the crystals grown in NCCT-exposed drops was the same as, if not better than, that of the crystals grown in the control drops. The nucleation process after exposure to NCCT differs from that after exposure to an ion-free gas stream under identical conditions. The use of the NCCT prototype device appears to induce the orientation of the polar protein molecules, thereby favoring crystallization. The use of NCCT offers the advantage of delivering charged particles onto the entire exposed surface of the crystallization solution, while at the same time minimizes the risk of contamination. Also, the use of this device is much simpler and easier to use than other devices with classic electrodes.

Οι Heat Shock Proteins (Hsps) αποτελούν πολλές διαφορετικές οικογένειες που επάγονται προς απάντηση μιας ευρείας σειράς φυσιολογικών και περιβαλλοντικών ερεθισμάτων. Μια τέτοια πρωτεΐνη, η οποία επάγεται ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια της απάντησης σε stress, είναι η Hsp27, με ΜΒ:27kDa, της οποίας η έκφραση φαίνεται να σχετίζεται με αυξημένη επιβίωση των κυττάρων όταν επιδρούν σε αυτά κυτταροτοξικά ερεθίσματα. Έχει φανεί ότι εμποδίζει τον κυτταρικό θάνατο μέσω αλληλεπίδρασης με ποικιλία παραγόντων που προκαλούν απόπτωση. Η Hsp27 είναι μια μοριακή πρωτεΐνη chaperone με ικανότητα να αλληλεπιδρά με μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών. Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι η Hsp27 ρυθμίζει την απόπτωση, χάρη στην ικανότητα που έχει να διαντιδρά με μόρια ¨κλειδιά¨ στο μονοπάτι μεταβίβασης σημάτων της απόπτωσης και ιδιαίτερα, με εκείνα που ενέχονται στην ενεργοποίηση των κασπασών. Οι άλλοι δυο ρόλοι της Hsp27 κατά τη διάρκεια του stress που αποσκοπούν στην κυτταροπροστασία, είναι αφενός να αλληλεπιδρά και να σταθεροποιεί τον κυτταροσκελετό, αφετέρου να ρυθμίζει το ενδοκυττάριο επίπεδο των τοξικών ριζών οξυγόνου. Όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε stress τα επίπεδα της Hsp27 είναι γενικώς χαμηλά και αυτή υπάρχει κυρίως με τη μορφή μεγάλων ολιγομερών. Κατά τη διάρκεια της απάντησης στο stress έχουμε αύξηση στα επίπεδα έκφρασης της Hsp27, που συνδυάζεται με μια αναδιοργάνωσή της λόγω φωσφορυλίωσης. Η φωσφορυλίωση μπορεί να συμβεί σε τρεις διαφορετικές θέσεις που εντοπίζονται σερίνες (Ser15, Ser78, Ser82). Η φωσφορυλίωση της Hsp27 καταλήγει σε ανακατανομή των μεγάλων ολιγομερών σε μικρότερα σύμπλοκα. ΣΚΟΠΟΣ: Αντικείμενο της μελέτης μας είναι ακριβώς η έκφραση των φωσφορυλιωμένων μορφών της Hsp27 με μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος φυσιολογικών ενηλίκων και οι διαφορές που εμφανίζονται όταν τα κύτταρα βρίσκονται in vitro σε βασικές συνθήκες, σε συνθήκες επίδρασης θερμικού stress και σε συνθήκες επίδρασης του παράγοντα TNF-a. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Εφαρμόστηκε η τεχνική της SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης και επακόλουθα της WESTERN BLOTTING για την ανίχνευση των πρωτεϊνών. Τα πρώτα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα της κυτταρικής σειράς λευχαιμικών κυττάρων U937 με και χωρίς τη χορήγηση Doxorubicin.Τα επόμενα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε εκχύλισμα πρωτεϊνών μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος προελεύσεως από ένα τυχαίο δείγμα 6 ενηλίκων ανδρών-γυναικών ηλικίας από 20-30 ετών. Τα τελευταία πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος, το οποίο προερχόταν από ένα τυχαίο δείγμα 7 φυσιολογικών ανδρών-γυναικών ηλικίας 20-30 ετών. Τα κύτταρα αυτά είχαν χωριστεί σε τρεις υποπληθυσμούς ανάλογα με τις συνθήκες που είχαν υποβληθεί: βασικές συνθήκες, συνθήκες επίδρασης θερμικού stress και συνθήκες επίδρασης TNF-a. Ο αρχικός διαχωρισμός των μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος έγινε με Ficoll. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Τα πρώτα πειράματα έγιναν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων της σειράς U937 τα οποία είχαν δεχθεί την επίδραση TNF-a. Η Western Blotting ανάλυση ανέδειξε την παρουσία φωσφορυλιωμένης Hsp27 για τη θέση Ser78,αλλά όχι για τις θέσεις Ser15 και Ser 82. Όταν όμως η ίδια μελέτη πραγματοποιήθηκε σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα της ίδιας σειράς που είχαν δεχθεί την επίδραση Doxorubicin αναδείχθηκε η παρουσία φωσφορυλιωμένης Hsp27 για τις θέσεις Ser15 και Ser82. Τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα μονοπύρηνων κυττάρων υγιών ενηλίκων, τα οποία δεν είχαν υποστεί απολύτως καμμία επίδραση, ανέδειξαν την παρουσία και των τριών μορφών φωσφορυλιωμένης Hsp27 καθώς και της ολικής μη φωσφορυλιωμένης μορφής σε όλα τα δείγματα. Στα τελευταία πειράματα που έγιναν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος -που είχαν διαιρεθεί σε τρεις πληθυσμούς ανάλογα με τις συνθήκες που είχαν επιδράσει- ανέδειξαν τα εξής: Η φωσφορυλιωμένη μορφή της Hsp27 για τη θέση Ser78 και τη θέση Ser82 επαγόταν και στους τρεις υποπληθυσμούς κυττάρων, δηλαδή όταν αυτά βρισκόντουσαν υπό βασικές συνθήκες, υπό συνθήκες θερμικού shock και υπό συνθήκες επίδρασης TNF-a. Όσον αφορά τη φωσφορυλιωμένη μορφή της Hsp27 για τη θέση Ser15 διαπιστώθηκε ότι επαγόταν περισσότερο η έκφρασή της σε συνθήκες επίδρασης TNF-a και θερμικού shock από ότι στις βασικές συνθήκες. Η ολική Hsp27, η μη φωσφορυλιωμένη, δεν αναδείχθηκε σε κανέναν από τους τρεις υποπληθυσμούς κυττάρων, σε όσα πειράματα πραγματοποιήθηκαν. ΣΥΖΗΤΗΣΗ: Από τα αποτελέσματα των πρώτων πειραμάτων στα κύτταρα της σειράς U937 προέκυψε η βάσιμη υποψία ότι η επίδραση κάποιου στρεσσογόνου παράγοντα είχε διαφορετική επίδραση στην Hsp27,ανάλογα με το ποιος ήταν αυτός και για πόσο διάστημα επιδρούσε. Επομένως σε διάφορες συνθήκες ανευρίσκονται διαφορετικοί συνδυασμοί της Hsp27, γιατί ακριβώς εξυπηρετούν τις απαιτούμενες διαφορετικές, ενδεχομένως, λειτουργίες αντίστοιχα. Η παρουσία όλων των μορφών της Hsp27 στα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος υγιών ενηλίκων όταν αυτά δεν είχαν υποστεί καμμία εξωγενή επίδραση, οδήγησε στο συμπέρασμα ότι ενδεχομένως όλες αυτές οι μορφές της πρωτεΐνης να βρίσκονται σε μια δυναμική κατάσταση εναλλαγής στα κύτταρα ανάλογα με τις ενδογενείς επιδράσεις που δέχονται ανά πάσα στιγμή. Τέλος ,η παρουσία των φωσφορυλιωμένων μορφών της Hsp27 μόνο για τις θέσεις Ser78 και Ser82 σε βασικές συνθήκες αποτελεί σημαντική ένδειξη ότι σε αυτήν την περίπτωση επάγονται περισσότερο τα μεγάλα ολιγομερή της πρωτεΐνης. Αντίθετα, σε συνθήκες επίδρασης θερμικού shock και TNF-a, επάγονται και τα μικρότερα σύμπλοκα της Hsp27, αφού ανευρίσκεται επιπλέον και η φωσφορυλιωμένη μορφή της και για τη θέση Ser15. / -

Στην παρούσα μελέτη εξετάζεται η έκφραση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου p27kip1, p34cdc2 και p53 σε πορογενές διηθητικό καρκίνωμα του μαστού και αρνητικούς λεμφαδένες, διερευνάται πιθανή συσχέτιση μεταξύ τους ή μεταξύ των πρωτεϊνών αυτών και των κλασσικών κλινικοπαθολογικών παραμέτρων και εκτιμάται η προγνωστική τους αξία στο νεόπλασμα αυτό. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση εφαρμόσθηκε σε 94 παρασκευάσματα καρκίνου του μαστού μονιμοποιημένα σε διάλυμα φορμόλης 10% και εγκλεισμένα σε παραφίνη με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων για τις πρωτεΐνες p27kip1, p34cdc2 και p53. Παρακείμενος καλοήθης επιθηλιακός μαζικός ιστός ήταν διαθέσιμος για εξέταση σε 82 περιπτώσεις για την p27kip1 και την p53 και σε 74 για την p34cdc2. Το διάμεσο διάστημα παρακολούθησης των ασθενών ήταν 72 μήνες. Θετικότητα για την p27kip1 στο νεοπλασματικό και στον καλοήθη ιστό διαπιστώθηκε σε 61 (65%) και 75 (91%) περιπτώσεις αντίστοιχα. Τα καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά για την p34cdc2 σε 80 (85%) περιπτώσεις ενώ το παρακείμενο καλόηθες επιθήλιο σε 12 (16%). Θετικότητα για την p53 στον όγκο παρατηρήθηκε σε 21 (23%) περιπτώσεις. Θετική συσχέτιση διαπιστώθηκε μεταξύ της έκφρασης της p27kip1 στον όγκο και της κατάστασης των οιστρογονικών και προγεστερονικών υποδοχέων. Θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ της p27kip1 και ηλικίας των ασθενών μεγαλύτερης των 50 ετών ενώ η απώλεια της έκφρασης της p27kip1 συνδυάσθηκε με χαμηλό βαθμό διαφοροποίησης και μεγαλύτερο μέγεθος όγκου. Τέλος, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση της ανοσοδραστικότητας της p27kip1 με το ελεύθερο από υποτροπή της νόσου διάστημα ή τη συνολική επιβίωση. Υψηλά επίπεδα της p34cdc2 στους πυρήνες των νεοπλασματικών κυττάρων συσχετίσθηκαν με χαμηλότερο βαθμό διαφοροποίησης και με την έκφραση της p53 αλλά όχι με το ελεύθερο από υποτροπή της νόσου διάστημα ή τη συνολική επιβίωση. Η κυτταροπλασματική έκφραση της p34cdc2 στον όγκο συσχετίσθηκε με χαμηλό βαθμό διαφοροποίησης και με το ελεύθερο από υποτροπή της νόσου διάστημα. Η έκφραση της p34cdc2 στο φυσιολογικό μαζικό αδένα αποτελούσε ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για την έκβαση των ασθενών. Η έκφραση της p53 συνδυάσθηκε με χαμηλό βαθμό διαφοροποίησης και αρνητικούς ορμονικούς υποδοχείς, αλλά δεν συσχετίσθηκε με το ελεύθερο από υποτροπή της νόσου διάστημα ή τη συνολική επιβίωση. Με βάση τα ευρήματα αυτά, διαταραχές στην έκφραση των πρωτεϊνών p27kip1, p34cdc2 και p53 οδηγούν σε απορρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και πιθανά συμβάλλουν με τον τρόπο αυτό στην καρκινογένεση στο μαστό. Η έκφραση της p27kip1, της p34cdc2 και της p53 στον καρκίνο του μαστού με αρνητικούς λεμφαδένες δεν αποτελεί προγνωστικό παράγοντα της έκβασης της νόσου, ενώ υπάρχει μία συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας της p34cdc2 στον καλοήθη ιστό και της πρόγνωσης. Η συσχέτιση της p34cdc2 με την p53 εισηγείται τη συμμετοχή της p53 στον έλεγχο της μετάβασης από τη φάση G2 στη φάση Μ του κυτταρικού κύκλου. / This study investigates the expression of the cell cycle regulatory proteins p27kip1, p34cdc2 and p53 in node-negative invasive ductal breast carcinoma, investigates for potential correlation between them, or between these proteins and the classical clinicopathological parameters, and assesses their prognostic value in this neoplasm. Immunohistochemistry was applied on formalin-fixed (10%), paraffinembedded tissue sections from 94 breast carcinoma specimens using monoclonal antibodies for the p27kip1, p34cdc2 and p53 proteins. Adjacent benign epithelial breast tissue was available for examination in 82 cases for p27kip1 and p53 and 74 cases for p34cdc2. The median follow-up period was 72 months. p27kip1 positivity in the neoplastic and benign tissue was found in 61 (65%) and 75 (91%) cases respectively. Tumor cells were positive for p34cdc2 in 80 (85%) cases while the adjacent benign epithelium in 12 (15%) cases. Tumor p53 positivity was observed in 21 (23%) cases. A positive correlation was found between p27kip1 expression in tumor and estrogen and progesterone receptor status. There was also a significant positive association between p27kip1 and patients age 50 years or higher while low expression of p27kip1 was correlated with high tumor grade and greater tumor size. There was no correlation between p27kip1 immunoreactivity and disease free survival (DFS) or overall survival (OS). High levels of nuclear p34cdc2 in the neoplastic tissue were associated with higher histological grade and p53 expression but were not correlated with DFS or OS. Cytoplasmic p34cdc2 expression in tumor was associated with high tumor grade and DFS. p34cdc2 expression by the normal breast tissue independently predicted patient outcome. Expression of p53 was associated with high tumor grade and negative steroid receptors, but was not correlated with DFS or OS. Based on these findings, alterations of the proteins p27kip1, p34cdc2 and p53 are involved in cell cycle deregulation and probably contribute in breast tumorigenesis. Expression of p27kip1, p34cdc2 and p53 in nodenegative breast carcinoma does not predict disease outcome, while there is an association between the presence of p34cdc2 in normal breast tissue and prognosis. The relationship of p34cdc2 and p53 indicates an implication of p53 in the G2-M cell cycle checkpoint control.

Η ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης είναι εξέχουσας σημασίας κατά την ανάπτυξη των πολυκύτταρων οργανισμών. Κεντρικοί ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου έχει δειχθεί να συμμετέχουν και σε διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης, όπως η οικογένεια των E2F μεταγραφικών παραγόντων, το pRb και οι αναστολείς των κυκλινοεξατώμενων κινασών (CKIs). H Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και στην ανάπτυξη, η οποία έχει προταθεί σαν ένας πιθανός ρυθμιστής αυτών των διαδικασιών. H Geminin εμφανίζει διαφορετικές δράσεις, αλληλεπιδρώντας με ένα σημαντικό αριθμό κυτταρικών παραγόντων. Σε αυτές τις αλληλεπιδράσεις σημαντικό ρόλο παίζει η περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin. Πρόσφατα, μέσω βιοπληροφορικών αναλύσεων βρέθηκε ένας γενετικός τόπος στο ανθρώπινο γονιδίωμα ο οποίος κωδικοποιεί για μία πρωτεϊνική αλληλουχία με σημαντική ομολογία με το σπειροειδές σπείραμα της Geminin. H πρωτεΐνη αυτή ονομάστηκε Castor. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν εργαλεία βιοπληροφορικής, για την ανάλυση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας του Castor και τη σύγκριση αυτής με την Geminin. Στη συνέχεια, μελετήθηκε με την μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Castor με τη Geminin και ο ομοδιμερισμός του Castor και χαρτογραφήθηκαν οι περιοχές που ευθύνονται για τις αλληλεπιδράσεις αυτές.. Ο Castor σχηματίζει σύμπλοκο με την Geminin και η αλληλεπίδραση αυτή απαιτεί το σπειροειδές σπείραμα της Geminin και τα 254 καρβοξυτελικά αμινοξέα του Castor, στα οποία περιέχεται το σπειροειδές σπείραμα του. Τα τελευταία 254 αμινοξέα είναι υπεύθυνα και για τον ομοδιμερισμό του μορίου. Σύγκριση της ισχύος αλληλεπιδράσεων έδειξε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ Castor και Geminin είναι ισχυρότερη από τον ομοδιμερισμό του Castor, αφού η Geminin δύναται να ανταγωνιστεί την πρόσδεση του Castor στον εαυτό του. Τέλος, αναπτύχθηκαν μοριακά εργαλεία απαραίτητα για τη μελέτη του Castor. To πρώτο αφορά την παραγωγή και καθαρισμό πολυκλωνικού αντισώματος κατά αμινοτελικού τμήματος της Castor πρωτεΐνης. Η ειδικότητα του αντισώματος ελέγχθηκε με ανοσοτύπωση Western. To αντίσωμα είναι λειτουργικό αφού αναγνωρίζει την εξωγενή πρωτεΐνη CastorGFP ενώ δεν μπορούν να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα για την ενδογενή ανθρώπινη πρωτεΐνη. Το δεύτερο αφορά την 7 ανάπτυξη της μεθοδολογίας RNAi για την αποσιώπηση του γονιδίου του Castor σε κυτταρικές σειρές. Η λειτουργικότητα του RNAi ελέγχθηκε τόσο σε ανοσοτύπωση Western όσο και σε ανοσοφθορισμό σε σταθερά διαμολυσμένη με CastorGFP κυτταρική σειρά και είναι λειτουργικό. Τα παραπάνω εργαλεία είναι απαραίτητα για μελλοντικές λειτουργικές μελέτες του Castor. / Τhe coordination of cellular proliferation and differentiation is of critical importance for the development of multicellular organisms. Cell cycle regulators have been shown to participate in the regulation of these two processes, such as E2F transcriptional factors family, pRb and Cdk inhibitors (CKIs). Geminin is a bifunctional protein participating in cell cycle regulation and in developmental processes and has been proposed as a candidate for the regulation of these two processes. Geminin balanced interactions with various binding partners are central to its different function. In these interactions the coiled coil of Geminin plays an important role not only as a binding interface but also maintaining the structural integrity of the molecule. Recently in silico analysis has revealed a new genetic locus in the human genome that codes for a protein with significant homology to the Geminin coiled coil region. This protein is named Castor. In this study, in silico analysis was performed to examine the expression of the molecule by analyzing the available ESTs, sequence analysis of Castor protein and comparison to Geminin structural and functional motifs. . We also studied the molecular interaction between Geminin and Castor and Castror homodimerization. We show that Geminin formes a complex with Castor.The coiled coil of Geminin is required for the interaction. Castor interacts with Geminin through its 254 C-terminal amino acids which include its coiled coil. The 254 C-terminal amino acids are also responsible for the self-association of the molecule. We further wanted to established which interaction, the heterodimerazition with Geminin or Castor homodimerazition is stronger. Geminin interacts stronger with Castor, than Castor with itself since overexpressing Geminin and Castor together results in full binding of Castor to Geminin Finally we developed molecular tools required for the functional study of the molecule. Firstly, a specific polyclonal antibody against the N terimus of Castor was 8 produced and then affinity purified. The specificity of the antibody was tested by Western blotting analysis. The antibody recognizes the transfected CastorGFP protein, but no safe conclusion can be drawn for the endogenous protein. Secondly, silencing Castor by RNAi technique for silencing Castor gene in cell lines was set up. The effect of the RNAi was tested by Western blotting and immunofluorescence in CastorGFP stable cell lines. These tools will be required in future studies for investigating the function of Castor.

- / -

- / -

- / -