Η διατριβή αφορά την ανάπτυξη και υλοποίηση ενός τετραδιάστατου, διακριτού μοντέλου προσομοίωσης της συμπεριφοράς καρκινικών κυτταρικών συστημάτων σε ελεύθερη ανάπτυξη και της απόκρισής τους σε χημειοθεραπευτική ή και ακτινοθεραπευτική αγωγή. Υλοποιήθηκαν δύο εκδοχές του μοντέλου: η χωρική και η μη χωρική προσέγγιση. Η χωρική προσέγγιση αναφέρεται στην τετραδιάστατη προσομοίωση συμπαγών όγκων. Η μη χωρική προσέγγιση βρίσκει εφαρμογή στην περίπτωση μη συμπαγών όγκων, καθώς και συμπαγών όγκων, όταν δεν δίνεται έμφαση στη χωρική εξέλιξή τους. Η ερευνητική εργασία έχει επικεντρωθεί σε τρεις τύπους καρκινικών όγκων: καρκίνος του μαστού, καρκίνος του πνεύμονα και πολύμορφο γλοιοβλάστωμα και σε θεραπευτικά σχήματα χορήγησης των σκευασμάτων: επιρουβικίνη (epirubicin), τεμοζολομίδη (temozolomide), σισπλατίνη (cisplatin), γεμσιταμπίνη (gemcitabine), βινορελμπίνη (vinorelbine) και δοσεταξέλη (docetaxel). Σκοπός της εργασίας είναι η ανάπτυξη ενός εργαλείου για την αξιόπιστη υποστήριξη ιατρών στη λήψη αποφάσεων σχετικά με την επιλογή θεραπευτικών σχημάτων και την εξατομικευμένη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής αγωγής. Η αφετηρία είναι η μοντελοποίηση του κυτταρικού κύκλου και των πιθανών μεταβάσεων μεταξύ των καταστάσεων που μπορεί να βρεθεί ένα κύτταρο. Το μοντέλο βασίζεται στην υπόθεση ότι ο καρκινικός όγκος διατηρείται από μια συγκεκριμένη κατηγορία κυττάρων, τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (cancer stem cells), και έχει επεκταθεί ώστε να περιλαμβάνει σε μεγαλύτερη λεπτομέρεια διάφορους βιολογικούς μηχανισμούς σε μοριακό (πχ. εκφράσεις γονιδίων) και κυτταρικό επίπεδο. Ο μηχανισμός δράσης, η φαρμακοκινητική και η φαρμακοδυναμική των θεωρούμενων σκευασμάτων έχουν μελετηθεί βιβλιογραφικά και έχουν ενσωματωθεί στο μοντέλο. Επίσης, το μοντέλο έχει αναπτυχθεί ώστε να λαμβάνει υπόψη του την κλινική εικόνα του ασθενούς με χρήση εξατομικευμένων κλινικών δεδομένων, όπως απεικονιστικά δεδομένα (π.χ. CT, MRI, PET), ιστοπαθολογικά δεδομένα (π.χ. τύπος όγκου, βαθμός διαφοροποίησης) και μοριακά δεδομένα (π.χ. έκφραση γονιδίων). Στα πλαίσια της διατριβής πραγματοποιούνται έλεγχοι αξιοπιστίας και εκτενείς παραμετρικές μελέτες για την αποσαφήνιση της ευαισθησίας του μοντέλου στη διακύμανση των παραμέτρων του τόσο κατά την προσομοίωση της ελεύθερης ανάπτυξης όσο και κατά την εφαρμογή της χημειοθεραπευτικής αγωγής. Η ποσοτική αξιολόγηση, προσαρμογή και βελτιστοποίηση του μοντέλου πραγματοποιείται στα πλαίσια των ευρωπαϊκών ερευνητικών προγραμμάτων ACGT (Advancing Clinicogenomic Trials on Cancer, FP6-2005-IST-026996), ContraCancrum (Clinically Oriented Cancer Multilevel Modelling, FP7-ICT-2007-2-223979) και P-medicine (From data sharing and integration via VPH models to Personalized medicine, FP7-ICT-2009-6-270089) μέσω της αξιοποίησης πραγματικών κλινικών δεδομένων. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της προσαρμογής του μοντέλου σε κλινικά δεδομένα του καρκίνου του μαστού, του καρκίνου του πνεύμονα και του πολύμορφου γλοιοβλαστώματος. Επιπλέον, διάφορες εκδόσεις του μοντέλου έχουν αξιοποιηθεί για ‘την επάνδρωση’ μιας ευρωπαϊκής βάσης μοντέλων για τον καρκίνο, που υλοποιείται στα πλαίσια του ευρωπαϊκού ερευνητικού προγράμματος TUMOR (Transatlantic Tumour Model Repositories, FP7-ICT-2009-5-247754). Το μοντέλο υλοποιείται σε γλώσσα προγραμματισμού C++. / In the present thesis, a clinically oriented, multiscale, discrete simulation model of cancer free growth and response to chemotherapy and/or radiotherapy is presented and investigated. Two versions of the model have been implemented: the spatial and the non spatial approach. The spatial model concerns the spatiotemporal evolution of solid tumours, whereas the non spatial model can be applied in the case of non solid cancers, as well as solid tumours, when no emphasis is put on the spatial features of a tumour evolution. The research work has been focused on the paradigms of early breast cancer treated with the single agent epirubicin, primary lung cancer treated with various combinations of cisplatin, gemcitabine, vinorelbin and docetaxel and glioblastoma multiforme treated with combined modality treatment using radiation and chemotherapy with temozolomide. The goal is to end up with a reliable simulation system able to assist clinicians in selecting the most appropriate therapeutic pattern, extracted from several candidate therapeutic schemes in the context of patient individualized treatment optimization. The model incorporates the biological mechanisms of cell cycling, quiescence, recruitment (reentry into the cell cycle), differentiation and death. It is based on the well documented assumption that tumour sustenance is due to the existence of cancer stem cells, i.e. cells which have the ability to preserve their own population, as well as give birth to cells that follow the path towards terminal differentiation. Furthermore, the mechanism of action, pharmacokinetics and pharmacodynamics of all considered agents have been bibliographically studied and incorporated into the model. Finally, the model has been developed to support and incorporate individualized clinical data such as imaging data (e.g. CT, MRI, PET slices, possibly fused), including the definition of the tumour contour and internal tumour regions (proliferating, necrotic), histopathologic (e.g., type of tumour) and genetic data (e.g., gene expression). An exhaustive and in-depth examination of the model behaviour with respect to the variation of its input parameters has been performed, in order to determine the impact of its parameters, guarantee a biologically relevant virtual tumour behaviour and enlighten aspects of the interplay and possible interdependencies of the biological mechanisms modeled. Finally, the model has been quantitativily validated and adaptated in the framework of the ACGT (Advancing Clinicogenomic Trials on Cancer, FP6-2005-IST-026996), ContraCancrum (Clinically Oriented Cancer Multilevel Modelling, FP7-ICT-2007-2-223979) and P-medicine (From data sharing and integration via VPH models to Personalized medicine, FP7-ICT-2009-6-270089) European Commission-funded projects by exploiting real clinical data. In the present thesis, the clinical adaptation of the model focuses on breast cancer, lung cancer and glioblastoma multiforme clinical cases. Moreover, various versions of the model have been uploaded to the EU cancer model repository developed by the TUMOR (Transatlantic Tumour Model Repositories, FP7-ICT-2009-5-247754) European Commission-funded project. The model has been developed in the C++ programming language.

Οι φυλλοειδείς όγκοι του μαστού είναι σπάνια διφασικά νεοπλάσματα, με ποικίλου βαθμό κίνδυνο για τοπική υποτροπή και μετάσταση, που αποτελούνται από επιθηλιακό και στρωματικό στοιχείο. Η επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετατροπή, κρίσιμης σημασίας γεγονός κατά την εμβρυογένεση, έχει φανεί ότι συμμετέχει στην παθογένεια της ίνωσης διαφόρων οργάνων καθώς και στη διηθητική και μεταστατική ικανότητα πολλών τύπων καρκινωμάτων. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση του κατά πόσον το φαινόμενο ΕΜΤ συμμετέχει στην παθογένεια των φυλλοειδών όγκων. Υλικό-Μέθοδος: Η έφραση της Ε-καντχερίνης, της β-κατενίνης και της ILK μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικά σε δείγματα μονιμοποιημένα σε φορμόλη και εγκλεισμένα σε παραφίνη από 71 εξαιρεθέντες φυλλοειδείς όγκους, 44 καλοήθεις (62%), 20 ενδιάμεσης κακοήθειας (28%) και 7 κακοήθεις (10%). Διερευνήθηκαν συσχετίσεις με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους όπως τον ιστολογικό τύπο των όγκων (καλοήθεις, οριακής κακοήθειας και κακοήθεις). Αποτελέσματα: Στο μη νεοπλασματικό επιθήλιο παρατηρήθηκε μεμβρανικής εντόπισης ανοσοθετικότητα για την Ε-καντχερίνη και τη β-κατενίνη και αρνητική ανοσοχρώση για την ILK. Αντίθετα, στο επιθηλιακό στοιχείο των όγκων παρατηρήθηκε μείωση της μεμβρανικής εντόπισης ανοσοθετικότητας για την Ε-καντχερίνη και τη β-κατενίνη. Η απώλεια της μεμβρανικής Ε-καντχερίνης ήταν μεγαλύτερη στους οριακής κακοήθειας και κακοήθεις όγκους (Kruskal-Wallis test p=0.000). Πυρηνικής και κυτταροπλασματικής εντόπισης ανοσοθετικότητα για την Ε-καντχερίνη και τη β-κατενίνη, καθώς και πυρηνικής και κυτταροπλασματικής εντόπισης ανοσοθετικότητα για την ILK ανιχνεύθηκαν τόσο στο επιθηλιακό όσο και στο στρωματικό στοιχείο των όγκων. Στους οριακής κακοήθειας και κακοήθεις όγκους παρατηρήσαμε στατιστικώς σημαντικά μεγαλύτερη πυρηνική/κυτταροπλασματική ανοσοθετικότητα Ε-καντχερίνης ( Kruskal-Wallis test p=0.013/p=0.006 αντίστοιχα για επιθηλιακά κύτταρα και p=0.017 για στρωματικά κύτταρα) και μεγαλύτερη πυρηνική/κυτταροπλασματική ανοσοθετικότητα για την ILK (Kruskal-Wallis test p=0.031 /p=0.012 αντίστοιχα για στρωματικά κύτταρα). Συμπέρασμα: Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι μία διεργασία τύπου ΕΜΤ μπορεί να εμπλέκεται στην παθογένεια των φυλλοειδών όγκων συμβάλλοντας στην δημιουργία όγκων με πιο επιθετικό φαινότυπo. / Phyllodes breast tumors consist of epithelial and mesenchymal components. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) has been implicated in carcinogenesis. The aim of this study was to investigate whether EMT is involved in the pathogenesis of phyllodes breast tumors. Methods: E-cadherin, β-catenin and integrin-linked kinase (ILK) expression was evaluated immunohistochemically in 71 FFPE human phyllodes breast tumors (44/71 (62%) benign, 20/71 (28%) bordeline and 7/71 (10%) malignant). Correlations with tumor histopathology (benign, borderline, malignant) were investigated. Results: Non-neoplastic breast epithelium showed membranous E-cadherin and β-catenin expression and negative ILK immunoreactivity. Decreased membranous expression of E-cadherin and β-catenin in tumor epithelial component was observed. Loss of membranous E-cadherin was higher in borderline/malignant tumors (Kruskal-Wallis test p=0.000). Nuclear/cytoplasmic immunoreactivity of E-cadherin and β-catenin, as well as nuclear/cytoplasmic expression of ILK was detected in both epithelial and stromal tumor cells. We observed significantly higher nuclear/cytoplasmic immunoreactivity of E-cadherin (Kruskal-Wallis test p=0.013/p=0.006 respectively for epithelial cells and p=0.017 for stromal cells) and nuclear/cytoplasmic stromal expression of ILK (Kruskal-Wallis test p=0.031 /p=0.012 respectively) in borderline/malignant tumors. Conclusion: These results suggest that an-EMT-like process may be implicated in phyllodes breast tumors pathogenesis contributing to a more malignant phenotype.

Στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο μαστού, θετικό για οιστρογονικούς υποδοχείς, μετά από χειρουργική θεραπεία, η μακροχρόνια χορήγηση της ταμοξιφαίνης (SERM πρώτης γενεάς), έχει αποδειχθεί ευεργετική. Ο σκοπός της παρούσης μελέτης, ήταν να διαπιστώσει, εάν οι πολυμορφισμοί του γονιδίου των ER (PvuII & XbaI του ERα και οι RsaI & AluI του Erβ), οι οποίοι έχουν συσχετισθεί με καρκίνο μαστού, σχετίζονται με το στάδιο του καρκίνου του μαστού ή την ανταπόκριση του ενδομητρίου στην μακροχρόνια αγωγή με ταμοξιφαίνη, στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο του μαστού. Η μελέτη περιέλαβε 87 μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο μαστού θετικό για οιστρογονικούς υποδοχείς, στις οποίες χορηγήθηκε ταμοξιφαίνη. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 58,7± 4,7 έτη, και η μέση διάρκεια της αγωγής με ταμοξιφαίνη ήταν 3,9 ± 1,1 έτη. Το γονιδιακό DNA απομονώθηκε από τα λευκά αιμοσφαίρια δειγμάτων περιφερικού αίματος με την κλασσική μέθοδο φαινόλης - χλωροφορμίου. Τα κλάσματα των γονιδίων των ERα και Erβ, τα οποία συμπεριελάμβαναν τις θέσεις των πολυμορφισμών, πολλαπλασιάσθηκαν με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Ο προσδιορισμός της παρουσίας των πολυμορφισμών στο DNA πραγματοποιήθηκε με την χρήση ενζύμων περιορισμού. Συμπερασματικά, στις Ελληνίδες μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο του μαστού υπό αγωγή με ταμοξιφαίνη, οι πολυμορφισμοί των οιστρογονικών υποδοχέων, δεν συνδέθηκαν, ούτε με την παρουσία παθολογίας του ενδομητρίου, ούτε με το στάδιο του καρκίνου του μαστού. / In postmenopausal women with estrogen receptor (ER) positive breast cancer, after surgical treatment long term tamoxifen administration has been proved beneficial. The aim of the present study was to identify whether these ER gene polymorphisms are associated with breast cancer stage or endometrial responsiveness to long-term tamoxifen treatment in postmenopausal women with breast cancer. The study included 87 postmenopausal women with estrogen receptor positive breast cancer treated with tamoxifen. The mean age of patients was 58,7 ± 4,7 years and the mean duration of Tamoxifen treatment was 3.9 ± 1,1 years. Genomic DNA was extracted from peripheral blood leukocyte samples by the standard phenol/chloroform procedure. Fragments of the ERα and ERβ genes encompassing the polymorphic sites were amplified by the polymerase chain reaction (PCR). The determination of presence of polymorphisms in the DNA was realised with restriction endonucleases. Ιn conclusion, in Greek postmenopausal women with breast cancer under tamoxifen treatment, Estrogen Receptors polymorphisms were not linked to either the presence of endometrial pathology or the stage of breast cancer.

Breast cancer is among the well-researched type compared to other common types of cancer. However, there still remain important open issues for investigation. One of these issues is the clarification of the importance of certain biological factors, such as histological tumour grade and estrogens reception (ER) status, to clinical management of the disease. Until now, histological grading and ER status assessment is based on the visual evaluation of breast tissue specimens under the microscope. More specifically, grading is determined on the visual estimation of certain histological features, on H&E (Hematoxylin & Eosin) stained specimens according to the World Health Organization (WHO) guidelines, whereas ER-status is assessed as the percentage of expressed nuclei on immunohistochemically stained (IHC) specimens as suggested by the American Society of Clinical Oncology (ASCO) protocol. Recent studies have attempted to examine whether histological tumour grade relates to ER status. Such a relation seems to be of importance in the various treatment strategies followed in breast tumours. However, the quantification of ER status presents certain weaknesses: a) there is a lack of consensus among experts regarding the protocol to be followed for calculating the ER status; b) an exact estimate of the ER status is difficult to be obtained, since the latter would require manual counting of positively expressed nuclei. In clinical practice often a gross estimate is obtained by the histopathologists through visual inspection on representative specimen areas. Consequently, the evaluation of ER status, which has been considered by previous studies as the key measure for assessing the correlation between ERs and tumour grade, is prone to the physician’s subjective estimation. Therefore, more reliable methods are needed. This thesis has been carried out in the search of such alternative, more reliable, methods. Accordingly, the aims of the present thesis are: (i) to develop a reliable segmentation methodology for detection of ER-expressed nuclei in breast cancer tissue images stained with IHC, (ii) to objectively quantify ER status in breast cancer tissue images stained with IHC, (iii) to investigate potential correlation between ER status and histological grade by combining information from IHC and H&E stained breast cancer tissue images obtained from the same patient, (iv) to establish evidence for linking chromatin texture variations with textural variations on ER-expressed nuclei, (v) to investigate the potential of the proposed hybrid supervised pattern recognition strategies to other challenging fields of medical image processing and analysis. To address the above issues and in search of reliable methods for quantitatively assessing ER status and its correlation with histological grade based, a novel hybrid (unsupervised-supervised) pattern recognition methodology has been designed, developed and implemented for the analysis of breast cancer tissue images. Moreover, it will be shown that proper modification of the proposed methodology may result to generalize pixel classification approach suitable for processing and analysis of medical images other than microscopic such as Computed Tomography Angiography images. / Σε σχέση με άλλες μορφές καρκίνου, ο καρκίνος του μαστού είναι μεταξύ των ευρέως μελετημένων τύπων καρκίνου, ωστόσο, υπάρχουν ακόμη σημαντικά ανοικτά ζητήματα προς διερεύνηση. Ένα από αυτά τα είναι ο προσδιορισμός της σπουδαιότητας ορισμένων βιολογικών παραγόντων, όπως ο βαθμός διαφοροποίησης της κακοήθειας (ΒΔΚ) του όγκου και το επίπεδο έκφρασης των Οιστρογονικών Υποδοχέων (ΟΥ), στην κλινική διαχείριση της νόσου. Μέχρι τώρα, η εκτίμηση του ΒΔΚ του όγκου και της έκφρασης των ΟΥ είναι βασισμένη στην οπτική αξιολόγηση ιστολογικών δειγμάτων, τα οποία λαμβάνονται από αντιπροσωπευτικές περιοχές του μαστού, στο μικροσκόπιο. Συγκεκριμένα, σύμφωνα με τις οδηγίες του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, ο ΒΔΚ του όγκου καθορίζεται από την οπτική εκτίμηση ορισμένων ιστολογικών χαρακτηριστικών γνωρισμάτων σε ιστολογικά δείγματα που έχουν υποστεί χρώση Αιματοξυλίνης - Ηωσίνης (Heamatoxylin & Eosin-Η&Ε), ενώ σύμφωνα με τις οδηγίες της Αμερικάνικης Εταιρείας Κλινικής Ογκολογίας, η έκφραση των ΟΥ πρέπει να εκτιμάται ως το εκατοστιαίο ποσοστό των εκφρασμένων πυρήνων σε δείγματα βαμμένα με ανοσοϊστοχημικές τεχνικές (Immunohistochemistry-IHC). Πρόσφατες μελέτες έχουν προσπαθήσει να εντοπίσουν εάν υπάρχει σύνδεση μεταξύ του ΒΔΚ του όγκου και της έκφρασης των ΟΥ στον όγκο, συσχετίζοντας τον ΒΔΚ από εικόνες με χρώση H&E με τον ποσοστό των εκφρασμένων ΟΥ σε δείγματα IHC. Αυτή η συσχέτιση φαίνεται να είναι σημαντική στις διάφορες ακολουθούμενες στρατηγικές για τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού. Εντούτοις, ο προσδιορισμός της έκφρασης των ΟΥ παρουσιάζει ορισμένες αδυναμίες: α) υπάρχει σημαντική μεταβλητότητα μεταξύ των ειδικών σχετικά με το πρωτόκολλο που ακολουθείται για τον υπολογισμό της έκφρασης των ΟΥ, β) είναι δύσκολο να εκτιμηθεί με ακρίβεια η έκφραση των ΟΥ, δεδομένου ότι θα απαιτούσε τη μέτρηση του συνόλου των θετικά εκφρασμένων πυρήνων από τον ειδικό ιστοπαθολόγο. Στην κλινική πράξη, λαμβάνεται συνήθως μια χονδρική εκτίμηση από τον ιστοπαθολόγο, μέσω μικροσκοπίου, παρατηρώντας αντιπροσωπευτικές περιοχές των δειγμάτων όπου υπάρχει μεγάλη συγκέντρωση εκφρασμένων πυρήνων σε ΟΥ. Ως εκ τούτου, η αξιολόγηση της έκφρασης των ΟΥ, που έχει θεωρηθεί από προηγούμενες μελέτες ως βασική μέτρηση για τη συσχέτιση μεταξύ ΟΥ και του βαθμού διαφοροποίησης των όγκων, είναι επιρρεπής στην υποκειμενικότητα του ειδικού. Για τον λόγο αυτό απαιτούνται πιο αξιόπιστες μέθοδοι. Η παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε σε αναζήτηση εναλλακτικών, πιο αξιόπιστων μεθόδων. Έτσι οι στόχοι της παρούσας διατριβής είναι: (i) η ανάπτυξη μιας αξιόπιστης μεθοδολογίας τμηματοποίησης ιστολογικών εικόνων μικροσκοπίας επεξεργασμένες με χρώση IHC για τον εντοπισμό των πυρήνων που εκφράζουν τους ΟΥ για την αντικειμενική ποσοτικοποίηση της έκφρασης των ΟΥ στον καρκίνο του μαστού, (ii) η διερεύνηση ενδεχόμενης σχέσης μεταξύ της έκφρασης των ΟΥ και του ΒΔΚ του όγκου, συνδυάζοντας την πληροφορία των ιστολογικών δειγμάτων, που προέρχονται από τον καρκινικό ιστό του ίδιου ασθενούς και έχουν υποστεί επεξεργασία με ανοσοϊστοχημική χρώση και με χρώση H&E, (iii) η διερεύνηση πιθανής συσχέτισης στις μεταβολές της υφής της χρωματίνης με τις μεταβολές στην υφή των πυρήνων που εκφράζουν τους ΟΥ, και (iv) η διερεύνηση της δυνατότητας της προτεινόμενης μεθοδολογίας σε άλλους τομείς επεξεργασίας και ανάλυσης ιατρικών εικόνων. Για την εκπλήρωση των ανωτέρω στόχων και σε αναζήτηση αξιόπιστων μεθόδων για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης των ΟΥ και της σύνδεσή της με το ΒΔΚ του όγκου, σχεδιάστηκε, αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε μια νέα μεθοδολογία βασισμένη στην αναγνώριση προτύπων ημι-εποπτευόμενης μάθησης για την ανάλυση ιστοπαθολογικής εικόνας. Επιπλέον, η κατάλληλη τροποποίηση της προτεινόμενης μεθόδου μπορεί να οδηγήσει στη γενίκευση της μεθοδολογικής προσέγγισης της ταξινόμησης εικονοστοιχείων για την επεξεργασία και την ανάλυση ιατρικών εικόνων, πέρα αυτών της μικροσκοπίας, όπως εικόνες από Aγγειογραφία Υπολογιστικής Τομογραφίας.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δείχθηκε ότι το γονίδιο της ανθρώπινης καλλικρεΐνης 6 μπορεί να ενεργοποιηθεί φαρμακολογικά σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού και μελετήθηκε ο μοριακός μηχανισμός της ενεργοποίησης. Το cDNA της ανθρώπινης καλλικρεΐνης 6 αρχικά κλωνοποιήθηκε με την τεχνική της διαφορικής παράθεσης των mRNAs βάσει της υπερέκφρασης σε πρωτοπαθή όγκο μαστού σε σχέση με την πλήρη αποσιώπηση στην μετάστασή του στον πνεύμονα, καθώς και στις περισσότερες μεταστατικές καρκινικές σειρές μαστού και δείγματα ιστών. Λόγω της καταστολής της έκφρασής της σε μεταστατικούς όγκους του μαστού, θεωρήθηκε ότι η κωδικοποιούμενη πρωτεΐνη (hK6)-μια νέα σερινοπρωτεάση- θα μπορούσε να έχει ογκοκατασταλτική δράση. Πρόσφατα δεδομένα δείχθουν ότι η hK6 αντιπροσωπεύει έναν νέο μοριακό δείκτη του καρκίνου, αφού αυξημένες συγκεντρώσεις της στον ορό είναι διαγνωστικές για τον καρκίνο των ωοθηκών και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση της θεραπευτικής αγωγής. Οι φυσιολογικές λειτουργίες της hK6 δεν έχουν βρεθεί. Πρόσφατα, αλλαγές στην έκφραση του γονιδίου KLK6 έχουν συσχετιστεί με την παθογένεση των πιο κοινών νευροεκφυλιστικών νόσων, όπως Alzheimer’s και Parkinson’s. Σημαντικό, είναι το γεγονός της αποικοδόμησης της μυελίνης από την hK6, που πιστοποιεί την συμμετοχή της στην σκλήρυνση κατά πλάκας. Για τους παραπάνω λόγους η hK6, καθώς και το γονίδιο KLK6 αποτελούν ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο. Στην παρούσα εργασία, δείχθηκε ότι οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την μεταγραφή καθώς και την ιστο-εξειδικευμένη έκφραση του γονιδίου KLK6 περιλαμβάνουν την δραστικότητα δύο υποκινητών. Επίσης κλωνοποιήθηκαν νέες ισομορφές του γονιδίου που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα και αντιστοιχούν στο 10-20% των KLK6 mRNAs. Προηγούμενη έρευνα δεν είχε παρατηρήσει εκτεταμένες γονιδιωματικές αλλαγές σε καρκινικούς όγκους στην γενετικό τόπο 19q13.4 που εδρεύει το γονίδιο KLK6, και σε συνδυασμό με την πιθανή ογκοκατασταλτική δράση της hK6, διερευνήθηκε η συμμετοχή επιγενετικών μηχανισμών στην αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου KLK6. Κατεργασία των καρκινικών κυτταρικών σειρών μαστού T47D και MDA-MB-231 με το απομεθυλιωτικό αντιδραστήριο 5-αζα-2΄-δεοξυκυτιδίνη επανενεργοποίησε την έκφραση του γονιδίου KLK6. Η τριχοστατίνη Α, αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών, επανενεργοποίησε την έκφραση KLK6 μόνο στα MDA-MB-231 κύτταρα. Επίσης, βρήκαμε ότι η καταστολή της έκφρασης KLK6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού συνδέεται με την μεθυλίωση συγκεκριμένων δινουκλεοτιδικών αλληλουχιών CpGs που βρίσκονται στον εγγύς υποκινητή του γονιδίου και σε θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Sp1. Η αποσιώπηση της έκφρασης λαμβάνει χώρα με την πρόσδεση του εξαρτώμενου από μεθυλίωση μεταγραφικού καταστολέα MeCP2 και την δημιουργία ετεροχρωματινικής δομής λόγω αποακετυλίωσης των ιστονών. Επειδή η επιγενετική αποσιώπηση του γονιδίου KLK6 υποδηλώνει ογκοκατασταλτικό ρόλο στον καρκίνο του μαστού, διαμολύνθηκε σταθερά το KLK6 cDNA στην μεταστική σειρά MDA-MB-231 με σκοπό τη διαπίστωση του πιθανού αυτού ρόλου. Τα σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα που προέκυψαν, είχαν μικρότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού, ενώ δεν μπορούσαν να σχηματίσουν αποικίες σε μαλακό άγαρ. Συμπερασματικά στην παρούσα διατριβή δείχθηκε ότι το γονίδιο KLK6 αποτελεί πιθανό ογκοκατασταλτικό γονίδιο, που αποσιωπάται σε καρκινικές σειρές μαστού μέσω μεθυλίωσης του γονιδιωματικού DNA, καθώς και δημιουργίας ετεροχρωματινικής δομής στον εγγύς υποκινητή του. Η φαρμακολογική ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου KLK6 μέσω επιγενετικών φαρμάκων, είναι πιθανό να ανοίξει νέους δρόμους για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού. / In the present thesis it was shown that the human kallikrein 6 gene is pharmacologically modulated in breast cancer cell lines and the molecular mechanism accounting for the modulation was analyzed. The cDNA encoding human kallikrein 6 (protease M) was originally cloned by mRNA differential display as being over expressed in a primary breast tumor but completely inactivated in its lung metastasis, and in the majority of metastatic breast cancer cell lines and tissue specimens. Based on this expression pattern, it was suggested that the encoded protein (hK6)-a novel serine protease-could play a suppressor role in cancer progression. Recent evidence suggests that hK6 represents a novel cancer biomarker, since elevated serum concentrations of hK6 are diagnostic of ovarian cancer and can be exploited for monitoring therapeutic response to treatment. The physiological function(s) of hK6 have not been elucidated. Recently, aberrant expression of the KLK6 gene has been implicated in the pathogenesis of most common neurodegenerative disorders, such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. In addition, hK6 is involved in enhanced proteolysis of myelin basic protein associated with multiple sclerosis. Therefore, hK6 and KLK6 gene, represent potential therapeutic targets for pharmacological intervention. In the present study, we have shown that the mechanisms regulating KLK6 transcription and tissue-specific expression involve the action of two different promoters. Also, new KLK6 splice variants were cloned, and shown to account for 10-20% of all KLK6 mRNA species. Previous study had shown no gross genomic alterations in tumor speciments in the KLK6 genomic locus 19q13.4, and in accordance with putative tumor suppressor activity the involvement of epigenetic mechanisms in KLK6 gene silencing in breast cancer was studied. Treatment of KLK6-negative T47D and MDA-MB-231 human breast cancer cell lines with the demethylating agent 5-aza-2\\\\\\\\

Αντικείμενο της παρούσας εργασία είναι ο υπολογισμός και η ταξινόμηση, με βάση το σύστημα, BIRADS της πυκνότητας του μαστού από εικόνες μαστογραφίας. Στα πλαίσια της προσπάθειας αυτής αναπτύχθηκε ολοκληρωμένο υπολογιστικό σύστημα σε γραφικό περιβάλλον ως λογισμικό πακέτο, σε γλώσσα Visual C++ .NET . Το υπολογιστικό αυτό σύστημα δέχεται σαν είσοδο εικόνες μαστογραφίας σε οποιοδήποτε από τα δημοφιλή bitmap format εικόνων όπως jpeg και tiff καθώς και DICOM αρχεία. Η λειτουργία του μπορεί να χωριστεί σε τρία στάδια: το στάδιο της προεπεξεργασίας, το στάδιο απομόνωσης της περιοχής του μαστού και το στάδιο καθορισμού της πυκνότητας του μαστού. Στο πρώτο στάδιο παρέχονται μια σειρά από στοιχειώδη εργαλεία επεξεργασίας εικόνας όπως εργαλεία περιστροφής, αποκοπής και αλλαγής αντίθεσης . Επιπρόσθετα παρέχεται η δυνατότητα Ανισοτροπικού Φιλτραρίσματος της εικόνας. Στο δεύτερο στάδιο γίνεται η απομόνωση της περιοχής του μαστού είτε απευθείας από τον χρήστη είτε αυτόματα με χρήση των ιδιοτήτων του μονογονικού (monogenic) σήματος για την αφαίρεση του παρασκηνίου (background) καθώς και κυματιδίων Gabor για τον διαχωρισμού του θωρακικού μυός. Στο τρίτο στάδιο παρέχεται η δυνατότητα ταξινόμησης της πυκνότητας του μαστού από τον χρήστη με τον καθορισμό κατάλληλου κατωφλίου των επιπέδων γκρίζου της εικόνας αλλά και η δυνατότητα αυτόματης ταξινόμησης της πυκνότητας του μαστού κατά BIRADS με χρήση Δομικών Στοιχείων Υφής (textons) και της τεχνικής pLSA. Όλες οι παραπάνω λειτουργίες παρέχονται μέσω μίας κατά το δυνατόν φιλικότερης προς τον χρήστη διεπαφής. / The present thesis aims at the classification of breast tissue according to BIRADS system based on texture features. To this end an integrated software system was developed in visual C ++. The system takes as inputs pictures in most of the popular bitmap formats like .jpeg and .till as well as DICOM. The functionality of the system is provided by three modules: (a) pre-processing module, (b) breast segmentation module and (c) the breast tissue density classification module. In the pre-processing module a set tools for image manipulation (rotation, crop, gray level adjustment) are available which are accompanied by the ability to perform anisotropic filtering to the input image. In the second module, the user has the ability to interactively define the actual borders of the breast or ask the system to perform it automatically. Automatic segmentation is a two step procedure; in the first step breast tissue is separated from its background by using the characteristics of monogenic signals, while in the second step the pectoral muscle region is subtracted using Gabor wavelets. In the density classification module the user can either ask for a calculation of breast density based on user-defined grey level threshold or perform an automatic BIRADS-based classification using texture characteristics in conjunction with Probabilistic Latent Semantic Analysis (pLSA) algorithm. Special emphasis was given to the development of a functional and user-friendly interface.