Το οξειδωτικό στρες είναι μια κατάσταση στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα όταν σε αυτά οι αντιοξειδωτική άμυνα υπερκεράζεται έναντι των οξειδωτικών εκθέσεων των κυττάρων και χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση ελευθέρων ριζών οι οποίες στη συνέχεια προκαλούν καταστροφές στα βιομόρια του κυττάρου (λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες). Το οξειδωτικό στρες φαίνεται να εμπλέκεται στους μηχανισμούς τόσο φυσιολογικών (διαφοροποίηση, γήρανση), όσο και παθολογικών καταστάσεων (νευροεκφυλιστικές παθήσεις). Σε περίπτωση έντονου οξειδωτικού στρες εξαιτίας φυσιολογικών ή παθολογικών ερεθισμάτων στα κύτταρα επέρχονται βλάβες σε μόρια, όπως οι πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου η ακριβής ποσοτικοποίηση της πρωτεϊνικής υπεροξείδωσης με μεθόδους που εξειδικευμένα ποσοτικοποιούν συγκεκριμένες αλλαγές, όπως τη δημιουργία των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων, είναι χρήσιμες για την εκτίμηση της έκτασης της βλάβης. Οι καρβονυλομάδες δημιουργούνται σε συγκεκριμένα αμινοξέα των πρωτεϊνών (λυσίνη, αργινίνη, προλίνη και θρεονίνη [1]), ύστερα από έκθεση των κυττάρων/οργανισμών σε συνθήκες υψηλού οξειδωτικού στρες. Για την ποσοτικοποίησή τους, η κλασική φωτομετρική μέθοδος, που στηρίζεται στην αντίδραση των καρβονυλομάδων με το αντιδραστήριο 2,4,-dinitrophenylhydrazine (DNPH) παρουσιάζει αρκετά μειονεκτήματα. Τα βασικότερα είναι: (1) η μη φωτομετρική διάκριση της προκύπτουσας υδραζόνης από το ελεύθερο DNPH, σε συνδυασμό με την απομόνωσή του μέσω πρωτεϊνικής καταβύθισης και αναποτελεσματικού πλυσίματος του πρωτεϊνικού ιζήματος για την απομάκρυνση του μη ειδικά συνδεδεμένου DNPH στην πρωτεΐνη, και (2) η υδρόλυση του δεσμού της υδραζόνης σε όξινο pH. Ως εκ τούτου, η κλασική μέθοδος του DNPH παρουσιάζει προβλήματα επαναληψιμότητας και ακρίβειας. H παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή στοχεύει στην ανάπτυξη μιας νέας ευαίσθητης και απλής μεθοδολογίας με βάση το αντιδραστήριο DNPH για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων σε δείγματα ιστών, η οποία θα αντιμετωπίζει τα προαναφερθέντα μειονεκτήματα της κλασικής φωτομετρικής μεθόδου. Τα αποτελέσματα της διατριβής έχουν ευρεία βιολογική σημασία εξαιτίας του ότι η νέα μέθοδος (αλκαλική DNPH μέθοδος) μπορεί να εφαρμοστεί σε ένα μεγάλο εύρος βιολογικών δειγμάτων, κάνοντας τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες έναν αξιόπιστο δείκτη του οξειδωτικού στρες. / Oxidative stress is a condition where the cells are characterized by low antioxidant defense, which leads to the generation of oxygen/nitrogen free radicals that damage the central molecules of the cell (lipids, nucleic acids, proteins). Oxidative stress is involved in both physiological (e.g. differentiation, aging) and pathological conditions (e.g. neurodegenerative diseases). In case of severe oxidative stress due to physiological or pathological parameters in the cells, proteins and other macromolecules are damaged. Therefore, the accurate quantification of protein peroxidation with assays for specific oxidative modifications such as protein carbonyls is very important for the evaluation of the extent of damage. Carbonyl groups are formed in certain amino acids of proteins (lysine, arginine, proline, and threonine residues [1]), following the exposure of cells/organisms to high oxidative stress conditions. For their quantification, the standard photometric method, based on the reaction of carbonyl groups with the reagent 2,4,-dinitrophenylhydrazine (DNPH) presents several disadvantages. The main disadvantages are: (1) the non-photometric differentiation of the protein-DNPH hydrazone from free DNPH, coupled with its isolation via protein precipitation and ineffective washing of the protein precipitate to remove non-specifically bound DNPH to the protein, and (2) the hydrolysis of the hydrazone bond at acidic pH. Therefore, the standard DNPH assay cannot be used accurately. The present study aims to develop a novel sensitive and simple DNPH-based methodology for the quantification of the protein carbonyls in tissue samples, which overcomes all the aforementioned disadvantages. The findings presented here are very important because the new assay (alkaline DNPH assay) is applicable to a wide spectrum of biological samples, making protein carbonyls a very reliable marker of oxidative stress.

Το οξειδωτικό στρες είναι μια κατάσταση στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα όταν σε αυτά η αντιοξειδωτική άμυνα υπερκεράζεται έναντι των οξειδωτικών εκθέσεων των κυττάρων και χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση ελευθέρων ριζών οι οποίες στη συνέχεια προκαλούν καταστροφές στα βιομόρια του κυττάρου (λιπίδια, νουκλεϊκά οξέα, πρωτεΐνες). Το οξειδωτικό στρες φαίνεται να εμπλέκεται στους μηχανισμούς τόσο φυσιολογικών (διαφοροποίηση, γήρανση), όσο και παθολογικών καταστάσεων (νευροεκφυλιστικές παθήσεις). Σε περίπτωση έντονου οξειδωτικού στρες εξαιτίας φυσιολογικών ή παθολογικών ερεθισμάτων στα κύτταρα επέρχονται βλάβες σε μόρια, όπως οι πρωτεΐνες. Ως εκ τούτου η ακριβής ποσοτικοποίηση της πρωτεϊνικής υπεροξείδωσης με μεθόδους που εξειδικευμένα ποσοτικοποιούν συγκεκριμένες αλλαγές, όπως τη δημιουργία των πρωτεϊνικών καρβονυλομάδων, είναι χρήσιμες για την εκτίμηση της έκτασης της βλάβης. Οι καρβονυλομάδες υπερισχύουν ποσοτικά ως προϊόντα οξείδωσης των πρωτεϊνών και δημιουργούνται σε συγκεκριμένα αμινοξέα των πρωτεϊνών (λυσίνη, αργινίνη, προλίνη και θρεονίνη [1]) ύστερα από έκθεση των κυττάρων/οργανισμών σε συνθήκες υψηλού οξειδωτικού στρες. Για την ποσοτικοποίησή τους, η κλασική φθορισμομετρική μέθοδος, που στηρίζεται στην αντίδραση των καρβονυλομάδων με το αντιδραστήριο fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTC) παρουσιάζει αρκετά μειονεκτήματα. Τα βασικότερα είναι: (1) η μη φθορισμομετρική διάκριση της προκύπτουσας υδραζόνης από το ελεύθερο FTC, σε συνδυασμό με την απομόνωσή του μέσω πρωτεϊνικής καταβύθισης και αναποτελεσματικού πλυσίματος του πρωτεϊνικού ιζήματος για την απομάκρυνση του μη ειδικά συνδεδεμένου FTC στην πρωτεΐνη, και (2) η υδρόλυση του δεσμού της υδραζόνης σε σύντομο χρονικό διάστημα. Ως εκ τούτου, η κλασική φθορισμομετρική μέθοδος του FTC παρουσιάζει προβλήματα επαναληψιμότητας και ακρίβειας. H παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή στοχεύει στην ανάπτυξη μιας νέας ευαίσθητης και απλής φθορισμομετρικής μεθοδολογίας με βάση ένα νέο αντιδραστήριο, το Rhodamine B Hydrazine (RBH) για την ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων σε δείγματα ιστών, η οποία θα αντιμετωπίζει τα προαναφερθέντα μειονεκτήματα της κλασικής φθορισμομετρικής μεθόδου και επιπλέον θα στοχεύει σε μεγαλύτερη ευαισθησία (λιγότερη ποσότητα πρωτεΐνης). Τα αποτελέσματα της διατριβής έχουν ευρεία βιολογική σημασία εξαιτίας του ότι η νέα μέθοδος (φθορισμομετρική RBH μέθοδος) μπορεί να εφαρμοστεί σε ένα μεγάλο εύρος βιολογικών δειγμάτων, κάνοντας τις πρωτεϊνικές καρβονυλομάδες έναν αξιόπιστο δείκτη του οξειδωτικού στρες. / Oxidative stress is a condition where the cells are characterized by low antioxidant defense, which leads to the generation of oxygen/nitrogen free radicals that damage the central molecules of the cell (lipids, nucleic acids, proteins). Oxidative stress is involved in both physiological (e.g. differentiation, aging) and pathological conditions (e.g. neurodegenerative diseases). In case of severe oxidative stress due to physiological or pathological parameters in the cells, proteins and other macromolecules are damaged. Therefore, the accurate quantification of protein peroxidation with assays for specific oxidative modifications such as protein carbonyls is very important for the evaluation of the extent of damage. Carbonyl groups are quantitatively the major type of oxidative modification of proteins, and are formed in certain amino acids of proteins (lysine, arginine, proline, and threonine residues [1]), following the exposure of cells/organisms to high oxidative stress conditions. For their quantification, the standard fluorometric method, based on the reaction of carbonyl groups with the reagent fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTC) presents several disadvantages. The main disadvantages are: (1) the non-fluorometric differentiation of the protein-FTC hydrazone from free FTC, coupled with its isolation via protein precipitation and ineffective washing of the protein precipitate to remove non-specifically bound FTC to the protein, and (2) the hydrolysis of the hydrazone bond at acidic pH. Therefore, the standard FTC assay cannot be used accurately. The present study aims to develop a novel sensitive and simple fluorometric assay based on a novel reagent, Rhodamine B Hydrazine (RBH), for the quantification of protein carbonyls in tissue samples, which overcomes all the aforementioned disadvantages. The findings presented here are very important because the new assay (fluorometric RBH assay) is applicable to a wide spectrum of biological samples, making protein carbonyls a very reliable marker of oxidative stress.

- / -

- / -

Τα TPRs (Tetratricopeptide Repeats) είναι πρωτεϊνικά μοτίβα επαναλήψεων με μήκος πεπτιδικής αλυσίδας 34 αμινοξικών κατάλοιπων. Περισσότερα από 10000 TPRs έχουν εντοπι-στεί έως σήμερα σε διάφορες πρωτεϊνες, από τα αρχαιοβακτήρια έως τον άνθρωπο. Τα TPRs συμμετέχουν σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Δομικά, κάθε TPR παρουσιάζει τη διαμόρφωση έλικα-στροφή-έλικα σε σχήμα φουρκέτας ενώ διαδοχικά πακεταρισμένα TPRs σχηματίζουν στο χώρο δεξιόστροφη υπερέλικα, στην οποία διακρίνονται μία κυρτή και μία κοίλη επιφάνεια. Το σύμπλοκο πρωτεϊνών Ssn6-Tup1 είναι ένας γενικός συγκαταστολέας της μεταγραφής στη ζύμη. Ομόλογα σύμπλοκα έχουν επίσης βρεθεί σε πολλούς οργανισμούς. Η πρωτεϊνη Ssn6 περιέχει δέκα διαδοχικά TPRs. Η αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών πραγματοποιείται μέσω των τριών πρώτων TPRs της Ssn6 και του Ν-τελικού τμήματος (αμινοξικά κατάλοιπα: 1-72) της Tup1. Σε προηγούμενη εργασία της η ερευνητική μας ομάδα έδειξε με πειράματα μεταλλαξιγένεσης και με δομική μοντελοποίηση, ότι η δομική ακεραιότητα του TPR 1 και η σωστή τοποθέτησή του σε σχέση με το TPR 2 είναι κρίσιμες για τη δέσμευση της Tup1. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε για πρώτη φορά η δομική σταθερότητα του τμήμα-τος της πρωτεϊνης Ssn6 που αλληλεπιδρά με την Tup1, και η σημασία που έχει για την αλληλε-πίδραση το Ν-τελικό άκρο της Ssn6, το οποίο περιλαμβάνει μία εκτεταμένη περιοχή πολυγλου-ταμίνης. Για τη μελέτη εφαρμόστηκαν χαρτογράφηση της πρωτεϊνης Ssn6 με περιορισμένη πρωτεόλυση καθώς και βιοχημικός χαρακτηρισμός και φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού σε επιλεγμένα τμήματα των πρωτεϊνών Ssn6 και Tup1 και στα σύμπλοκά τους. Επιπρόσθετα πραγματοποιήθηκαν, in silico, σύγκριση των TPRs της Ssn6 με άλλα γνωστά TPRs, προβλέψεις της δομικής αστάθειας των TPRs και προσομοίωση μοριακής δυναμικής στο δομικό μοντέλο των TPRs 1-3. Ο συνδυασμός των παραπάνω έδειξε πως όταν απουσίαζει η Tup1 τα TPRs 1 και 2 της Ssn6 βρίσκονται μερικώς αδίπλωτα. Ειδικά η έλικα Β του TPR1 φαίνεται ότι είναι ιδιαίτερα ευκίνητη και ότι εκθέτει μία έντονα υδρόφοβη επιφάνεια στο περιβάλλον μέσo του μορίου. Αντίθετα, όταν τα ίδια τμήματα της Ssn6 συμμετέχουν σε σύμπλοκα με την Tup1 παρουσιά-ζουν την αναμενόμενη δευτεροταγή διαμόρφωση δομικού τμήματος TPR. Παράλληλα, υπάρ-χουν ισχυρές ενδείξεις ότι η μετάβαση από την κατάσταση του τυχαίου σπειράματος προς τη διαμόρφωση α-έλικας συνοδεύεται από τη διευθέτηση των α-ελίκων σε δεμάτια. Τέλος, η παρουσία του Ν-τελικού άκρου της Ssn6 εμποδίζει τη συσσωμάτωση του τμήματος που αποτε-λείται από τα TPRs 1-4 όταν απουσιάζει η Tup1. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα της εργασίας προτείνεται ότι η Ssn6 ανήκει στις φυσικές μερικώς αδίπλωτες πρωτεϊνες. Η έλλειψη δομικής διαμόρφωσης και η δομική ευκαμψία στο TPR1 της πρωτεΐνης εξυπηρετεί την αναγνώριση της πρωτεϊνης Tup1. Ο σχηματισμός συμπλόκου με την πρωτεΐνη Tup1 οδηγεί σε δίπλωμα τα TPRs 1 και 2, σε αντιστοιχία με το μοντέλο συζευγμένου διπλώματος και σύνδεσης του προσδέματος που έχει παρατηρηθεί σε άλλες πρωτεϊνες. Ο σχηματισμός του συμπλόκου πραγματοποιείται με υδρόφοβες αλληλεπι-δράσεις μεταξύ των δύο πρωτεϊνών και από την πλευρά της Ssn6 συμμετέχει κατά κύριο λόγο η κυρτή επιφάνεια της TPR-υπερέλικας. Τα δύο τελευταία συμπεράσματα αναδεικνύουν ένα νέο μηχανισμό TPR-αλληλεπιδρά-σεων, ο οποίος δεν είχε αναγνωριστεί έως τώρα στα TPR-πρωτεϊνικά σύμπλοκα. / The tetratrico peptide repeat (TPR) is a 34 amino acid protein motif. Over 10000 TPRs have been identified in several species from archeobacteria to human. TPRs are protein-protein interaction mediators. Each TPR adopts a helix-turn-helix conformation in the form of α hairpin. Tandem TPRs stack together producing a right handed curved superhelix, with a convex and a concave surface. The Ssn6-Tup1 protein complex is a general transcriptional co-repressor in yeast. Homologous complexes have been identified in many organisms. The Ssn6 protein contains 10 tandem TPRs. TPRs 1-3 interact with the N-terminus (aa: 1-72) of Tup1 to form the complex. Using 3D-modeling and mutagenesis data, our group has previously shown that the structural integrity of TPR 1 and its correct positioning relatively to TPR 2 are crucial for Tup1 binding. In the present study we investigate the structural stability of the Tup1-binding domain of Ssn6 and the importance of the Ssn6 N-terminus, which contains a polyglutamine sequence. For the purpose of the study we used limited proteolysis mapping of Ssn6 and biochemical characterization and circular dichroism spectroscopy of specific Ssn6 and Tup1 segments and their complexes, followed by order/disorder predictions and molecular dynamics simulations. Our data suggest that TPRs 1 and 2 of Ssn6 are partially unfolded with the helix B of TPR 1 being highly dynamic, exposing an apolar surface to the solvent. However, TPRs 1-3 seem to adopt the TPR-typically expected secondary structure when the Ssn6 segment is in association with Tup1. In addition there are strong evidence that a conformational change occurs upon complex formation, consisting of acquisition of a-helical structure with simultaneous stabilization of coiled coil configuration. The presence of the Ssn6 N-terminus prevents the aggregation of the TPR 1-4 segment in the absence of Tup1. According to the above we propose that: Ssn6 is a member of the partially unfolded proteins group. The lack of typical conformation and the structural flexibility of TPR 1 serve the Tup1 recognition and binding. Complex formation followed by TPR 1 and 2 folding is consistent with the coupled folding to binding mechanism, reported on other binding proteins. The Ssn6-Tup1 complex formation is driven by hydrophobic interactions, in which mainly the convex surface of the TPR-superhelix takes part. The later two points reveal a novel interaction mechanism of the TPR motives.

- / -

Ο ρόλος του χαλκού είναι πολύ σημαντικός για τη σωστή λειτουργία της κυτοχρωμικής c οξειδάσης (CcO), και συνεπώς για την κυτταρική αναπνοή στους ευκαρυωτικούς και προκαρυωτικούς οργανισμούς. Η συγκρότηση της CcO στον ενδομεμβρανικό μιτοχονδριακό χώρο είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, εξαρτώμενη από πλήθος συνεργών πρωτεϊνών, υπεύθυνων για τη λειτουργική αναδίπλωση των υπομονάδων του ενζύμου και τη μεταφορά αίμης και ιόντων Cu σε αυτές. Ενώ οι πρωτεΐνες που ενέχονται στη διαδικασία είναι μάλλον γνωστές, οι μηχανισμοί μεταφοράς και ενσωμάτωσης των μεταλλικών ιόντων στα δυο ενεργά κέντρα της CcO, CuA και CuB, παραμένουν ανεξερεύνητοι. Το CuA κέντρο είναι ένα διπυρηνικό κέντρο χαλκού, του οποίου ο ρόλος εντοπίζεται στη μεταφορά e- από το κυτόχρωμα c στο καταλυτικό κέντρο CuB της CcO. Η σωστή συγκρότηση του CuA κέντρου είναι κρίσιμης σημασίας για την καταλυτική δράση του ενζύμου. Αρκετές πρωτεΐνες έχουν χαρακτηριστεί σαν ενεργοί παράγοντες στη μεταφορά ιόντων Cu στο CuA κέντρο, ο ακριβής, ωστόσο, μοριακός μηχανισμός και ρόλος της κάθε πρωτεΐνης είναι άγνωστος. Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς, δυο οικογένειες πρωτεϊνών έχουν προταθεί για την εμπλοκή τους στη συγκρότηση του CuA. Η πρώτη περιλαμβάνει πρωτεΐνες που δεσμεύουν ιόντα Cu1+ με ένα συντηρημένο μοτίβο δέσμευσης H(M)x10Mx21HxM (υποθετικές πρωτεΐνες Hyp1) ενώ η δεύτερη περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες της οικογένειας Sco, των οποίων ο ρόλος στον μηχανισμό του CuA κέντρου σαν θειορεδοξίνες ή χαλκομεταφορείς, παραμένει ασαφής. Στην παρούσα εργασία αποδείχθηκε ότι μια νέα περιπλασματική πρωτεΐνη (TtHyp1 ή PCuAC) εισάγει επιλεκτικά ιόντα Cu1+ στην Cox2 υπομονάδα της ba3-CcO του Thermus thermophilus προς σχηματισμό του φυσιολογικού διπυρηνικού TtCuA κέντρου, καθώς και ότι η Sco πρωτεΐνη του συγκεκριμένου οργανισμού (TtSco1) δεν μεταφέρει μεταλλικά ιόντα στο CuA, αλλά δρα σαν θειο-δισουλφιδική αναγωγάση ρυθμίζοντας τη σωστή οξειδωτική κατάσταση των κυστεϊνικών καταλοίπων του CuA. Οι πρωτεΐνες PCuAC, TtSco1 και TtCuA εκφράστηκαν, απομονώθηκαν και μελετήθηκαν τα βιοχημικά χαρακτηριστικά τους, η ικανότητα δέσμευσης μεταλλικών ιόντων και οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Επιπλέον η PCuAC χαρακτηρίστηκε δομικά με φασματοσκοπία NMR στην απο και Cu(I) μορφή της. Ο ρόλος των προκαρυωτικών Sco διερευνήθηκε περαιτέρω με μελέτες γονιδιακής ανάλυσης και την έκφραση και τον προκαταρκτικό χαρακτηρισμό μιας νέας πρωτεΐνης, PpSco1/cytc της Pseudomonas putida, πρωτεΐνης αποτελούμενης από δυο επικράτειες, Sco1 και cytc, συνδέοντας το ρόλο των Sco πρωτεϊνών με τη θεωρια περί θειρεδοξινικής τους δράσης. Καινοτομία στην παρούσα εργασία αποτέλεσε η μεθοδολογική προσέγγιση της πολλαπλής κλωνοποίησης των γονιδίων-στόχων με μια νέα τεχνολογία κλωνοποίησης (Gateway) συνδυασμένης με τοποειδική ένθεση σε πολλαπλούς πλασμιδιακούς φορείς και η ανάπτυξη high throughput τεχνικών για πολλαπλές δοκιμές έκφρασης – απομόνωσης. Η συγκεκριμένη μελέτη παρέχει νέα δεδομένα για το μηχανισμό τη συγκρότησης του CuA κέντρου της προκαρυωτικής CcO, υποστηρίζοντας ένα νέο μοντέλο για τη συγκεκριμένη διαδικασία και παράλληλα συνδράμει στην αποκρυπτογράφηση του πολύπλοκου ρόλου των Sco πρωτεϊνών. / Copper is essential for the correct assembly and function of the cytochrome c oxidase (CcO), thus for the efficient cellular respiration in both eukaryotes and prokaryotes. CcO assembly in the inner mitochondrial membrane space is a multi complicated procedure, depended on a number of co-factors and their synergic action. These co-factors are proteins commissioned with the correct folding of the enzyme subunits and the transport/incorporation of heme moieties and Cu ions to them. While the proteins involved in this multistep procedure are rather known, the mechanisms of metal ion delivery and incorporation within the two active centers of CcO, CuA and CuB, still remain uncharted. The CuA center is a binuclear copper center, whose part in the respiratory chain is spoted in electron transport from the active cytochrome c to the catalytic CuB center of CcO. Efficient CuA assembly is crucial for the catalytic action of the entire enzyme. Several proteins have been characterized as essential factors for the transport of Cu ions to the CuA center; however their exact molecular mechanism of action still remains obscure. In prokaryotes, two protein families have been suggested to be involved in the CuA assembly. The first includes proteins that bind Cu1+ ions through a potential conserved motif H(M)x10Mx21HxM (hypothetical proteins, Hyp1), while the second includes proteins of the Sco family, whose exact role in CuA assembly as thioredoxins or copper chaperones is widely debated. In this work, it is propesed that a new periplasmic protein (TtHyp1 or PCuAC) selectively inserts Cu1+ ions in the Cox2 subunit of the ba3-CcO of Thermus thermophilus resulting the formation of the physiological binuclear TtCuA center, as well as that the Sco protein of the organism (TtSco1) is not able to transfer metal ions to the CuA center; instead it acts rather like a thio-disulfide reductase adjusting the proper redox state of the CuA cysteine residues. Proteins PCuAC, TtSco1 and TtCuA were over-expressed, purified and subjected to biochemical characterization, while their Cu binding capability and their inter se interactions were studied through NMR and UV spectroscopy. In addition, PCuAC was structurally characterized through NMR in its apo and Cu(I) form. The role of Sco proteins was further investigated through genome based analysis and the expression and biochemical characterization of a new protein, PpSco1/cytc from Pseudomonas putida, a unique bacterial protein consisted on two domains, a Sco1 and a cytc domain, presumptively connecting the role of Sco proteins with the suggested theory of thioredoxin action. A novelty in this work was the methodological aspect of the multiple cloning of the target genes with a new cloning technology (Gateway) combined with site specific recombination into multiple expression plasmid vectors and the development of a high throughput technique for parallel expression/purification tests. The infra work provides new insights to the CuA center assembly molecular mechanism of the prokaryotic CcO, supporting a new model for the particular procedure and also subscripts for the decipherment of the complicated role of Sco proteins.

Με στόχο την απομόνωση του γονιδίου hsp83 της μεσογειακής μύγας, πραγματοποιήθηκε διαλογή μιας cDNA βιβλιοθήκης από προνύμφες 3ου σταδίου, με ανιχνευτή το δεύτερο εξώνιο του hsp83 ομόλογου γονιδίου της Drosophila auraria. Από τη διαλογή αυτή προέκυψαν αρκετοί αλληλεπικαλυπτόμενοι κλώνοι, ο μεγαλύτερος των οποίων (CM-1) είχε μέγεθος 2.593 kb και περιελάμβανε ένα ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο 715 αμινοξέων, από τη μετάφραση του οποίου προκύπτει ένα πολυπεπτίδιο προβλεπόμενου μοριακού βάρους 81,74 kDa. Η προβλεπόμενη αμινοξική αλληλουχία έδειξε πολύ μεγάλη ταυτότητα με όλα τα μέλη της οικογένειας HSP90 και ειδικότερα με τις HSP83 ομόλογες πρωτεΐνες της Drosophila. Επιπλέον, η προβλεπόμενη αμινοξική αλληλουχία περιείχε όλες τις συντηρημένες περιοχές των μελών της οικογένειας των HSP90 και στο καρβοξυτελικό της άκρο, έφερε το πενταπεπτίδιο MEEVD, το οποίο είναι χαρακτηριστικό όλων των κυτταροπλασματικών ισομορφών αυτής της οικογένειας. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα ο κλώνος CM-1, ονομάστηκε Cchsp83. Ο κλώνος αυτός, εκτός από ολόκληρη την κωδική περιοχή του γονιδίου, περιείχε μέρος της 5’ μη μεταφραζόμενης περιοχής και ολόκληρη την 3’ μη μεταφραζόμενη περιοχή του hsp83 γονιδίου της μεσογειακής μύγας. Ανάλυση κατά Southern σε γονιδιωματικό DNA με διάφορα ένζυμα περιορισμού και κατάλληλους cDNA ανιχνευτές, έδειξε ότι το Cchsp83 γονίδιο υπάρχει σε ένα μόνο αντίγραφο στο γονιδίωμα της μεσογειακής μύγας. Ανάλυση “Northern” έδειξε την ύπαρξη ενός μεταγράφου με μέγεθος 2,7 kb περίπου. Το Cchsp83 γονίδιο, χαρτογραφήθηκε με in situ υβριδοποίηση σε μία θερμοεπαγόμενη χρωμοσωματική διόγκωση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων των σιελογόνων αδένων του εντόμου (6R:94C). Η μελέτη του προτύπου έκφρασης του γονιδίου Cchsp83 έγινε σε επίπεδο RNA με RT-PCR σε ολικό RNA και σε επίπεδο πρωτεΐνης με ανάλυση Western σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα. Αντισώματα για την CcHSP83 αναπτύχθηκαν μετά από έκφραση ενός σημασμένου με 6 His τμήματος του Cchsp83 cDNA (490-690aa) σε βακτήρια E. coli. Η αντίδραση του Cchsp83 γονιδίου στην αύξηση της θερμοκρασίας είναι πολύ γρήγορη και ευαίσθητη. Μετάγραφα του γονιδίου ανιχνεύονται μετά από 5 λεπτά θερμικού στρες και σε θερμοκρασίες αρκετά χαμηλές (300C). Η επαγωγή του γονιδίου γίνεται μέγιστη μετά από 30-60 λεπτά θερμικού στρες στους 37-390C. Η επαναφορά της έκφρασης του γονιδίου στα φυσιολογικά επίπεδα μετά από θερμικό στρες είναι αργή, αφού για να γίνει αυτό απαιτούνται 4 ώρες ανάκαμψης στους 250C, μετά από μόλις 30 λεπτά θερμικού στρες στους 380C. Αναπτυξιακή μελέτη του προτύπου έκφρασης του Cchsp83 έδειξε ότι το γονίδιο εκφράζεται σε όλη τη διάρκεια της ανάπτυξης της μεσογειακής μύγας. Στους 250C τόσο τα επίπεδα του RNA, όσο και τα επίπεδα της πρωτεΐνης, είναι υψηλά στα εμβρυικά στάδια, χαμηλά στα προνυμφικά και μέτρια στα νυμφικά και ενήλικα στάδια. Μετά από θερμικό στρες στους 380C, τα επίπεδα των μεταγράφων αυξάνονται αρκετά, ιδιαίτερα στα στάδια που σε φυσιολογικές συνθήκες είναι χαμηλά. Όσον αφορά στα επίπεδα της πρωτεΐνης, τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια μετά από θερμικό στρες στους 350C, αλλά όχι στους 37-390C, όπου δεν παρατηρήθηκε καθόλου επαγωγή. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι σε υψηλές θερμοκρασίες καταστέλλεται η ωρίμανση ή και η μετάφραση του Cchsp83 RNA. Με στόχο την απομόνωση των ρυθμιστικών περιοχών του γονιδίου Cchsp83 της μεσογειακής μύγας, πραγματοποιήθηκε διαλογή μιας χρωμοσωματικής λEMBL-4A βιβλιοθήκης, με ανιχνευτή το δεύτερο εξώνιο του hsp83 ομόλογου γονιδίου της Drosophila auraria. Από τη διαλογή αυτή απομονώθηκαν δύο κλώνοι, ένας από τους οποίους περιελάμβανε μέρος της κωδικής περιοχής, την 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή και 3,5 kb της 5’ ανοδικής περιοχής του γονιδίου Cchsp83. Σύγκριση της γονιδιωματικής αλληλουχίας με τη cDNA αλληλουχία, αποκάλυψε την ύπαρξη ενός μικρού εσωνίου 275 bp ανάμεσα στην 5’ μη μεταφραζόμενη περιοχή και στην αρχή της κωδικής περιοχής του γονιδίου. Βιοπληροφορική ανάλυση και πειράματα 5’ RACE, υποδηλώνουν ότι το σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου βρίσκεται 144 bp ανοδικά του 5’ άκρου του εσωνίου και 23 bp καθοδικά ενός τυπικού στοιχείου TATA (ΤΑΤΑΑΑΤΑ). Δύο πιθανά στοιχεία απόκρισης στη θερμοκρασία (HSEs) εντοπίστηκαν στην εγγύς 5’ περιοχή του γονιδίου, 35 και 330 bp ανοδικά του στοιχείου TATA. Επιπλέον, βρέθηκαν 4 ακόμα πιο απομακρυσμένα HSEs, 1.595, 2.861, 2.880 και 2.890 bp, ανοδικά του σημείου έναρξης της μεταγραφής, καθώς και ένα HSE μέσα στο εσώνιο. Λειτουργική ανάλυση της εγγύς 5’ ανοδικής περιοχής του γονιδίου Cchsp83 πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο του γενετικού μετασχηματισμού. Τρία αλληλεπικαλυπτόμενα τμήματα του υποκινητή του γονιδίου Cchsp83, μήκους 519 bp (-380/+139, PL), 230 bp (-86/+144, PM) και 193 bp (-55/+139, PS) τοποθετήθηκαν μπροστά από το γονίδιο αναφοράς lacZ και εισήχθησαν στο γονιδίωμα της μεσογειακής μύγας με το σύστημα μετασχηματισμού Minos. Η έκφραση του γονιδίου αναφοράς, ελέγχθηκε σε όλες τις διαγονιδιακές σειρές που προέκυψαν με την ποσοτική ενζυματική μέθοδο της β-γαλακτοζιδάσης. Οι PM-lacZ και PS-lacZ σειρές δεν έδειξαν ανιχνεύσιμα επίπεδα έκφρασης του lacZ γονιδίου τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες, όσο και σε συνθήκες θερμικού στρες. Αντιθέτως, οι περισσότερες από τις PL-lacZ σειρές έδειξαν σημαντικά επίπεδα συστατικής έκφρασης. Το αναπτυξιακό πρότυπο έκφρασης του γονιδίου αναφοράς μελετήθηκε σε μία PL-lacZ σειρά και βρέθηκε παρόμοιο με εκείνο του ενδογενούς γονιδίου, υποδηλώνοντας ότι η -380/+139 περιοχή του υποκινητή περιλαμβάνει όλα τα ρυθμιστικά στοιχεία που απαιτούνται για την ορθή χρονική έκφραση του Cchsp83 γονιδίου σε φυσιολογικές συνθήκες. Αν και η περιοχή αυτή του υποκινητή περιλαμβάνει δύο δυνητικά στοιχεία απόκρισης στη θερμοκρασία καθώς και την 5’ UTR, εντούτοις δεν είχε την ικανότητα να οδηγήσει σε θερμοεπαγόμενη έκφραση το γονίδιο αναφοράς. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η περιοχή -380/+139 του Cchsp83 γονιδίου μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη διαγονιδιακών συστημάτων σήμανσης της μεσογειακής μύγας, τα οποία αναμένεται να συμβάλλουν στη διατήρηση και ανίχνευση κατάλληλων στελεχών που χρησιμοποιούνται σε προγράμματα βιολογικού ελέγχου του επιβλαβούς αυτού εντόμου. / By using the second exon of the D. auraria hsp83 gene as a probe, a number of overlapping cDNA clones were isolated from a Ceratitis capitata (medfly) cDNA library. The longest cDNA had a size of 2,593 bp and contained an open reading frame coding for a putative polypeptide of 715 amino acids with a predicted molecular weight of 81.74 kDa. In addition, it contained a part of the 5’-untranslated region and the complete 3’-untranslated region of a medfly hsp83 homolog, named Cchsp83. The predicted amino acid sequence showed a high degree of identity to all known sequences of the HSP90 family and was more closely related to the Drosophila HSP83 homologs. The putative medfly HSP83 contained all the conserved sequences of the members of the HSP90 family and was ended, at the C-terminal, with the pentapeptide MEEVD that characterizes all the cytosolic members of this family. Genomic Southern blot analysis, with several restriction enzymes and appropriate cDNA probes, indicated that the Cchsp83 gene exists as a single copy in the medfly genome. Northern blot hybridization revealed a single transcript of approximately 2.7 kb. In situ hybridization analysis showed that the Cchsp83 gene maps at the 94C region of the 6th chromosome (6R:94C), which corresponds to one of the major heat shock puffs of the medfly salivary gland polytene chromosomes. Evaluation of the Cchsp83 gene transcript and protein levels was performed by RT-PCR and western analysis, using total RNA and protein from synchronized animals. Anti-HSP83 antibodies were prepared against a histidine tag purified chimeric polypeptide from E. coli cells, transformed with a part of the coding region (aa 490-690) of the Cchsp83 cDNA. The response of the Cchsp83 gene to heat was fast and sensitive. Heat-induced transcript levels could be detected within 5 min at temperatures as low as 300C. Maximum transcript levels were obtained after 30-90 min treatments at 35-390C. Following recovery at 250C, after a 30 min heat shock, the accumulated transcripts remained at high levels for approximately 3h and declined to the non-induced levels 1h later. Developmental studies showed that the Cchsp83 gene is expressed constitutively throughout medfly development. At 250C, both transcript and protein levels were high in embryonic stages, low in larval stages and moderate in pupal and adult stages. Following heat shock at 380C, the transcript levels increased approximately 3- to 5-fold, depended on the developmental stage. Similar results were obtained for the protein levels after a heat shock at 350C, but not at 380C, suggesting that the Cchsp83 mRNAs are not translated efficiently at high temperatures. Screening of a genomic λEMBL-4A library from 24-h-old medfly embryos with the second exon of the D. auraria hsp83 gene, resulted in the isolation of a genomic clone containing part of the coding region, the untranslated leader region (5’ UTR) and 3.5 kb from the 5’ flanking region of the gene. Comparison of the genomic and cDNA nucleotide sequences revealed the presence of a small intron of 275 bp between the 5’ untranslated and coding regions of the gene. Thus the Cchsp83 gene is organized into two exons separated by a small intron. Computational analysis and 5’ RACE experiments, suggested that the putative transcription initiation site of the gene is located 144 bp upstream of the 5’ splicing site of the intron and 23 bp downstream of a typical TATA box (TATAΑΑΤΑ). Two putative heat shock elements (HSEs) were identified in the proximal 5’ flanking region of the gene, 35 and 330 bp, upstream of the TATA box. In addition to them, four distal HSEs, 1,595, 2,861, 2,880 and 2,890 bp, upstream of the putative transcription initiation site and one HSE inside the intron were identified. Functional analysis of the proximal 5’ flanking region of the Cchsp83 gene was performed by germline transformation. Three overlapping promoter fragments PL (-380/+139), PM (-86/+144) and PS (-55/+139), were fused to the lacZ reporter gene and the resulting constructs were introduced into the medfly genome via Minos-element mediated germline transformation. The expression of the reporter gene, in at least 8 homozygous transformed lines for each construct, was evaluated by quantitative β-galactosidase assays. The PM-lacZ and PS-lacZ lines did not show detectable levels of lacZ expression at neither normal or heat shock conditions. On the other hand, most of the PL-lacZ lines showed significant levels of constitutive lacZ expression. Developmental expression studies in one of these lines showed that the reporter gene exhibited similar developmental expression pattern to the endogenous one, suggesting that the PL promoter region includes all the necessary regulatory elements for driving correct temporal expression of the Cchsp83 at normal conditions. Although this promoter region contained the two proximal HSEs and the 5’ UTR, it was unable to drive heat-induced expression of the reporter gene suggesting that additional upstream and/or downstream sequences are necessary for the heat-induced expression of the Cchsp83 gene. Our data indicate that the PL promoter region of the Cchsp83 gene can be used as a driver for the development of robust transgenic marker systems in medfly. Such systems are important for detecting, maintaining and recognizing medfly strains that are used today in population control programs of this agricultural pest.

Αν και η Αυχενική Σπονδυλωτική Μυελοπάθεια (ΑΣΜ) αποτελεί την πιο κοινή αιτία δυσλειτουργίας νωτιαίου μυελού στους ενήλικες άνω των 55 ετών, οι μοριακοί μηχανισμοί παραμένουν άγνωστοι. Μέχρι σήμερα, πολλές προσπάθειες έχουν διενεργηθεί για την ανάπτυξη ενός αξιόπιστου πειραματικού μοντέλου AΣΜ. Ωστόσο, αρκετά μειονεκτήματα εμφανίζονται σε αυτές τις μελέτες. Στη παρούσα μελέτη έχουμε σκοπό τη δημιουργία ενός νέου, πρωτότυπου πειραματικού μοντέλου ΑΣΜ, το οποίο εξομοιώνει τα ιστολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά της ανθρωπίνης νόσου. Mεθοδολογία: Μετά από αφαίερεση του πετάλου του έβδομου αυχενικού σπονδύλου, ένα λεπτό τεμάχιο αρωματικού πολυαιθέρα τοποθετήθηκε κάτω από το πέταλο του έκτου αυχενκού σπονδύλου σε κόνικλους Νέας Ζηλανδίας (Ομάδα ΧΠΠ). Σε μία άλλη ομάδα πειραματόζωων ο αρωματικός πολυαιθέρας αφαιρέθηκε 30 δευτερόλεπτα μετά την εμφύτευση (ομάδα ελέγχου). Νευρολογική εκτίμηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη κλίμακα του Tarlov μετά το πέρας της χειρουργικής διαδικασίας και ακολούθως εβδομαδιαίως. Ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν στις 20 εβδομάδες μετά το χειρουργείο και πριν από τη θυσία των πειραματόζωων. Ακολούθησαν ιστολογικές και ανοσοιστοχημικές μελέτες. Αποτελέσματα: Τα πειραματόζωα που άνηκαν στην ομάδα ελέγχου δεν εμφάνισαν νευρολογικά ελλείμματα κατά τη διάρκεια της μελέτης. Αντιθέτως τα πειραματόζωα που άνηκαν στη ΧΠΠ εμφάνισαν νευρολογικά ελλείματα. Στους νωτιαίους μυελούς προερχόμενους από την ΧΠΠ ομάδα ανεδείχθησαν οι χαρακτηριστικές ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις της χρόνιας μυελοπάθειας. Ειδικότερα, ανεδείχθη σπογγώδης εκφύλιση της λευκής ουσίας, διάμεσο οίδημα και αποπλάτυνση των πρόσθιων κεράτων της φαιάς ουσίας. Επίσης ανεδείχθη κατακρήμνιση του μυελικού σάκου και διόγκωση του δακτυλίου της μυελίνης. Τέλος, η χρόνια πίεση του νωτιαίου οδήγησε σε ενεργοποίηση της απόπτωσης και διαταραχή της αρχιτεκτονικής του μικροαγγειακού συστήματος του νωτιαίου μυελού Συμπέρασμα: Το πρωτότυπο μοντέλο ΑΣΜ στους κονίκλους ποσομοιώνει το χωρικό και χρονικό προφίλ της ανθρώπινης νόσου στο σημείο της πίεσης του νωτιαίου μυελού. ΜΕΛΕΤΗ B Εισαγωγή: Η φλεγμονή, η δημιουργία ουλώδους ιστού και η διαταραχή του μικροαγγειακού συστήματος του νωτιαίου μυελού είναι ορισμένα από τα κύρια παθοφυσιολογικά φαινόμενα της ΑΣΜ. Ωστόσο οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτά τα φαινόμενα κάτω από τη χρόνια και προοδευτική πίεση του νωτιαίου μυελού παραμένουν ανεξερεύνητα. Mεθοδολογία: Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκε το πειραματικό μοντέλο ΑΣΜ που περιγράφεται στη μελέτη Α με σκοπό να διερευνηθεί ο ρόλος του NF-κB και των πρωτεινών της εξωκυττάριας ουσίας στην ΑΣΜ. Εν συντομία, κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας (διαφορετικά πειραματόζωα από εκείνα της μελέτης Α) χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες: την ομάδα ΧΠΠ (n=15) και την ομάδα ελέγχου (n=15). Η έκφραση των πρωτεινών των υπομονάδων p50 και p65 του NF-kB, όπως επίσης και των ενζύμων διάσπασης της εξωκυττάριας ουσίας (MMP-2, MMP-9) και του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (urokinase-type plasminogen activator; u-PA) αξιολογήθηκαν σε τομές νωτιαίων μυελών προερχόμενων και από τις δύο ομάδες χρησιμοποιώντας ανοσοιστοχημική τεχνική. Στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SPSS για Windows, release 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Αποτελέσματα: Σε τομές νωτιαίων μυελών που προέρχονταν από πειραματόζωα που έπασχαν από ΑΣΜ αναδείχθηκε στατιστικά σημαντικά αυξημένη έκφραση των υπομονάδων του NF-κB (p50 & p65), όπως επίσης και των ενζύμων MMP-2, MMP-9, and u-PA σε σύγκριση με εκείνες που προέρχονταν από την ομάδα ελέγχου. Τέλος, σημαντικά θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του NF-κB και εκείνων των MMP-9, MMP-2, and u-PA. Συμπέρασμα: Τα ευρήματα αυτά αποτελούν ισχυρές ενδείξεις πως η χρόνια και προοδευτική πίεση του αυχενικού νωτιαίου μυελού οδηγεί σε αυξημένη έκφραση των MMP-2, MMP-9 και u-PA πιθανόν μέσω της δράσης του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB. Είναι βέβαιο ότι περισσότερες μελέτες απαιτούνται για την εξακρίβωση του ρόλου των πρωτεινών αυτών στην ΑΣΜ. / Although cervical spondylotic myelopathy (CSM) represents the most common cause of spinal cord impairment among individuals over 55 years old, the molecular mechanisms of the disease remain mainly unknown. To date, many experimental studies have been conducted to establish a reliable model of CSM, however most of them appear some limitations. In this study we aim to create a new animal model of CSM, which will reproduce the temporal course of the human disease and the local microenvironment at the site of spinal cord compression. Methods: Following C7 posterior laminectomy, a thin sheet of aromatic polyether was implanted underneath C5–C6 laminae of the New Zealand rabbits. A sham group in which the material was removed 30 sec after the implantation was also included. Motor function evaluation was performed after the material implantation and weekly thereafter using the Tarlov classification. At 20 weeks post-material implantation electrophysiological studies were also conducted. All the animals were sacrificed 20 weeks post-material implantation and histological and immunohistochemical studies were performed. Results: Clinical evaluation of animals after operation reveals no symptoms and signs of acute spinal cord injury. Moreover, no neurological deficits were noticed in the sham group during the course of the study. However, the animals which underwent implantation of compression material exhibited progressive neurological deficits throughout the study. Rabbits of the compression group experienced significant increased axonal swelling and demyelination, interstitial edema and myelin sheet fragmentation. Histological evaluation of C5 and C6 laminae (at the site of implantation) reveals osteophyte formation. Moreover, the chronic and progressive compression of the cervical spinal cord resulted in induction of apoptosis as well as in disruption of the basement membrane of vessels. Conclusion: The proposed rabbit CSM model reproduces the temporal evolution of the disease and creates a local microenvironment at the site of spinal cord compression, which shares similar features with that of human disease. STUDY B Introduction: Inflammation, glial scar formation and disruption of spinal cord microvasculature represent some of the principal neuropathological features of CSM. However, the molecular mechanisms which are implicated in these pathophysiological phenomena under the chronic and progressive compression of the cervical spinal cord remain interestingly unexplored. Methods: In this study (B) in order to evaluate the role of NF-κB and extracellular matrix proteins in cervical myelopathy we used the rabbit CSM model which was extensively characterized in study A. Briefly New Zealand rabbits (different cohort of animals than that of the study A) were randomly and blindly divided into the following two groups: CSM (n=15) and sham group (n=15). The expression pattern of p50 and p65 subunits of NF-kB, as well as that of MMP-2, MMP-9, and u-PA, was evaluated in spinal cord sections coming from both groups using immunohistochemistry technique. Statistical analysis was performed using SPSS for Windows, release 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Results: CSM animals exhibited statistically significant increased immuoreactivity in both NF-κB subunits, p50 and p65. Moreover, the levels MMP-2, MMP-9, and u-PA were found to be significantly increased in CSM animals compared to controls. Finally, strong positive correlation between NF-κB subunits immunoreactivity and that of MMP-9, MMP-2, and u-PA was demonstrated. Conclusion: The NF-κB pathway as well as the extracellular matrix proteins (MMP-2 and MMP-9) are involved in CSM. However, more studies are needed to clarify the functional role of these molecules in the pathobiology of CSM.

Οι οπιοειδείς υποδοχείς (OR), μ, δ, κ και NOP, είναι μέλη των επταελικοειδών υποδοχέων που συζεύγνυνται με G πρωτεΐνες (7ΤΜ ή GPCR), οι οποίοι αποτελούν τη μεγαλύτερη υπεροικογένεια υποδοχέων και έναν από τους κύριους φαρμακολογικούς στόχους λόγω της υψηλής φυσιολογικής τους σημασίας. Οι OR ρυθμίζουν μια ποικιλία φυσιολογικών αποκρίσεων στο νευρικό σύστημα, με κυριότερη την αναλγησία. Τα οπιοειδή φάρμακα είναι τα πιο ισχυρά και αποτελεσματικά αναλγητικά έναντι στον οξύ πόνο, όμως η παρατεταμένη χρήση τους οδηγεί σε φαινόμενα ανοχής και εξάρτησης. Γι’ αυτό υπάρχει έντονο ενδιαφέρον στην αποσαφήνιση των μηχανισμών που εμπλέκονται στα φαινόμενα αυτά προκειμένου να σχεδιαστούν πιο αποτελεσματικά φάρμακα χωρίς τέτοιες παρενέργειες. Η σηματοδότηση των οπιοειδών υποδοχέων γίνεται κυρίως μέσω της ενεργοποίησης των Gi/o πρωτεϊνών που με τη σειρά τους ρυθμίζουν κατάλληλους τελεστές. Πέρα όμως από αυτούς τους κλασσικούς αλληλεπιδρώντες εταίρους οι OR έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν και με πολλές άλλες πρωτεΐνες κυρίως μέσω των περιοχών της τρίτης ενδοκυτταρικής τους θηλιάς (i3L) και του καρβοξυτελικού τους άκρου (CT) (Georgoussi et al., 2006- Georgoussi, 2008- Georgoussi et al., 2012). Οι αλληλεπιδράσεις αυτές επηρεάζουν όχι μόνο την σηματοδότηση των OR αλλά και την εν γένει εύρυθμη λειτουργία τους. Μια σημαντική πρωτεϊνική οικογένεια που ελέγχει τη μεταγωγή σήματος από τις G πρωτεΐνες βρέθηκε να είναι οι πρωτεΐνες Ρυθμιστές της κυτταρικής Σηματοδότησης μέσω G πρωτεϊνών ή RGS πρωτεΐνες (Regulators of G protein signaling, RGS). Ο πρωταρχικός τους ρόλος είναι η αλληλεπίδραση τους με τις Gα υπομονάδες των G πρωτεϊνών και η επιτάχυνση της υδρόλυσης του GTP από τις τελευταίες οδηγώντας στη μείωση της σηματοδότησης των GPCR. Μέλη της οικογένειας των RGS πρωτεϊνών είχε δειχθεί ότι πέρα από τις Gα πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν επίσης με υποδοχείς GPCR, τελεστές αλλά και με άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες, προσδίδοντας τους έναν ιδιαίτερο οργανωτικό ρόλο στη λειτουργία του κυττάρου και καθιστώντας τις RGS πρωτεΐνες μόρια υψηλού φαρμακολογικού ενδιαφέροντος. Παρελθόντα πειράματα in vitro συγκατακρήμνισης, του εργαστηρίου Κυτταρικής Σηματοδότησης και Μοριακής Φαρμακολογίας, με τη χρήση GST-χιμαιρικών πεπτιδίων των καρβοξυτελικών άκρων των μ-OR και δ-OR (μ-CT και δ-CT αντίστοιχα) και της τρίτης ενδοκυτταρικής θηλιάς του δ-OR (δ-i3L), έδειξαν ότι η RGS4, ένα μέλος της B/R4 υποοικογένειας, αλληλεπιδρά και με τους δυο υποδοχείς στις περιοχές αυτές (Georgoussi et al., 2006- Leontiadis et al., 2009). Η αλληλεπίδραση της RGS4 στα καρβοξυτελικά άκρα των υποδοχέων αυτών γίνεται στην περιοχή που σχηματίζει μια 8η αμφιπαθική α-έλικα (έλικα VIII), σημείο επαφής των OR και για άλλες πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις όπως αυτή των STAT5A/B ((Mazarakou and Georgoussi, 2005- Georganta et al., 2010), της σπινοφιλίνης (Fourla et al., 2012) και άλλων πρωτεϊνών (Georgoussi et al., 2012). Βρέθηκε επίσης ότι η RGS4 είναι αρνητικός ρυθμιστής της κυτταρικής σηματοδότησης των μ-OR και δ-OR (Georgoussi et al., 2006- Leontiadis et al., 2009). Τέλος, αποδείχθηκε για πρώτη φορά ότι η RGS4 παίξει το ρόλο «μοριακού φίλτρου» καθοδηγώντας τους μ-OR και δ-OR να αλληλεπιδράσουν με συγκεκριμένο διαφορετικό υποπληθυσμό Gα υπομονάδων των G πρωτεϊνών (Leontiadis et al., 2009). Καμία πληροφορία για τον ρόλο των RGS πρωτεϊνών δεν υπάρχει για τον κ-OR. Για τον λόγο αυτό σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν να ελέγξουμε αν οι RGS πρωτεΐνες της Β/R4 υποοικογένειας αλληλεπιδρούν με τον κ-OR και αν ναι, ποιος είναι ο ρόλος τους στη σηματοδότηση του κ-OR και των G πρωτεϊνών με τις οποίες ο τελευταίος συζεύγνυται. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο κ-OR μπορεί να αλληλεπιδράσει και με την RGS4 και με την RGS2 τόσο in vitro όσο και in vivo. Η δημιουργία GST-χιμαιρικών πεπτιδίων του καρβοξυτελικού άκρου του κ-OR (κ-CT) έδειξε ότι η RGS4 αλληλεπιδρά επίσης εντός της έλικας VIII ενώ η RGS2 αλληλεπιδρά με το τελικό μη συντηρημένο άκρο του κ-CT όσο και του δ-CT. Επιπλέον η συνέκφραση της RGS4 ή της RGS2 σε κύτταρα 293F που εκφράζουν τον κ-OR έδειξε ότι και οι δυο RGS πρωτεΐνες προάγουν την επιλεκτική και διαφορική σύζευξη του κ-OR με συγκεκριμένο υποπληθυσμό των Gαi/o υπομονάδων. Σε ότι αφορά τον φυσιολογικό ρόλο των RGS4 και RGS2 στις ελεγχόμενες από τον κ-OR κυτταρικές αποκρίσεις βρήκαμε ότι τόσο η RGS4 όσο και η RGS2 ανέστειλαν την καταστολή της αδενυλικής κυκλάσης που ελέγχει ο κ-OR, αλλά όχι ο δ-OR, με την RGS2 να έχει ισχυρότερη επίδραση στο μονοπάτι αυτό. Επίσης οι RGS4 και RGS2 μείωσαν την ενεργοποίηση των ERK1,2 κινασών που σηματοδοτούσε ο κ-OR. Τέλος, βρήκαμε ότι παρόλο που καμία από τις δυο RGS δεν επηρεάζει την εσωτερίκευση του κ-OR, η RGS4 επιταχύνει την εσωτερίκευση του δ-OR. Τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ότι οι RGS4 και RGS2 πρωτεΐνες είναι δυο νέοι αρνητικοί ρυθμιστές στην σηματοδότηση των κ-OR και δ-OR. Εμφανίζουν διαφορικό ρυθμιστικό ρόλο στα σηματοδοτικά μονοπάτια καθενός OR, με ρόλο κλειδί στην καθοδήγηση της σύζευξής τους με τις Gα υπομονάδες και μπορούν να αποτελέσουν ενδιαφέροντες φαρμακολογικούς στόχους για τον έλεγχο της δράσης των οπιοειδών. / Οpioid receptors (OR) (subtypes μ, δ, κ and NOP) belong to the superfamily of the Heptahelical G protein-coupled receptors (7TM or GPCRs), the largest class of receptors in the human genome and common targets for therapeutics. ORs mediate their responses in the nervous system via coupling to members of the Gi/Go proteins to regulate the activity of various effector systems. Opioids are the most potent analgesics but prolonged administration leads to phenomena of tolerance and dependence thus there is a great interest towards understanding of OR signalling in an effort to develop new drugs devoid of adverse effects. Extended observations have demonstrated that the cytoplasmic face of the ORs is critical in mediating their signal through interactions not only with G proteins but also with multiple other proteins. These regulatory proteins play distinct roles in the regulation of the OR signalling, and in the fine tuning of these receptors. Regulators of G protein signalling (RGS) proteins is a class of proteins that modulate G protein signalling events by directly interacting with Gα subunits and accelerating the GTP hydrolysis, thus reducing GPCR signalling towards their effectors. RGS can also interact with many GPCRs, effectors and auxiliary proteins thus playing a key role in the cell functions, making them highly attractive as pharmacological targets (Abramow-Newerly et al., 2006). Our previous in vitro studies have shown that a member of the B/R4 subfamily of RGS proteins such as RGS4 interacts directly with μ-OR and δ-OR within a conserved region in their C-termini (μ-CT and δ-CT), forming a helix VIII, as well as within the δ-third intracellular loop (δ-i3L). RGS4 associates with μ-OR and δ-OR in living cells and forms selective complexes with Gαi/o proteins in a receptor dependent manner. Expression of RGS4 in HEK293 cells attenuated adenylyl cyclase inhibition mediated by μ-OR and agonist-mediated ERK1,2 phosphorylation for both receptors (Georgoussi et al., 2006- Leontiadis et al., 2009), suggesting for the first time that RGS4 is a negative modulator of μ-OR and δ-OR signalling. To deduce whether similar effects also occur for the κ-opioid receptor (κ-ΟR) and define the ability of other members of the B/R4 subfamily of RGS proteins, such as RGS2, to interact with OR we generated fusion peptides encompassing the C-terminus of κ-OR (κ-CT). Results from pull down experiments indicated that RGS2 interacts with the κ-CT, the δ-CT and the δ-i3L but fails to interact with the μ-CT. RGS4-N-terminal domain is responsible for OR interaction. Mapping the sites of RGS2 interaction indicated that RGS2 interacts with the non conserved portion of the C-termini of ORs exhibiting a different docking site as compared to that of RGS4. Co-precipitation studies in living cells indicated that RGS2 and RGS4 associate with κ-ΟR constitutively and upon receptor activation and confer selectivity for coupling with a specific subset of G proteins in an RGS protein dependent manner. Expression of both RGS2 and/or RGS4, in 293F cells attenuated agonist mediated-adenylyl cyclase inhibition for κ-ΟR, but not δ-OR, with RGS2 exhibiting a more robust effect. RGS4 and RGS2 reduced κ-ΟR-mediated ERK1,2 phosphorylation whereas, RGS4 accelerated agonist-induced internalization of the δ-OR but not of the κ-OR. Collectively, our observations demonstrate that RGS2 and RGS4 are novel interacting partners and negative modulators of κ-ΟR and δ-OR signalling. These two RGS proteins display a differential modulatory effect in each signalling pathway tested and play a key functional role by conferring selectivity for both κ-OR and δ-OR coupling with a specific subset of G proteins. Therefore they can be considered as attractive new pharmacological targets to manipulate opioid receptors signalling.