Θέμα της εργασίας είναι η σταθερότητα της εύτακτης κοινωνίας του Τζον Ρώλς. Στο γ' μέρος της Θεωρίας Δικαιοσύνης του ο Τζον Ρωλς προσπαθεί να αποδείξει οτι η θεωρία του είναι πιο σταθερή από τις ωφελιμιστικές και ενοροσιοκρατικές προσεγγίσεις καθώς και οτι είναι πραγματοποιήσιμη. Στην εργασία λοιπόν αρχικά εξηγείται τι σημαίνει σταθερότητα για τον Ρωλς. Έπειτα αναλύεται ο τρόπος απόκτησης του αισθήματος δικαιοσύνης και τα επιχειρήματα του Ρωλς για τη σταθερότητα της εύτακτης κοινωνίας του. Στο τελευταίο κεφάλαιο της εργασίας παρατίθενται κριτικά σχόλια για τα επιχειρήματα αυτά. / The topic of the essay is the stability of the well-ordered society of John Rawls. In the third part of his theory of Justice John Rawls is trying to prove that his theory is more stable than utilitarism and intuitionism and that his theory is viable. In the essay at first it is elaborated what stability is for Rawls. Moreover it mentions the process of development of the sense of justice and Rawls's argument about the stability of his well-ordered society. In the last chapter of the essay comments are displayed in connection with Rawls's arguments.

Η συσχέτιση της πρωτεΐνης PSP94 με τον καρκίνο του προστάτη είναι γνωστή, καθώς μειωμένα επίπεδα της PSP94 σχετίζονται με τα προχωρημένα, μεταστατικά στάδια καρκίνου του προστάτη, και υποτίθεται ότι η πλήρης έκφρασή της συμβάλλει στην αναχαίτιση της καρκινικής ανάπτυξης. Το PCK3145, ένα συνθετικό δεκαπενταμερές πεπτίδιο, του οποίου η αλληλουχία αμινοξέων είναι ταυτόσημο με την αλληλουχία των αμινοξέων 31 έως 45 της PSP94, επιλέχτηκε μεταξύ 12 διαφορετικών πεπτιδίων που προέκυψαν από την PSP94 καθώς εδείχθη οτι ανακεφαλαιώνει in vitro και in vivo τις λειτουργίες και ιδιότητες της PSP94, και άρα είναι ένα μόριο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην καταστολή της ανάπτυξης του καρκίνου του προστάτη. Ωστόσο, φαρμακοκινητικές μελέτες σε ζώα και ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, κατέδειξαν ταχεία κάθαρση και μικρό χρόνο ημιζωής. Προκειμένου να ενισχυθεί το φαρμακοκινητικό προφίλ του πεπτιδίου PCK3145 και ως εκ τούτου να βελτιωθεί η φαρμακοδυναμική του, υπέστη χημική τροποποίηση με προσθήκη πολυαιθυλενικής γλυκόλης (PEG). Η πειραματική εργασία παρουσιάζει τα αποτελέσματα μιας συστηματικής μελέτης σχετικά με την επίδραση της πεγκυλίωσης στο PCK3145 συγκρίνοντας την πρωτεολυτική σταθερότητα και βιολογική δράση δύο πεγκυλιωμένων συζευγμάτων του με την καθαρή μορφή του. Για την ποσοτικοποίηση και για τα πειράματα σταθερότητας χρησιμοποιήθηκε ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης HPLC αποτελούμενο από μια αντλία Ultimate (Dionex). Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός επιτεύχθηκε με μια στήλη ανάστροφης φάσης C18. Επετεύχθη για πρώτη φορά η ανάπτυξη αναλυτικής μεθοδολογίας HPLC για τον προσδιορισμό των πεγκυλιωμένων αναλόγων με υψηλού βαθμού γραμμικότητα, ειδικότητα, επαναληψιμότητα και αναπαραγωγιμότητα. Η πρωτεολυτική σταθερότητα των συζευγμάτων PEG σε ανθρώπινο πλάσμα προσδιορίστηκε με χρήση υγρής χρωματογραφίας HPLC και αποκαλύφθηκε μείωση του ποσοστού αποδόμησης και ενίσχυσξ της σταθερότητας του πεπτιδικών μορίων σε ανθρώπινο πλάσμα. H μελέτη επιβίωσης της κυτταρικής σειράς καρκίνου του προστάτη PC3 μετά την προσθήκη των πεπτιδικών μορίων υπό μελέτη υπολογίστηκε με τις μεθόδους ΜΤΤ και Trypan blue. 50% αναστολή της κυτταρικής αύξησης/μεταβολισμού επετεύχθη με τις συγκεντρώσεις των 10μg/ml και για τα τρία πεπτίδια. Ωστόσο, τα πεγκυλιωμένα ανάλογα επέφεραν ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση στην κυτταρική αύξηση σε μικρότερες δόσεις. Παρόμοια ενθαρρυντικά αποτελέσματα υπήρξαν και για την δράση των μορίων στη καρκινική σειρά του μαστού MCF-7. Τα αποτελέσματα της μελέτης συνοψίζονται στην ικανότητα της πεγκυλίωσης να βελτιώνει τη σταθερότητα του PCK3145 και έτσι να ενισχύει τη βιολογική του δράση. Μελλοντικά πειράματα θα αποσαφηνίσουν περισσότερο τόσο την δράση των μορίων σε καρκινικές σειρές πέραν του προστάτη αλλά και την φαρμακοκινητική συμπεριφορά των πεπτιδικών αναλόγων μέσω πειραμάτων in vivo της βιοκατανομής και μεταβολισμού τους. / PSP94, protein is known to have specific implications with prostate cancer where a down-regulation of PSP94 levels is associated with advanced metastatic prostate cancer and it is supposed that the full expression contributes to the inhibition of tumor growth. PCK3145 is a synthetic 15-mer peptide that matches the natural sequence of amino acids 31 to 45 of PSP94 and was selected from 12 other peptides derived from PSP94 as it exhibited the best in vitro and animal in vivo properties similar to PSP94. Thus, it is a molecule hat can be used to suppress the growth of prostate cancer.However pharmacokinetics studies in animals and in patients with prostate cancer showed rapid clearance and a short half-life. In order to alter the pharmacokinetic profile of the peptide, and thereby to improve its pharmacodynamic potential PCK3145 was chemically modified with polyethylene glycol (PEG).This experimental work presents the results of a systematic study on the influence of the PEGylation of PCK3145 peptides on the proteolytic stability and biological activity of these conjugates compared to the wild-type peptide. For the quantification and stability assays an HPLC system was used consisted of an Ultimate 3000 Pump (Dionex). Chromatographic separation was achieved on RP, C18 column. An HPLC method development for the determination of the PEG-peptide conjugates was assessed for the first time. A high degree of linearity, specificity as well as repeatability and reproducibility were also achieved. The proteolytic stability of the PEG-peptide conjugates in human plasma was assessed by HPLC chromatography, which revealed a significant decrease in the degradation. Proliferation of PC3 cancer cell line was measured using the MTT and Trypan blue test. A 50% inhibition of the cell metabolism/growth was achieved by the concentrations of 10 μg/ml of the three peptides. However, at lower concentrations stronger growth inhibitory effect was observed for the PEG-peptides. Similar encouraging results have also seen for the action of molecules in cancer cell lines MCF-7.The results of this study emphasize the ability of PEGylation to improve the stability of PCK3145 and thus to enhance the biological activity. Future experiments willi clarify more the action of molecules in cancer cell lines beyond the prostate and the pharmacokinetic behavour of peptide analogs through in vivo experiments of biodistribution and metabolism.

Μελέτες αλληλεπίδρασης μικρών μονοστοιβαδιακών αρσονολιποσωμάτων τα οποία αποτελούνται από μίγματα αρσονολιπιδίων και φωσφολιπιδίων, έδειξαν ότι αυτά είναι ιδιαίτερα τοξικά απέναντι σε καρκινικά κύτταρα. Έχει προταθεί ότι το γεγονός αυτό μπορεί να συνδέεται με την ιδιότητα των αρσονολιπιδίων As (V) να ανάγονται σε As(III) από μεμβρανικές ή κυτταροπλασματικές θειόλες. Το γεγονός ότι τα HL-60 κύτταρα τα οποία είναι πολύ ευαίσθητα στα αρσονολιποσώματα βρέθηκαν να περιέχουν υψηλά επίπεδα γλουταθειόνης, έρχεται σε πλήρη συμφωνία με τη θεωρία αυτή. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε in vitrο, η επίδραση μιας θειόλης, της γλουταθειόνης, η οποία αποτελεί την κύρια θειόλη των κυττάρων, στη σταθερότητα των αρσονολιποσωμάτων, με σκοπό να διαλευκανθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ θειολών και αρσονολιποσωμάτων. Αν η γλουταθειόνη αλληλεπιδρά με το As (V) των αρσονολιπιδίων, τότε είναι πιθανόν να μεταβάλλεται η μεμβρανική τους σταθερότητα. Επιπλέον, η κυτταροτοξικότητα αυτών των αρσονολιποσωμάτων απέναντι σε σε μια καρκινική σειρά (PC3) μελετήθηκε με σκοπό να εξακριβωθεί εάν ένα in vitro τεστ με γλουταθειόνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη της τοξικότητας αρσονολιποσωμάτων απέναντι σε καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής δείχνουν ότι η επίδραση της γλουταθειόνης στη σταθερότητα των αρσονολιποσωμάτων είναι μεγαλύτερη όταν το περιεχόμενο των λιποσωμάτων σε αρσονολιπίδιο αυξάνει, σαν συνέπεια αλληλεπίδρασης του αρσονολιπιδίου με τη γλουταθειόνη. Μάλιστα σε κάποιες περιπτώσεις που εξαρτώνται από τη σκληρότητα της λιπιδικής μεμβράνης, η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί σε αποσταθεροποίηση του αρσονολιποσώματος. Η αρνητική επίδραση της γλουταθειόνης στη σταθερότητα των λιποσωμάτων είναι μεγαλύτερη στα PC-αρσονολιποσώματα απ’ ότι στα DSPC. Πιθανόν η αυξημένη σταθερότητα των DSPC-αρσονολιποσωμάτων παρουσία γλουταθειόνης σε σχέση με τα PC να σχετίζεται με το γεγονός ότι τα πρώτα είναι πιο σταθερά ακόμα και στην περίπτωση που αυτά επωάζονται σε διάλυμα ορού. Για τα σταθεροποιημένα με PEG αρσονολιποσώματα η επίδραση της γλουταθειόνης στη σταθερότητα της μεμβράνης είναι πολύ μικρότερη σε σχέση με τα μη σταθεροποιημένα γεγονός που μπορεί να σχετίζεται είτε με την υψηλή σταθερότητα που έχουν εμφανίσει σε προηγούμενες μελέτες, είτε με την ιδιότητα της πολυαιθυλενογλυκόλης να περεμποδίζει στερεοχημικά την προσέγγιση και άρα την αλληλεπίδραση των αρσονολιποσωμάτων με τη γλουταθειόνη. Με σκοπό να εξακριβώσουμε αν τα PEG-αρσονολιποσώματα παρουσιάζουν κυταροτοξικότητα, μετρήσαμε τη % βιοσημότητα των καρκινικών κυττάρων ύστερα από επώαση αυτών παρουσία και απουσία (control) αρσονολιποσωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα PC-αρσονολιποσώματα εμφανίζουν αυξημένη κυτταροτοξικότητα σε σχέση με τα DSPC, γεγονός που συμφωνεί απόλυτα με τη μειωμένη σταθερότητά τους παρουσία γλουταθειόνης. Παρόλαυτά τα PEG- αρσονολιποσώματα τα οποία είναι σταθερά παρουσία γλουταθειόνης, εμφανίζουν παρόμοια κυτταροτοξικότητα με τα μη σταθεροποιημένα PC-αρσονολιποσώματα. (Πειράματα που έγιναν με συμβατικά PEG-λιποσώματα δείχνουν ότι η παρουσία πολυαιθυλενογλυκόλης δεν προκαλεί κυτταροτοξικότητα). Συμπερασματικά τα αποτελέσματα αυτής της εργασίας δείχνουν ότι όντος πραγματοποιείται αλληλεπίδραση μεταξύ του As της πολικής κεφαλής του αρσονολιπιδίου και της θειολομάδας της γλουταθειόνης. Για τα μη σταθεροποιημένα αρσονολιποσώμτα τα αποτελέσματα από τη μελέτη της γλουταθειόνης συμφωνούν με την κυτταροτοξικότητα που εμφανίζουν στα PC3 κύτταρα, γεγονός που δεν ισχύει για τα σταθεροποιημένα. Αυτό μπορεί να οφείλετα σε διαφορετικό μηχανισμό υπεύθυνο για την κυταροτοηικότητα των PEG-αρσονολιποσωμάτων. / In cell culture studies, sonicated liposomes composed of phospholipid-arsonolipid mixtures (arsonoliposomes) demonstrate a specific toxicity against cancer cells. It has been previously proposed that this may be linked with the ability of arsonolipid As(V) to be reduced to As(III) by membrane-bound or cytoplasmic thiols. The fact that HL-60 cells which are very sensitive towards arsonoliposomes were found to have high basal glutathione concentrations, is in correlation with this theory. Here we studied in vitro, the effect of a thiol-containing compound, glutathione, on the integrity of arsonoliposomes, in order to gain some information about the interaction between thiols and arsonoliposomes. If GSH interacts with the As(V) of arsonoliposomes, this may alter their membrane stability. Furthermore, the cytotoxicity of these arsonoliposome types towards a cancer cell line (PC3) was measured in order to see if the results from the in vitro test with GSH can predict arsonoliposome toxicity towards cancer cells. The results of this study show that the effect of glutathione on arsonoliposome integrity is higher when their arsonolipid content increases, indicating that arsonolipid molecules interact with glutathione. In some cases, depending on the rigidity of their membranes, this interaction leads to a destabilization of arsonoliposomes. The destabilizing effect of GSH was higher for PC-based arsonoliposomes compared to DSPC-based ones. ). Perhaps the enhanced stability of the DSPC arsonoliposomes in presence of glutathione compared to the PC-based-ones is related with the fact that they are also significantly more stable during incubation in serum, as previously proven. For pegylated-arsonoliposomes membrane destabilization was minimal and this may be related to the high stability demonstrated previously for these specific arsonoliposomes, or, it may indicate that pegylation results in prevention (total or partial) of arsonolipid interaction with thiols (perhaps because of steric repulsion). In order to see if PEG-arsonoliposomes are cytotoxic towards cancer cells, we measured by MTT assay, the proliferation of PC3 cells after incubation in presence and absence (control) of different types and amounts of arsonoliposomes. Results show that DSPC-based arsonoliposomes are slightly, but significantly less cytotoxic compared to the equivalent PC-based ones, in agreement with the higher effect of GSH on PC-based arsonoliposomes. However although the pegylated arsonoliposomes studied were basically not affected by GSH, their PC3 cytotoxicity is equal with that measured for the PC-based arsonoliposomes, (PEG-related cytotoxicity was excluded by control experiments). To conclude the results of this study show that interaction between thiol groups and As-containing headgroups of arsonoliposomes take place. For the non-pegylated-arsonoliposomes the results of the GSH- study agree with the relative cytotoxicity of the corresponding arsonoliposomes towards PC3 cells. However, this is not the case for pegylated arsonoliposomes. Perhaps this implies that another mechanism is responsible for the pegylated liposome cytotoxicity.

Το τελευταίο διάστημα, ο όρος «ποιότητα λογισμικού» γίνεται ολοένα και πιο δημοφιλής. Όλο και μεγαλύτερη σημασία δίνεται στο τι είναι ποιότητα λογισμικού, αν μπορεί να μετρηθεί και με ποιους τρόπους κι επίσης το αν αξίζει να γνωρίζει κανείς στη φάση ανάπτυξης λογισμικού πόσο ποιοτικό είναι ένα πρόγραμμα. Επιπλέον, η ανάπτυξη λογισμικού ανοιχτού κώδικα βελτιώνεται και εξελίσσεται με γρήγορους ρυθμούς. Η παρούσα διπλωματική εργασία έχει ως στόχο την εξαγωγή συμπερασμάτων, ώστε να αποτιμηθεί η σταθερότητα ενός προγράμματος ανοιχτού λογισμικού με χρήση μετρικών. Το πρόγραμμα το οποίο μελετήθηκε ήταν το Win Merge και οι μετρικές των ρουτινών του υπολογίστηκαν με τη βοήθεια του προγράμματος Source Monitor. Αρχικά, ταξινομήθηκαν οι ρουτίνες σε κατηγορίες ανάλογα με τον αριθμό των εκδόσεων στις οποίες είχαν τροποποιηθεί. Στη συνέχεια, υπολογίστηκαν οι μέσοι όροι των ρουτινών για κάθε κατηγορία και προέκυψαν τα αντίστοιχα διαγράμματα (ένα για κάθε μετρική). / Nowadays, the term “software quality” becomes more and more popular. In addition, more and more people are interested in what it is quality of software, if and how it can be measured and whether it is worth knowing the quality of your program in the phase of software development. Moreover, the development of open source is improved with rapid rythm. This project aims at the export of conclusions, so that the stability of a program of open source is evaluated by using metrics. The program we used is Win Merge and metrics were calculated by using Source Monitor program. Initially, the routines were categorized in categories depending on the number of versions in which they had been modified. Afterwards, we calculated the averages of routines for each category and we resulted in the corresponding diagrams (for each metric).

Οι κυκλοδεξτρίνες είναι υδρόφιλα μόρια ολιγοσακχαριτών που έχουν την ικανότητα να σχηματίζουν σύμπλοκες ενώσεις με δυσδιάλυτα στο νερό μόρια φαρμάκων, εγκλωβίζοντας τα μέσω ασθενών διαμοριακών δυνάμεων στην υδρόφιλη κοιλότητα του μορίου της κυκλοδεξτρίνης (Frank 1975). Η ιδιότητα τους αυτή να σχηματίζουν σύμπλοκες ενώσεις με δυσδιάλυτα στο νερό φάρμακα έχει πολλές εφαρμογές στη φαρμακευτική βιομηχανία, καθώς ο σχηματισμός συμπλόκων των φαρμάκων αυτών με τις κυκλοδεξτρίνες έχει σημαντική επίδραση στις φυσικοχημικές τους ιδιότητες (διαλυτότητα, χημική σταθερότητα, βιοδιαθεσιμότητα). Τα λιποσώματα από την πλευρά τους είναι μορφές χορήγησης φαρμάκων με πολλά πλεονεκτήματα. Παρουσιάζουν όμως το πρόβλημα της διαφυγής των λιπόφιλων φαρμάκων (που διέρχονται από τη μεμβράνη), κυρίως μετά από in vivo χορήγηση (Kirby and Gregoriadis, 1983; Takino et al, 1994). Έτσι για την παρασκευή σταθερών μορφών χορήγησης φαρμάκων προτάθηκε ο εγκλωβισμός συμπλόκων του φαρμάκου με κυκλοδεξτρίνη στην υδατική φάση του λιποσώματος σχηματίζοντας σύστημα φάρμακο-σε-κυκλοδεξτρίνη-σε-λιπόσωμα (McCormack and Gregoriadis, 1994). Ωστόσο και το σύστημα αυτό εμφανίζει προβλήματα λόγω ικανότητας των κυκλοδεξτρινών να απομακρύνουν λιπίδια από τη μεμβράνη και να σχηματίζουν με αυτά σύμπλοκες ενώσεις. Καθώς όμως τα λιπίδια απομακρύνονται από τη μεμβράνη και εισέρχονται στην κοιλότητα της κυκλοδεξτρίνης αντικαθιστούν το φάρμακο που βρίσκεται εντός της κυκλοδεξτρίνης, το οποίο με τη σειρά του απελευθερώνεται από το λιπόσωμα λόγω αποδιοργάνωσης της λιπιδικής μεμβράνης. Στη παρούσα εργασία μελετήθηκε η σταθερότητα της μεμβράνης (προσδιορισμός συγκράτησης καλσεΐνης) και η σχετική θολερότητα διαφορετικών λιποσωμικών διασπορών κατά την επώασή τους παρουσία διαφορετικών κυκλοδεξτρινών. Συγκεκριμένα παρασκευάστηκαν DRV, MLV και SUV λιποσώματα αποτελούμενα από διαφορετικά φωσφολιπίδια και τα οποία περιέχουν ή όχι χοληστερόλη. Όλες οι παραπάνω λιποσωμικές μορφές παρασκευάστηκαν έτσι ώστε να περιέχουν καλσεΐνη (100mM) στην υδατική φάσης τους και έπειτα προσδιορίστηκε η συγκράτηση της καλσεΐνης από τα λιποσώματα κατά τη επώασή τους για 24 ώρες παρουσία των κυκλοδεξτρινών ΗΡ-β-CD, HP-γ-CD και Methyl-β- CD. Τα αποτελέσματα της μελέτης της σταθερότητας της μεμβράνης έδειξαν ότι η σταθερότητα των λιποσωμάτων στα διαλύματα των κυκλοδεξτρινών εξαρτάται από τον τύπο του λιποσώματος και τη λιπιδική σύσταση. Έτσι στα λιποσώματα με την ίδια λιπιδική σύσταση η διαφυγή καλσεΐνης από τα λιποσώματα κατά την επώασή τους παρουσία κυκλοδεξτρινών, ακολούθησε την εξής σειρά MLV>DRV >SUV. Η σταθερότητα των MLV και SUV λιποσωμάτων επηρεάστηκε περισσότερο από τη Methyl-β-CD σε σχέση με τις άλλες κυκλοδεξτρίνες. Μάλιστα είναι χαρακτηριστικό ότι η σταθερότητα των SUV λιποσωμάτων επηρεάστηκε μόνο από τη Me-β-CD. Όσον αφορά στη επίδραση της λιπιδικής σύστασης, τα DSPC λιποσώματα βρέθηκε να είναι σταθερά παρουσία και των τριών κυκλοδεξτρινών, ακόμα και όταν η λιπιδική τους μεμβράνη περιείχε χοληστερόλη. Επιπλέον τα HPC λιποσώματα αποδείχτηκαν σταθερότερα από τα PC, γεγονός που καταδεικνύει την επίδραση του κορεσμού των λιπιδίων, αλλά και της ακαμψίας της μεμβράνης στη σταθερότητα των λιποσωμάτων. Τέλος η χοληστερόλη βρέθηκε να αυξάνει τη σταθερότητα των PC και να αποσταθεροποιεί τα λιποσώματα που αποτελούνται από HPC. Επιπλέον οι μετρήσεις θολερότητας των λιποσωμικών διασπορών παρουσία αυξανόμενης συγκέντρωσης κυκλοδεξτρινών έδειξαν ότι η Me-β-CD προκάλεσε τη διαλυτοποίηση των λιποσωμάτων. Μάλιστα τα DRV λιποσώματα βρέθηκε να επηρεάζονται περισσότερο σε σχέση με τα SUV λιποσώματα. Χαρακτηριστικό είναι ότι τα αποτελέσματα από της μελέτης της απελευθέρωσης καλσεΐνης δε συμφωνούσαν πάντα με τα αποτελέσματα μέτρησης της σχετικής θολερότητας. Έτσι εξάγεται το συμπέρασμα ότι η απελευθέρωση καλσεΐνης είναι ανεξάρτητη της λιποσωμικής διαλυτοποίησης. / Cyclodextrins (CDs) are hydrophilic water-soluble oligosaccharides that can accommodate water-insoluble drugs in the hydrophobic cavities they form (Frank, 1975). They received considerable attention in the pharmaceutical field because of the improved characteristics (as aqueous solubility, chemical stability and bioavailability) observed for several drug molecules through inclusion complex formation. Previous indications that highly lipophilic drugs are rapidly released from liposomes after in-vivo administration (Kirby and Gregoriadis, 1983; Takino et al, 1994) prompted the consideration of an alternative approach for stable encapsulation of lipophilic drugs in the aqueous interior of liposomes, utilizing CDs (McCormack and Gregoriadis, 1994). This approach established a novel system in drug delivery, combining liposomes and cyclodextrin complexes of lipophilic drugs by forming drug-in-cyclodextrin-in-liposome preparations. A recently observed problem of such systems is the release of drug from the CD-drug complex encapsulating liposomes. This has been connected with the known ability of CDs to remove lipid components from cell membranes by forming inclusion complexes with the lipids (Fauvelle et al, 1997, Nishijo and Mizuno, 1998). In other words, membrane lipids may be entering in the CD cavity replacing the drug, which is in turn released from the vesicles as a consequence of the lipid membrane reorganization. The membrane integrity (calcein retention) and relative turbidity of different liposomal dispersions during incubation in presence of various cyclodextrin (CD) molecules was studied. DRV, MLV and SUV liposomes, composed of different phospholipids and containing or not cholesterol were prepared. All liposomes were formulated to encapsulate calcein (100 mM), and the retention of the liposome entrapped dye was followed during a 24 hour incubation period in presence of HP-β- CD, HP-γ-CD or Me-β-CD. The experimental results demonstrate that the integrity of liposome membranes in cyclodextrin solutions is affected by the liposome lipid composition and type. In general, for the same lipid composition calcein release from liposomes during incubation in CD’s was in the order MLV>DRV>SUV. The CD molecule that influences MLV and SUV liposome stability the most is Me-β-CD. In fact SUV liposomes, are affected only by Me-β-CD. Considering lipid composition, DSPC liposomes are always very stable, while cholesterol addition in their membrane either has no effect or decreases stability. HPC liposomes are more stable compared to PC liposomes, suggesting that phospholipid saturation and/or membrane rigidity influences their interaction with CD molecules, while cholesterol addition improved PC-liposome stability but destabilized HPC liposomes. Turbidity of some liposome dispersions was measured in presence of increasing concentrations of cyclodextrins and results show that Me-β-CD induces liposome solubilization. Aditionaly, they confirm that DRV liposomes are affected more than SUV. Decrease of relative turbidity does not always agree with calcein release, indicating that calcein release occurs irrespective of liposomal solubilization.

Τα γαλακτώματα είναι η κολλοειδής διασπορά δύο μη αναμίξιμων υγρών, τα οποία είναι κατά κανόνα θερμοδυναμικά ασταθή συστήματα. Οι πρωτεΐνες γάλακτος είναι γνωστές επιφανειοδραστικές ουσίες και ως εκ τούτου χρησιμοποιούνται ως συστατικά σε ένα ευρύ φάσμα γαλακτωμάτων τροφίμων. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η εύρεση των κατάλληλων συνθηκών για την παρασκευή σταθερών γαλακτωμάτων πρωτεϊνών γάλακτος. Το μέγεθος των λιποσφαιριδίων διαδραματίζει τον κυρίαρχο ρόλο στη σταθερότητα του γαλακτώματος πρωτεϊνών γάλακτος. Η μέτρηση του μεγέθους των λιποσφαιριδίων έγινε με την τεχνική της Μονοφασικής Χρωματογραφίας Φυγοκεντρικού Πεδίου. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης (0,5 έως 3,0% w/w) και του τύπου (πρωτεΐνες ορού και καζεΐνες) των πρωτεϊνών γάλακτος, καθώς και των συνθηκών ομογενοποίησης (πίεση ομογενοποίησης 200 έως 600bar) του γαλακτώματος. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης γαλακτωματοποιητών εμπορίου (Tween 80) στη σταθερότητα των γαλακτωμάτων. Επιπρόσθετα, έγινε κινητική μελέτη συσσωμάτωσης των γαλακτωμάτων από πρωτεΐνες γάλακτος και στη συνέχεια μελετήθηκαν πιο συγκεκριμένα τα γαλακτώματα καζεϊνών, με σκοπό τον προσδιορισμό της σταθεράς ταχύτητας της συσσωμάτωσης των λιποσφαιριδίων σε θερμοκρασίες 30,5 και 80 ᵒC. Αυξάνοντας την πίεση ομογενοποίησης του γαλακτώματος παρατηρήθηκε μείωση της διαμέτρου των λιποσφαιριδίων. Τα γαλακτώματα που ομογενοποιήθηκαν σε πίεση μεγαλύτερη των 500 bar παρουσίασαν ευρύτερη κατανομή μεγέθους, λόγω της υψηλής θερμοκρασίας που αναπτύχθηκε κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης. Η πρωτεϊνική συγκέντρωση έχει σημαντικές επιπτώσεις στις φυσικοχημικές ιδιότητες του γαλακτώματος (λάδι σε νερό). Αυξανόμενης της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών γάλακτος, μειώθηκε αισθητά η διάμετρος των λιποσφαιριδίων του γαλακτώματος και σε χαμηλές συγκεντρώσεις πρωτεϊνών (<1%κ.β.) παρατηρήθηκε σχηματισμός συσσωματωμάτων. Παρατηρήθηκε μικρή μεταβολή της διαμέτρου των λιποσφαιριδίων των γαλακτωμάτων που σχηματίστηκαν με διαφορετικές αναλογίες κλασμάτων πρωτεϊνών ορού/καζεϊνών. Οι δύο τύποι των πρωτεϊνών του γάλακτος παρουσίασαν πολύ καλή γαλακτωματοποιητική δράση και τα γαλακτώματα που σχηματίστηκαν ήταν πολύ σταθερά. Παρατηρήθηκε ότι, αυξάνοντας τη συγκέντρωση των πρωτεϊνών του ορού γάλακτος και ταυτόχρονα μειώνοντας τη συγκέντρωση των καζεϊνών, μειώθηκε η διάμετρος των λιποσφαιριδίων του γαλακτώματος. Η σταθερότητα των γαλακτωμάτων σε σχέση με τον χρόνο οφείλεται στη δομή των μορίων των πρωτεϊνών που σταθεροποιούν τα γαλακτώματα αυτά. Κατά συνέπεια, τα μόρια των καζεϊνών και των πρωτεϊνών ορού, προσδίδουν διαφορετικές ιδιότητες στα γαλακτώματα λόγω της διαφορετικής δομής τους. Τα γαλακτώματα που σχηματίστηκαν με καζεΐνες ήταν πιο ανθεκτικά στην θερμοκρασία και παρουσίασαν μακροπρόθεσμη σταθερότητα σε σχέση με τα γαλακτώματα που περιείχαν μόνο πρωτεΐνες ορού. Η υπολογισθείσα φαινόμενη σταθερά συσσωμάτωσης των γαλακτωμάτων καζεϊνών στη θερμοκρασία των 30,5 ᵒC βρέθηκε να είναι σχεδόν 14 φορές μικρότερη από αυτή των γαλακτωμάτων που συσσωματώθηκαν στη θερμοκρασία 80,0 ᵒC. Επομένως, η διαδικασία της συσσωμάτωσης συμβαίνει ταχύτερα σε πιο υψηλές θερμοκρασίες θέρμανσης για τα γαλακτώματα καζεϊνών, ωστόσο έφτασαν στο μέγιστο βαθμό συσσωμάτωσης σε ίδιο χρονικό διάστημα. / In the food industry, when referring to an oil-in-water emulsion, is usually described in which oil is dispersed in the form of small spherical droplets in the continuous phase. Food emulsions are thermodynamically unstable. Nevertheless, food scientists are able to slow down the above physicochemical mechanisms responsible for emulsion instability and thus, extend the self-life of such products by a relatively simple and well studied process, termed emulsification. Surface active materials termed emulsifiers, such as proteins help produce small droplets and contribute to the stability of the emulsion. Emulsifiers decrease the interfacial tension between the oil and water phases through rapid adsorption to the surface of the newly formed oil droplets. Milk proteins (caseins and whey proteins) are well known surfactants and hence are used as ingredients in a wide range of food emulsions. One of the important parameters affecting the quality, appearance and taste of the final food products is the particle size of the ingredients included. For example, particle size of fat globules plays predominant role in the stability of the milk-protein stabilized emulsion. Milk protein-stabilized model emulsions were formed using high-pressure homogenization and the effect of homogenization pressure during emulsification, protein concentration, type of milk proteins (casein and whey proteins) and the effect of the surfactant Tween-80 were studied. The kinetic of milk protein emulsions aggregation was also studied and moreover, the apparent rate constant was calculated for the aggregation of caseinate stabilized emulsions in different temperatures (30,5 and 80,0 ᵒC). Sedimentation field flow fractionation was employed for the size characterization of oil droplets and the results obtained are consistent with those of other studies. Increasing protein content results in significant reduction in emulsion particle size for the concentration range (0.5 – 3.0 % w/w) employed in this study. Low protein content (<1%) may be correlated with bridging flocculation leading to increased particle size, as indicated by optical microscopy. Similarly, increasing pressure during the homogenization process results in decreasing significantly the particle size of the oil-in-water emulsions, for the pressure range (200 – 600 bar) utilized in this study. Increased heating associated with high levels of pressure during the homogenization process, can result in changes in the oil or protein structure, which in turn may have an impact on the physicochemical properties of the oil-in-water emulsions on a long-term basis. The two types of milk proteins appeared to be both good emulsifiers and the formed emulsions were very stable. Increasing whey protein content and together decreasing the casein content, results in small reduction in emulsion particle size. Different proteins depending on their composition and structure posses’ properties, which render them, better emulsifiers than others. Caseinate stabilized emulsions were more resistant in heating time than whey stabilized emulsions. The calculated apparent rate constant for the aggregation of caseinate stabilized emulsions at the temperature of 30,5 ᵒC was found to be fourteen times smaller than the one at the temperature of 80,0 ᵒC. Therefore, the aggregation process is faster in high temperatures for caseinate stabilized emulsions, although the maximum of aggregation point is attained at the same time in both temperatures.

Στη παρούσα εργασία, μελετήθηκαν διάφοροι τύποι αρσονολιποσωμάτων, ως προς την επίδραση της λιπιδικής τους σύστασης στην σταθερότητα τους, την αλληλεπίδραση τους με φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα και την βιοκατανομή τους. Παρασκευάστηκαν sonicated αρσονολιποσώματα με 1,2-rac-διάκυλοοξυπροπυλ-αρσονικό οξύ με παλμιτόυλ- παράπλευρες αλυσίδες (αρσονολιπίδιο, Ars), χοληστερόλη (Chol) και φωσφατιδυλοχολίνη (PC) [PC-based αρσονολιποσώματα] ή 1,2-διστεαρόυλ-sn-φωσφατιδυλοχολίνη (DSPC) [DSPC-based αρσονολιποσώματα], με αναλογίες PC/Ars/Chol και DSPC/Ars/Chol ίσες με 12:8:10 mol:mol:mol. Επίσης παρασκευάστηκαν παρόμοια αρσονολιποσώματα με αναλογίες PC/Ars/Chol και DSPC/Ars/Chol ίσες με 17:3:10 mol:mol:mol. Παρασκευάστηκαν επίσης αρσονολιποσώματα που, εκτός από αρσονολιπίδιο, χοληστερόλη, φωσφατιδυλοχολίνη ή 1,2-διστεαρόυλ-sn-φωσφατιδυλοχολίνη περιείχαν στην σύσταση τους και PEG2000-λιπίδιο (πολυαιθυλενογλυκόλη, Μ.Β. 2000, συζευγμένη με 1,2-διστεαρόυλ-φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, DSPE-PEG2000) [PEGylated PC- και DSPC-based αρσονολιποσώματα]. Εκτός από τα παραπάνω αρσονολιποσώματα, παρασκευάστηκαν και sonicated λιποσώματα με χοληστερόλη και PC ή DSPC σε αναλογίες PC:Chol και DSPC:Chol 2:1 mol:mol («συμβατικά» λιποσώματα, χωρίς αρσονολιπίδιο). Μελετήθηκε αρχικά η τοξικότητα όλων των παραπάνω λιποσωμάτων έναντι διάφορων τύπων καρκινικών κυττάρων: ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων (ΝΒ4), κυττάρων από καρκίνο του προστάτη (PC3), ανθρώπινων κυττάρων από καρκίνο του μαστού (MDA-MB-468) και Τ-λεμφοκυττάρων από ασθενείς με λευχαιμία (ΜΤ-4), καθώς και έναντι φυσιολογικών ενδοθηλιακών κυττάρων από φλέβες ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC). Η τοξικότητα των αρσονολιποσωμάτων υπολογίσθηκε με μετρήσεις της βιωσιμότητας των κυττάρων μετά από αλληλεπίδραση τους με τα λιποσώματα με την μέθοδο MTT. Από τις καμπύλες βιωσιμότητας υπολογίσθηκαν και οι IC50 τιμές, οι συγκεντρώσεις δηλαδή στις οποίες κάθε λιπόσωμα προκαλεί 50% μείωση της κυτταρικής βιωσιμότητας. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα όλοι οι τύπο αρσονολιποσωμάτων είναι τοξικοί έναντι των καρκινικών κυττάρων (PC3, NB4 και MT-4), με εξαίρεση τα MDA-MB-468 κύτταρα, ενώ αντιθέτως δεν επηρεάζουν την βιωσιμότητα των φυσιολογικών HUVEC κυττάρων. Ωστόσο, για τον ίδιο τύπο κυττάρων, υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών τύπων αρσονολιποσωμάτων, οι οποίες δεν είναι ανάλογες με τις διαφορές της σταθερότητας των αρσονολιποσωμάτων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ακεραιότητα της μεμβράνης των αρσονολιποσωμάτων δεν αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για την εμφάνιση τοξικότητας. Είναι φανερό επομένως πως η σύσταση των αρσονολιποσωμάτων πρέπει να προσαρμόζεται κατάλληλα, ανάλογα με την in vivo κινητική τους και την επιθυμητή βιοκατανομή τους. Μελετήθηκε επίσης ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης των λιποσωμάτων με NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα, καθώς αυτές οι δυο κυτταρικές σειρές ήταν οι σειρές που επέδειξαν την περισσότερη και την λιγότερη ευαισθησία αντίστοιχα έναντι των αρσονολιποσωμάτων στις μελέτες βιωσιμότητας, με χρήση μιας φθορισμομετρικής μεθόδου. Η μέθοδος επιτρέπει την παρακολούθηση της ενδοκυττάρωσης, της δέσμευσης και διαφυγής των λιποσωμάτων από τα κύτταρα. Το HPTS, μια υδατοδιαλυτή, έντονα φθορίζουσα ουσία, της οποίας ο φθορισμός εξαρτάται από το pH, εγκλωβίστηκε στο εσωτερικό των λιποσωμάτων. Η τιμή του φθορισμού του HPTS στα 413 nm εξαρτάται από το pH, ενώ είναι ανεξάρτητη από το pH στα 454 nm, με μήκος κύματος διέγερσης 512 nm. Η ύπαρξη ισοασβεστικού σημείου στα 413 nm επιτρέπει την «μετάφραση» του φθορισμού σε ποσότητα της ουσίας. Τα NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα επωάστηκαν με λιποσώματα που είχαν εγκλωβίσει φθορίζουσα στο εσωτερικό τους (HPTS-λιποσώματα) στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα και υπολογίστηκε ο λόγος των τιμών φθορισμού στα 413 nm και τα 454 nm (Ι454/Ι413), που λειτουργεί ως ένδειξη της ενδοκυττάριας εντόπισης των λιποσωμάτων. Με σκοπό να διευκρινιστεί ο εντοπισμός των λιποσωμάτων στα κύτταρα μετά την επώαση τους, τα κύτταρα επωάστηκαν με NH4Cl, που αλκαλοποιεί το όξινο περιβάλλον των υποκυτταρικών διαμερισμάτων, με αποτέλεσμα αύξηση της τιμής φθορισμού στα 454 nm, εφόσον η φθορίζουσα βρίσκεται στα ενδοσώματα (π.χ. λυσοσώματα). Το φαινόμενο αυτό μπορεί να αναστραφεί με απομάκρυνση του NH4Cl. Υπολογίσθηκαν οι λόγοι Ι454/Ι413 πριν και μετά την επώαση τους με NH4Cl, καθώς και μετά από την απομάκρυνση του. Προσδιορίστηκε επίσης το % ποσοστό πρόσληψης αρσονολιποσωμάτων από τα κύτταρα. Η τιμή του φθορισμού στα 413 nm αποτελεί μέτρο της συγκέντρωσης αρσονολιποσωμάτων στα κύτταρα, ανεξάρτητα από το σημείο εντόπισης τους (ανεξάρτητα από το pH). Με σύγκριση των τιμών φθορισμού με πρότυπες καμπύλες αναφοράς προσδιορίστηκε η συγκέντρωση φθορίζουσας σε NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα, μετά από επώαση τους με HPTS-λιποσώματα στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα. Οι ίδιες μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν και μετά από επώαση NB4 και MDA-MB-468 κυττάρων με τα ίδια HPTS-αρσονολιποσώματα στους 4 oC, με σκοπό να διευκρινιστεί αν ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης τους εξαρτάται από την θερμοκρασία, αν είναι δηλαδή ενεργειακά εξαρτώμενη διαδικασία. Για τις μορφολογικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν, προστέθηκε στα λιποσώματα επισημασμένο με φθορίζουσα λιπίδιο στην μεμβράνη τους (ροδαμίνη συζευγμένη με φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη, Rho-PE) και η κατανομή των λιποσωμάτων παρατηρήθηκε μικροσκοπικά μετά από επώαση τους στους 37 oC για διάφορα χρονικά διαστήματα με NB4 και MDA-MB-468 κύτταρα. Η επίδραση αναστολέων της ενδοκυττάρωσης μελετήθηκε με επώαση των NB4 και MDA-MB-468 κυττάρων με χλωροπρομαζίνη (CPZ, αναστολέας της ενδοκυττάρωσης μέσω κλαθρίνης) και με μεθυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (ΜeβCD, αναστολέας της ενδοκυττάρωσης μέσω caveolae) πριν την επώαση τους με HPTS-λιποσώματα. Προσδιορίστηκαν στην συνέχεια οι λόγοι Ι454/Ι413 και τα % ποσοστά πρόσληψης των αρσονολιποσωμάτων από τα κύτταρα, με σκοπό να διευκρινιστεί ο μηχανισμός της ενδοκυττάρωσης. Όλα τα αρσονολιποσώματα επέδειξαν σχεδόν την ίδια συμπεριφορά σε σχέση με τον τρόπο που αλληλεπιδρούν με τα MDA-MB-468 κύτταρα. Ο κύριος μηχανισμός ενδοκυττάρωσης τους φαίνεται να περιλαμβάνει συμμετοχή υποδοχέων, όπως κλαθρίνη ή/και caveolae. Σε σύγκριση με τα αποτελέσματα των μελετών βιωσιμότητας προκύπτει ότι η έλλειψη τοξικότητας αυτών των αρσονολιποσωμάτων μπορεί να οφείλεται στην αποικοδόμηση τους στο εσωτερικό των λυσοσωμάτων ως φυσικό επακόλουθο της ενδοκυττάρωσης μέσω κλαθρίνης, γεγονός που συμφωνεί και με τον προσδιορισμό αρσενικού που έγινε στα MDA-MB-468 κύτταρα κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης και ανιχνεύτηκαν ποσοστά αρσενικού μόνο στην περίπτωση των πιο σταθερών DSPC-based λιποσωμάτων (PEGylated και μη). Στην περίπτωση των NB4 κυττάρων, προκύπτει πως η τοξικότητα των αρσονολιποσωμάτων μπορεί να συνδέεται επίσης με το ποσοστό συμμετοχής υποδοχέων, όπως κλαθρίνη ή/και caveolae. Λιποσώματα όπως τα PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα (που είναι τα πιο τοξικά), δεν αλληλεπιδρούν καθόλου με τα NB4 κύτταρα μέσω υποδοχέων, ενώ αντίθετα τα PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα, που αποδείχθηκαν τα λιγότερο τοξικά έναντι των NB4 κυττάρων, φαίνεται να εισέρχονται στα κύτταρα αποκλειστικά μέσω κλαθρίνης ή/και caveolae. Κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης, δεν ανιχνεύτηκαν παρ’ όλα αυτά ποσοστά αρσενικού στα κύτταρα, γεγονός που θέτει πολλά ερωτηματικά για την ενδοκυττάρια τύχη των αρσονολιποσωμάτων και συγκεκριμένα των αρσονολιπιδίων, δεδομένου ότι γίνεται ενδοκυττάρωση ολόκληρων των λιποσωμάτων αφού «control» (χωρίς αρσενικό) λιποσώματα δεν αποδείχθηκαν τοξικά για τα κύτταρα. Τέλος, με σκοπό να μελετηθεί η βιοκατανομή των αρσονολιποσωμάτων, πραγματοποιήθηκαν in vivo πειράματα. Σε ένα πρώτο σετ πειραμάτων, ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) DSPC-based και PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα σε balb-c ποντίκια και η κατανομή του αρσενικού στα διάφορα όργανα 1, 2, 5, 12 και 24 ώρες μετά την χορήγηση μετρήθηκε με Φασματομετρία Ατομικής Απορρόφησης με χρήση φούρνου γραφίτη (GFAAS). Ένα υψηλό ποσοστό της δόσης που χορηγήθηκε αποβλήθηκε ταχέως, καθώς στην πρώτη ώρα μετά την χορήγηση σχεδόν 30-40% της δόσης ανιχνεύθηκε στις ιστούς των ζώων. Από το χρονικό σημείο αυτό και μετά, η απομάκρυνση του αρσενικού ήταν βραδεία με χρόνους ημιζωής 27.6 h για τα PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα και 83 h για τα DSPC-based. Και για τους δύο τύπους αρσονολιποσωμάτων, η κατανομή αρσενικού ήταν υψηλότερη στα έντερα, μετά στο ήπαρ και μειωνόταν κατά την ακόλουθη σειρά: δέρμα + τρίχωμα, στομάχι, σπλήνα, νεφρά, πνεύμονες και καρδιά. Από τα αποτελέσματα αυτά, αν συγκριθούν με τα αποτελέσματα από παρόμοιες μελέτες που έχουν γίνει με PC-based και PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα, φαίνεται πως τα DSPC-based και PEGylated DSPC-based αρσονολιποσώματα χαρακτηρίζονται από καλύτερη βιοδιαθεσιμότητα. Από το γεγονός αυτό γίνεται φανερό πως η λιπιδική σύσταση (και κατ’ επέκταση η σταθερότητα) των λιποσωμάτων επηρεάζει το φαρμακοκινητικό τους προφίλ και συνεπώς, η σωστή επιλογή της λιπιδικής σύστασης των λιποσωμάτων είναι πολύ σημαντική ανάλογα με την εφαρμογή για την οποία προορίζονται τα λιποσώματα. Παρόμοιες in vivo μελέτες πραγματοποιήθηκαν τόσο με DSPC-based και PEGylated DSPC-based, όσο και με PC-based και PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα. Τα λιποσώματα χορηγήθηκαν ενδοφλέβια (i.v.) σε balb-c ποντίκια και η κατανομή του αρσενικού στα διάφορα όργανα προσδιορίστηκε με Φασματομετρία Ατομικής Απορρόφησης με χρήση φούρνου γραφίτη (GFAAS) 1, 3 και 24 ώρες μετά την χορήγηση. Στην περίπτωση των DSPC-based, τα επίπεδα αρσενικού στους ιστούς των ζώων ήταν γενικά υψηλότερα συγκριτικά με τα επίπεδα μετά από χορήγηση PC-based αρσονολιποσωμάτων. Η επικάλυψη των λιποσωμάτων με PEG επηρέασε περισσότερο την συμπεριφορά των DSPC-based. Τα PEGylated PC-based αρσονολιποσώματα επέδειξαν παρόμοια συμπεριφορά με τα PEGylated «συμβατικά» (χωρίς αρσενικό) λιποσώματα. Μετά από σύγκριση με τα αποτελέσματα των πειραμάτων με i.p. χορήγηση, προκύπτει πως ο ρόλος της οδού χορήγησης είναι σημαντικός στην κινητική των αρσονολιποσωμάτων, όπως και στην περίπτωση των «συμβατικών» λιποσωμάτων. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι, μετά από την i.v. χορήγηση, βρέθηκαν ανιχνεύσιμες ποσότητες αρσενικού στον εγκέφαλο, που αποτελεί ένδειξη πως τα αρσονολιποσώματα μπορούν να περάσουν τον αιματεγκεφαλικό φραγμό σε κάποιο ποσοστό, όταν βρίσκονται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο αίμα. / In this study we investigated the behavior of arsonolipid containing liposomes, in respect with their lipid composition and its effect on their stability, their interactions with normal and cancer cells and their biodistribution. Sonicated arsonoliposomes were prepared using arsonolipid with palmitic acid acyl chain (Ars), mixed with cholesterol (Chol) and phosphatidylcholine (PC-based arsonoliposomes) or 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC-based arsonoliposomes), with PC/Ars/Chol and DSPC/Ars/Chol 12:8:10 molar ratio. Arsonoliposomes with PC/Ars/Chol and DSPC/Ars/Chol 17:3:10 molar ratio was also studied. PEG2000-lipid (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine conjugated to polyethylenoglycol 2000) containing vesicles (PEGylated arsonoliposomes, PC-based and DSPC-based) were also prepared. Sonicated liposomes were also prepared using phosphatidylcholine or 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, both mixed with cholesterol, PC/Chol and DSPC/Chol 2:1 molar ratio. The cytotoxicity of these arsonoliposomes towards different cancer cells (human promyelocytic leukemia (NB4), prostatic cancer (PC3), human breast adenocarcinoma (MDA-MB-468), human T-lymphocyte (MT-4) and also towards HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) was evaluated by calculating the arsonoliposome-induced growth inhibition of the cells by the MTT assay. IC50 values were interpolated from cell number/arsonolipid concentration curves. The results reveal that all types of arsonoliposomes evaluated significantly inhibit the growth of most of the cancer cells studied (PC3, NB4 and MT-4) with the exception of the MDA-MB-468 breast cancer cells, which were minimally affected by arsonoliposomes in some cases even less than HUVEC. Nevertheless, for the same cell type the differences between the different types of arsonoliposomes were significant but never proportional to their stability, indicating that high rigidity of the arsonoliposome membrane is not a problem for their anticancer activity. Thereby it is concluded that arsonoliposome composition should be adjusted accordingly depending on their in vivo kinetics and the desired biodistribution. The interaction of liposomes with NB4 and MDA-MB-468 cells (cells with minimum and maximum viability after interaction with the arsonoliposomes accordingly) was monitored by a fluorescence method, which allows for the simultaneous monitoring of endocytosis, binding and leakage. Pyranine (1-hydroxypyrene-3,6,8-trisulfonic acid, HPTS), a highly fluorescent, water-soluble, pH sensitive dye, was encapsulated at high concentration into the lumen of liposomes. HPTS exhibits two major fluorescence excitation maxima (403 and 450 nm), which have a complementary pH dependence. The intensity of fluorescence of HPTS at 413 nm (the isosbestic point of HPTS) is pH-independent, while the intensity of fluorescence at 454 nm is pH-dependent. NB4 and MDA-MB-468 cells were incubated at 37 oC with HPTS-encapsulating liposomes for different time periods and the intracellular fate of liposomes was monitored by measuring the fluorescence, at excitation wavelengths of 413 nm and 454 nm and an emission wavelength of 512 nm. The ratio of the fluorescence intensities (Ι454/Ι413) was calculated and evaluated, since it serves as an indicator of liposomes intracellular fate. In order to gain quantitative proof concerning the localization of cell-associated liposomal fluorescence in endosomes or lysosomes of NB4 and MDA-MB-468 cells, after incubation with HPTS-encapsulating liposomes, the cells were incubated with NH4Cl. This results in an increase of pH in the acidic cellular compartments, which would induce an increase in HPTS fluorescence at 454 nm, if the dye is localized in cell endosomes (i.e. lysosomes). This effect can be reversed by removal of NH4Cl. The ratio Ι454/Ι413 was calculated, before and after NH4Cl incubation, as well as after its removal. The % uptake of liposomal contents by cells and their subsequent exposure to acidified endosomes or secondary lysosomes was also monitored. The intensity at 413 nm serves as a measure of total number of liposomes associated with cells, regardless of their location along the endocytotic pathway. The concentration of dye associated with cells was determined by measuring fluorescence at 413 nm (pH independent point) and comparing the results to a standard curve, after incubation of NB4 and MDA-MB-468 cells at 37 oC with HPTS-encapsulating liposomes for different time periods. Fluorescence microscopy studies were performed to visualize the uptake of HPTS-encapsulating arsonoliposomes in NB4 and MDA-MB-468 cells. The intra- and extracellular distribution of Rho-PE-arsonoliposomes (arsonoliposomes with 0,2% rhodamine conjugated with phosphatidyl-ethanolamine in their lipid composition), was observed after incubation with cells at 37 oC for different time periods, by fluorescence microscopy, using appropriate excitation and barrier filters. Furthermore, in another set of experiments, pretreatment of cells with endocytosis inhibitors was performed. Chloropromazine (clathrin mediated endocytosis inhibitor, CPZ) and methyl-β-cyclodextrin (caveolae mediated endocytosis inhibitor, ΜeβCD) were preincubated with cells, HPTS- encapsulating liposomes were added and the Ι454/Ι413 ratio and the % uptake of liposomal contents by cells were measured for different time periods., in order to clarify in which cases the endocytosis is clathrin- or caveolae-dependent. The interaction of liposomes with cells was monitored at 4 oC as well, in order to study the time-course of the binding of liposomes to cells and clarify whether the mechanism of the association of liposomes with cells is energy dependent. NB4 and MDA-MB-468 cells were incubated at 4 oC with HPTS-encapsulating liposomes for different time periods in two different concentrations and the estimation of the intracellular fate and amount of bound liposomes on the cells was once again based on of Ι454/Ι413 ratio and uptake measurements. The mechanism of the association of the liposomes seems to be similar for all arsonoliposomes in the case of MDA-MB-468 cells. The results reveal that arsonoliposomes are uptaken by a receptor-mediated mechanism, probably clathrin- or/and caveolae-mediated. In comparison with the results of the viability studies, the fact that arsonoliposome did not induce growth inhibition of the MDA-MB-468 cells may correlate to their lysosomal degradation resulting from the clathrin-mediated endocytosis. Moreover, the fact that no arsenic was detected by Graphite Furnace Atomic Absorbance Spectrometry in the cells after incubation under the same conditions, except for the more rigid DSPC arsonoliposomes (PEGylated or not), comes in agreement with this previous hypothesis. In the case of NB4 cells, the mechanism of the association and the extent of receptor-mediated endocytosis role may affect the induced growth inhibition. More cytotoxic PEGylated PC-based arsonoliposomes are not endocytosed through receptors at all, while PEGylated DSPC-based seem to be endocytosed through clathrin- or/and caveolae-mediated mechanism. The fact though that no arsenic was detected, after both cancer cell lines were incubated with all arsonoliposomes studied under identical conditions, needs further investigation, given that whole liposomes internalization is taking place and that control liposomes (with no arsenic in their lipid composition) have been found not to be toxic against cancer cells. In order to study the biodistribution of arsonoliposomes, DSPC-based and PEGylated DSPC-based arsonoliposomes, were administered by intraperitoneal (i.p.) injection in balb-c mice and the distribution of arsenic in the organs after 1, 2, 5, 12 and 24h post-injection was measured by atomic absorption spectroscopy. Results demonstrate that a high portion of the dose administered is rapidly excreted, since 1h post-injection only about 30–40% of the dose was detected cumulatively in animal tissues. After this, the whole body elimination of arsenic was a slow process with a half-life of 27.6 h for PEGylated DSPC-based arsonoliposomes, and 83 h for the DSPC-based ones. For both arsonoliposomes, arsenic distribution was greater in intestines, followed by liver, carcass + skin stomach, spleen, kidney, lung and heart. Different arsenic kinetics in blood between the two liposome types was observed. Compared to the results obtained previously with PC-based arsonoliposomes, both the DSPC-based and PEGylated-arsonoliposomes have better bioavailability. This proves that arsonoliposome lipid composition (and consequently their integrity) influences their pharmacokinetic profile. Thus, the proper arsonoliposome composition should be used according to the intended application. The same set of in vivo studies were also performed with DSPC-based and PC-based arsonoliposomes intravenous (i.v.) injection. In all cases PEG-lipid (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine conjugated to polyethylenoglycol 2000) was also added in the lipid membrane of the arsonoliposomes (PEGylated-arsonoliposomes) at 8 mol %. The liposomes were injected intravenously in balb-c mice. For all arsonoliposome types, the biodistribution of arsenic in mice organs was measured by atomic absorption spectroscopy, at 1, 3 and 24 h post-injection. DSPC-based arsonoliposomes give higher arsenic levels in most tissues (compared to PC-based ones) and are also affected to a higher extent by surface PEGylation. PEGylated DSPC arsonoliposomes behave similarly to PEGylated conventional liposomes that bear anionic charge. By comparison with the previous biodistribution values obtained after intraperitoneal administration of most of the vesicle types studied herein, it is concluded that the administration route has a significant effect on arsonoliposome kinetics, in some ways similar to that observed for conventional liposomes. Interestingly, after i.v. injection of all the arsonoliposome types tested, arsenic was found in detectable amounts in the animal brains, indicating that perhaps arsonoliposomes (intact or not) can pass the brain barrier to a certain extent, when high vesicle concentrations are present in the bloodstream.