- / -

Η διατριβή αναφέρεται στην μελέτη της σκέδασης κατά την διάδοση των υπερήχων μέσα σε σπογγώδες βόειο οστούν, και την μοντελοποίηση της έτσι ώστε να μας επιτρέπει να εκτιμήσουμε το πάχος των δοκίδων του σπογγώδους οστού. Αναπτύσσεται ένα πειραματικό μοντέλο οστεοπόρωσης, και μελετάται η επίδραση των μεταβολών της μικροδομής στην σκέδαση των υπερήχων. Oι υπέρηχοι αποτελούν μία διαφορετική μέθοδο εκτίμησης της ποιότητας του οστού δίνοντας πληροφορίες για την δομή του, επιπρόσθετα με την πυκνότητα. Η διάγνωση της οστεοπόρωσης στηρίζεται μέχρι σήμερα κυρίως στην εκτίμηση της πυκνότητας του οστού, με μετρήσεις της εξασθένισης και της ταχύτητας του υπερήχου. Μια άλλη προσέγγιση της εκτίμησης της ποιότητας του οστού γίνεται με την μελέτη της σκέδασης, η οποία μπορεί να δώσει πληροφορία για την ποιότητα και την αρχιτεκτονική δομή του σπογγώδους οστού. Η σκέδαση που υφίσταται ο υπέρηχος κατά την διάδοσή του στo σπογγώδες οστούν άρχισε να μελετάται το 2000 και έχει προσεγγισθεί με δύο μοντέλα. Το πρώτο θεωρεί διακριτές ανομοιογένειες του μέσου, και χρησιμοποιεί τις αναλυτικές λύσεις του Faran2 της διαφορικής διατομής σκέδασης από σφαιρικό η κυλινδρικό ελαστικό στερεό σώμα, γιά να περιγράψει την αλληλεπίδραση του υπέρηχου με το οστούν. To δεύτερο μοντέλο θεωρεί την διάδοση των υπερήχων σε τυχαία ανομοιογενές συνεχές μέσο και βασίζεται στην απόδειξη του Chernov, ότι η σκέδαση είναι ανάλογη του γινομένου της μέσης διακύμανσης της συμπιεστότητας και της συνάρτησης αυτοσυσχέτισης του μέσου. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή για την μοντελοποίηση της σκέδασης κατά την διάδοση των υπερήχων στο βόειο σπογγώδες οστούν, χρησιμοποιήθηκε ένας συνδυασμός των δύο προσεγγίσεων. Οι σπουδαιότερες παραδοχές του μοντέλου είναι οι κάτωθι : • Υποθέτουμε ασθενή σκέδαση. • Υποθέτουμε ότι το δείγμα είναι στατιστικά ομογενές και ισότροπο. • Αγνοούνται τα φαινόμενα πολλαπλής σκέδασης, και • Δεν λαμβάνεται υπ’ όψιν η μετατροπή των διαμήκων κυμάτων σε διατμητικά. Οι παραδοχές του μοντέλου ικανοποιούνται από τα πειραματικά αποτελέσματα. Για την περιγραφή της μικροδομής του σπογγώδους οστού, χρησιμοποιήθηκαν δύο συναρτήσεις αυτοσυσχέτισης: μία τροποποιημένη Gaussian συνάρτηση πυκνού πληθυσμού για να ερμηνεύσει τις αρνητικές τιμές αυτοσυσχέτισης που παρατηρούνται μεταξύ δύο σημείων μέσα και έξω από μία ανομοιογένεια και αφορούν την πυκνότητα και την συμπιεστότητα, καθώς και το μεγάλο ποσοστό δοκίδων στην μονάδα του όγκου, και η συνάρτηση κατανομής μικρής συγκέντρωσης σφαιρών, για να εξηγήσει την ύπαρξη μεγάλων στο πλάτος δοκίδων με ελλειπτική ή σφαιρική τραχεία μορφή που συνεισφέρουν ένα ποσοστό στη σκέδαση. Για τα περισσότερα όμως δείγματα κανένα από τα δύο μοντέλα δεν ήταν επαρκές για να προσεγγίσει επ’ ακριβώς την συμπεριφορά του σπογγώδους οστού. Γι’ αυτόν τον λόγο προτάθηκε ένας συνδυασμός των δύο μοντέλων για να περιγράψει τα πειραματικά δεδομένα. Το αντίστροφο πρόβλημα της εκτίμησης του πάχους των δοκίδων του οστού αντιμετωπίσθηκε στην παρούσα διατριβή. Λόγω του εύρους της διακύμανσης του πάχους των δοκίδων στο βόειο σπογγώδες οστό, έγιναν διαγράμματα κατανομής του πάχους για κάθε δοκίμιο οστού και προσδιορίσθηκε το κυρίαρχο αντί για το μέσο πάχος δοκίδων, που έχει χρησιμοποιηθεί σε άλλες εργασίες. Η σύγκριση των πειραματικών μετρήσεων της διαφορικής διατομής σκέδασης 1800 με την θεωρητική πρόβλεψη, έδειξε ότι περισσότερες της μίας κυρίαρχες διαστάσεις δοκίδων συνεισφέρουν στην σκέδαση σε κάθε δοκίμιο. Σημαντική γραμμική συσχέτιση (R2=0.8558) βρέθηκε μεταξύ εκτιμώμενου και μετρηθέντος πάχους δοκίδων. Η εξασθένιση των υπερήχων κατά την διέλευσή τους μέσα από βιολογικούς ιστούς, έχει δύο συνιστώσες: την απορρόφηση και τη σκέδαση. Η προβλεπόμενη από την συνάρτηση αυτοσυσχέτισης του πυκνού πληθυσμού εξασθένιση λόγω σκέδασης, παρουσιάζει μία ευρεία γραμμική περιοχή από 0.3 έως 0.9 MHz για συνεχή κατανομή σκεδαστών (100 έως 600 μm), που επαληθεύεται από τα πειραματικά δεδομένα, υποδεικνύοντας ότι η εξασθένιση που υφίσταται ο υπέρηχος κατά την διάδοσή του στο σπογγώδες οστούν, οφείλεται σε μεγαλύτερο βαθμό στην σκέδαση απ’ ότι στην απορρόφηση. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής αναπτύσσεται ένα πειραματικό μοντέλο προσομοίωσης της οστεοπόρωσης. Η οστεοπόρωση είναι μία σοβαρή νόσος των οστών, που χαρακτηρίζεται από χαμηλή οστική μάζα και πυκνότητα, μεταβολή της μικροδομής του οστού με μείωση του πάχους των δοκίδων και αυξημένο κίνδυνο κατάγματος. Στόχος είναι η εκτίμηση της επίδρασης των μεταβολών της μικροδομής, και της πυκνότητας του σπογγώδους οστού στις ιδιότητες των υπερήχων κατά την διάδοση τους μέσω του οστού, για την κατασκευή “εργαλείων” διάγνωσης της οστεοπόρωσης. H προσομοίωση της οστεοπόρωσης επιτυγχάνεται με σταδιακή αφαίρεση των ανόργανων συστατικών (απασβεστοποίηση) με εμβάπτιση σε υδροχλωρικό οξύ. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία και η ιστολογική χρώση δείχνουν ότι, σε κάθε στάδιο απασβεστοποίησης, οι δοκίδες του οστού αποτελούνται από ένα πυρήνα άθικτο και ένα εξωτερικό στρώμα πλήρως απασβεστοποιημένο, το πάχος του οποίου εξαρτάται από τον χρόνο εμβάπτισης. Mε την διαδικασία αυτή επιτυγχάνεται η σταδιακή μείωση του πάχους των δοκίδων και επομένως η μείωση της πυκνότητας. Το μοντέλο ασθενούς σκέδασης με συνδυασμό δύο συναρτήσεων αυτό-συσχέτισης (του πυκνού πληθυσμού και της σφαιρικής κατανομής) που αναπτύχθηκε στο πρώτο τμήμα της διατριβής, χρησιμοποιήθηκε γιά την εκτίμηση του πάχους των δοκίδων στα διαδοχικά στάδια απασβεστοποίησης. Η ακρίβεια της εκτίμησης βρέθηκε ότι αυξάνεται με το πάχος των δοκίδων. / Ultrasound is currently being assessed as an alternative method of evaluating bone quality, and provides information about structure in addition to density. Ultrasound velocity and broadband ultrasound attenuation (BUA) determination has been explorer as an alternative method for estimating bone density and osteopososis. An other approach is the ultrasound scattering which inform us for the quality and architecture of the bone. Two different approaches have been proposed to model backscattering from cancellous bone. A first approach with discrete homogeneites use the analytical model of Faran which provides an exact solution of the backscatter cross section by a spherical or a cylindrical solid elastic object, to describe the interaction of trabecular bone with the ultrasonic wave. The second approach is based on Cernov’s proof that scattering is proportional to the product of the mean compressibility fluctuation and the autocorrelation function integrated over volume. A combination of the two autocorrelation functions was required to closely approximate the backscatter from bovine cancellous bone. The main limitations of the model are the following : • Weak scattering • The assumption of statistical homogeneity over one sample • First order multiple scattering • They do not account for shear waves in the scatterers The main limitations are satisfied from the experimental data Two simple scattering autocorrelation functions have been utilized to describe the microscopic structure of the random inhomogeneous medium: A modified Gaussian model has been considered to account for a large volume fraction of scatterers in the medium, the fluctuation in density and compressibility about the mean value, and the spherical distribution model because a number of larger plate-like scatterers with ellipsoid or roughly spherical shape may contribute to a portion of the scattering. The frequency dependence of the backscatter coefficient from bovine trabecular bone could not be discribed accurately either by scattering from a collection of randomly distributed identical scatterers or by a continuous model with a single dominant correlation length. This could be due to the tremendous variation in microarchitecture encountered in bovine trabecular bone. A combination of models was required to approximate the experimental data. The inverse problem to estimate the trabecular thickness of bone tissues has been addressed in this thesis. The estimates of correlation lengths from the combination of the two models were compared to trabecular thickness. Mean values of trabecular thickness display very large variation at both intraspecimen and interspecimen levels and cannot be used as estimates of the correlation length α. A significant contribution of this work is that interpretation of the correlation length was the dominant trabecular thickness, obtained from distribution graphs for each specimen. Significant linear correlation was found between predicted correlation length and measured trabecular thickness (R2=0.8558). In this study, it was found that the total attenuation by tissues is largely due to scattering processes than the attenuation due to absorption and the frequency dependence of attenuation due to scattering is linear for a densely populated distribution of scatterers from 100 to 600 μm, which have been measured in bovine cancellous bone, and in the range of frequencies 0.3-0.9 MHz. In the second part of this study a new experimental model was developed in order to simulate osteoporosis. Osteoporosis is a condition of reduced mass and density, change of bone 3D structure and increased fragility with a more pronounced effect on cancellous bone. Our purpose is the study of the ultrasonic frequency-depedent backscatter in dense bovine trabecular bone and the determination of a weak scattering model for the trabecular thickness which is relative to osteoporosis. The simulation of osteoporosis was developed in order to evaluate the effects of change of mineral content and microstructure on ultrasonic properties of cancellous bone with immersion in hydrocloric acid. Timed immersion in hydrochloric acid was used to selectively alter the mineral content. Scanning electron microscopy and histological staining of the acid-treated trabecular demonstrated a heterogeneous structure consisting of a mineralized core and a demineralized layer. Τhe accuracy of estimation was found to increase with trabcular thickness. A two-component model of weak scattering utilizing a combination of two autocorrelation functions (a densely populated model and a spherical distribution) to evaluate the trabecular thickness in various stages of decalcification. Τhe accuracy of estimation was found to increase with trabcular thickness.

Η οστεοπόρωση αποτελεί την πιο συχνή μεταβολική διαταραχή των οστών που οδηγεί σε αυξημένη ευθραυστότητα αυτών και κατά συνέπεια σε χαμηλής ενέργειας κατάγματα. Τα συνηθέστερα οστεοπορωτικά κατάγματα συμβαίνουν στην περιοχή της πηχεοκαρπικής άρθρωσης, στους σπονδύλους καθώς και στο ισχίο, οστά δηλαδή στα οποία η αναλογία σπογγώδους και φλοιώδους οστού είναι συγκεκριμένη. Λόγω του μεγέθους του προβλήματος, υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για την εκτίμηση της οστεοπόρωσης και κατ’ επέκταση τη πρόβλεψη του κινδύνου κατάγματος. Μια σειρά από διαφορετικές τεχνικές έχουν αναπτυχθεί για τη μέτρηση διαφόρων σκελετικών περιοχών ως μέσο για την εκτίμηση του κινδύνου κατάγματος. Η απορροφησιομετρία ακτίνων-Χ διπλής ενέργειας (DXA) είναι η τεχνική που χρησιμοποιείται πιο συχνά για την διάγνωση της οστεοπόρωσης μέσω της εκτίμησης της οστικής πυκνότητας BMD. Ωστόσο, στην πραγματικότητα, μόνο το 60% της διακύμανσης της οστικής αντοχής μπορεί να εξηγηθεί από τις διακυμάνσεις της επιφανειακής οστικής πυκνότητας. Στη συγκεκριμένη μελέτη σταθήκαμε κυρίως στην απορροφησιομετρία ακτίνων-Χ διπλής ενέργειας, στην περιφερική ποσοτική υπολογιστική τομογραφία (pQCT) και στην απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (MRI). Κλινικές και πειραματικές μελέτες έχουν δείξει ότι η απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού έχει το δυναμικό να είναι μια χρήσιμη μέθοδος για την μελέτη του σπογγώδους οστού. Το τεχνικό υπόβαθρο αυτής της μεθόδου μπορεί να εξηγηθεί από τις διαφορές της μαγνητικής επιδεκτικότητας στην διεπιφάνεια μεταξύ του σπογγώδους οστού και του μυελού των οστών, που οδηγούν σε χωρικές ανομοιογένειες του μαγνητικού πεδίου. Αυτές οι ανομοιογένειες έχουν ως αποτέλεσμα την εκτροπή της συμφασικότητας της εγκάρσιας μαγνήτισης. Αυτό οδηγεί στην μεταβολή της τιμής του Τ2* του μυελού του οστού. Η μεταβολή του Τ2* μαζί με τα χαρακτηριστικά αυτού του χρόνου χαλάρωσης παρέχουν πληροφορίες για την πυκνότητα και την δομή του περιβάλλοντος σπογγώδους οστικού πλέγματος (ms). Οι κύριοι στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν: α) Ο προσδιορισμός της ικανότητας των μετρήσεων του ενεργού εγκάρσιου χρόνου χαλάρωσης Τ2* να επιτύχει διάκριση μεταξύ γυναικών με φυσιολογική ή οστεοπορωτική αρχιτεκτονική του σπογγώδους οστού. β) Η συσχέτιση του εγκάρσιου χρόνου χαλάρωσης Τ2* με τους δείκτες aBMD, vBMD και Trabecular Density που λαμβάνεται μέσω των εξετάσεων DXA και pQCT αντίστοιχα. γ) Η εκτίμηση της ακρίβειας των μετρήσεων του Τ2* μαγνητικού συντονισμού σε συγκεκριμένα τμήματα του ανθρώπινου σώματος με πρωτεύοντα στόχο την περιοχή της οσφυϊκής μοίρας και της κνήμης. Μετά από τη σχετική έγκριση των Επιτροπών Βιοηθικής και Έρευνας του Π.Γ.Ν. «Αττικόν» και του Γ.Ν.Α. «ΚΑΤ», στη μελέτη μας συμμετείχαν 15 μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες και 5 υγιείς, οι οποίες αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Όλες οι συμμετέχοντες πραγματοποίησαν τις εξετάσεις των pQCT κνήμης και οστικής πυκνότητας ΟΜΣΣ, στα ίδια συστήματα pQCT και DXA του Γ.Ν.Α. «ΚΑΤ». Έπειτα, για την διεξαγωγή της μαγνητικής τομογραφίας ΟΜΣΣ-κνήμης, οι 15 μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες χωρίστηκαν σε δυο ομάδες. Η Α ομάδα αποτελούμενη από 9 μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, πραγματοποίησε την μαγνητική τομογραφία στον μαγνητικό τομογράφο του Ευγενίδειου Θεραπευτηρίου και αντίστοιχα, η Β ομάδα αποτελούμενη από 6 μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες πραγματοποίησε την μαγνητική τομογραφία στον μαγνητικό τομογράφο του Π.Γ.Ν. «Αττικόν». Η ομάδα των 5 υγιών ατόμων, πραγματοποίησε την εξέταση και στα δυο συστήματα μαγνητικής τομογραφίας, ώστε να διερευνηθεί το κατά πόσον η ένταση του μαγνητικού πεδίου επηρεάζει τις παραμέτρους που επρόκειτο να υπολογιστούν. Για τον υπολογισμό της οστικής πυκνότητας της οσφυϊκής μοίρας, ελήφθησαν προσθοπίσθιες προβολές της ΟΜΣΣ και πιο συγκεκριμένα των οσφυϊκών σπονδύλων Ο1 – Ο4 και υπολογίστηκε τόσο η μέση τιμή BMD των Ο1 – Ο4, όσο και η τιμή BMD κάθε σπονδύλου ξεχωριστά. Επιπρόσθετα, σε κάθε ασθενή ελήφθησαν υπόψη τα στοιχεία που προκύπτουν από την μελέτη της τομής 4% του μήκους της κνήμης από την κάτω αρθρική επιφάνεια. Η τομή 4% παρέχει πληροφορίες για το σπογγώδες οστό και οι προτεινόμενες παράμετροι που συλλέχθηκαν ήταν η ογκομετρική πυκνότητα του σπογγώδους οστού (trabecular density) και η ολική πυκνότητα οστού (total density, vBMD). Στην απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού, ελήφθησαν ακολουθίες πολλαπλών αντηχήσεων (multi echo) και πολλαπλών τομών (multi slice) για την μέτρηση του εγκάρσιου χρόνου χαλάρωσης T2* χωρίς καταστολή λίπους σε εγκάρσιο και στεφανιαίο επίπεδο. Εν συνεχεία, για την εκτίμηση του εγκάρσιου χρόνου χαλάρωσης T2 ελήφθησαν ανατομικές ακολουθίες Τ2 προσανατολισμού χωρίς καταστολή λίπους σε εγκάρσιο και στεφανιαίο επίπεδο. Στην κεντρική τομή που αντιστοιχεί στο 4% του μήκους της κνήμης από την κάτω αρθρική επιφάνεια καθώς και στις κεντρικές τομές των οσφυϊκών σπονδύλων Ο1 – Ο4, σχεδιάστηκαν οι περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) σε όλες τις εικόνες διαφορετικών ΤΕ. Εν συνεχεία, με τη χρήση του λογισμικού IDL πραγματοποιήθηκε αλγόριθμος ανάλυσης Levenberg – Marquadt με τον οποίον έγινε ο υπολογισμός των χρόνων Τ2* και Τ2. Τα αποτελέσματα στην παρούσα μελέτη δείχνουν μια σημαντική θετική συσχέτιση των παραμέτρων οστικής πυκνότητας των περιοχών της ΟΜΣΣ και της κνήμης μεταξύ τους, (r= 0.76 – 0.86, p<0.05). Επιπρόσθετα, έγινε συσχέτιση όλων των παραμέτρων της οστικής πυκνότητας με την ηλικία των εξεταζόμενων γυναικών, όπου σημειώθηκαν ικανοποιητικές αρνητικές συσχετίσεις, (r= -0.66 - -0.73, p<0.05). Ακόμα, σημειώθηκε ικανοποιητική θετική συσχέτιση του εγκάρσιου χρόνου χαλάρωσης T2*, ιδιαίτερα για την περιοχή της κνήμης, με την ηλικία των εξεταζόμενων γυναικών (r= 0.59 – 0.67, p<0.05). Για το σύστημα των 3Τ, ο χρόνος Τ2* στην περιοχή της οσφυϊκής μοίρας ήταν μικρότερος στην ομάδα ελέγχου (4,9 ± 0,4 ms) σε σχέση με την ομάδα Β των μετεμμηνοπαυσιακών γυναικών (5,5 ± 0,8 ms). Για τους χρόνους Τ2, η διαφοροποίηση φάνηκε να είναι πιο ξεκάθαρη, καθώς για την ομάδα ελέγχου, ο χρόνος Τ2 ήταν 65,7 ± 2,4 ms, ενώ για την ομάδα Β 84,7 ± 2,7 ms. Για τις μετρήσεις στην περιοχή της κνήμης, οι χρόνοι Τ2* που καταγράφηκαν ήταν 7,8 ± 0,6 ms για την ομάδα ελέγχου και 9,4 ± 0,4 ms για την ομάδα Β και την mFFE ακολουθία. Αντίστοιχα για την shortest ακολουθία οι χρόνοι χαλάρωσης ήταν 9,0 ± 0,5 ms και 10,8 ± 0,4 ms. Ωστόσο, η διαφορά στους χρόνους Τ2 των δυο ομάδων δεν επέτρεψε τον ασφαλή διαχωρισμό τους, με κριτήριο τον χρόνο αυτό. Για το σύστημα του 1.5 Τ, ο χρόνος Τ2* στην περιοχή της οσφυϊκής μοίρας ήταν μικρότερος στην ομάδα ελέγχου (14,0 ± 1,5 ms) σε σχέση με την ομάδα Γ των μετεμμηνοπαυσιακών γυναικών (20,4 ± 1,2 ms). Αντιθέτως, τα αποτελέσματα των χρόνων Τ2, δεν προσέφεραν κάποιο ξεκάθαρο συμπέρασμα. Αναφορικά με τις μετρήσεις της κνήμης, παρατηρήθηκαν ικανοποιητικές διαφορές μεταξύ των χρόνων Τ2* των δυο ομάδων και για τις δυο ακολουθίες (mFFE και mFFE shortest). Οι χρόνοι που σημειώθηκαν ήταν 16,7 ± 1,2 ms για την ομάδα ελέγχου και 20,9 ± 1,7 ms για την ομάδα Γ και την mFFE ακολουθία. Αντίστοιχα, για την shortest ακολουθία οι χρόνοι χαλάρωσης ήταν 16,5 ± 1,2 ms και 20,6 ± 1,6 ms. Επίσης, η διαφορά των χρόνων Τ2 των δυο ομάδων ήταν ικανοποιητική, (91,6 ± 2,4 ms για την ομάδα Α και 99,0 ± 2,8 ms για την ομάδα Γ). Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη απέδειξε πως μέσω του φαινομένου της αποκατάστασης μαγνητικού συντονισμού και κατ’ επέκταση της μέτρησης των εγκάρσιων χρόνων αποκατάστασης (χαλάρωσης) T2* και T2, μπορούν να εκτιμηθούν μεταβολές της κατάστασης των οστών που σχετίζονται με την ηλικία και την οστική πυκνότητα, μεταξύ υγιών και μετεμμηνοπαυσιακών γυναικών. / Osteoporosis is the most common metabolic bone disorder leading to increased fragility and consequently to low energy fractures. The most common osteoporotic fractures occur in the wrist joint, the vertebrae and the hip, i.e. bones in which the ratio of trabecular and cortical bone is specific. Because of the problem magnitude, there is great interest in assessing osteoporosis and hence the prediction of the fracture risk. A number of different techniques have been developed to measure different skeletal sites as a tool for assessing the fracture risk. The dual energy X-ray absorptiometry (DXA) is the most frequently used technique for the diagnosis of osteoporosis by evaluating the bone mineral density BMD. However, in reality, only 60% of the variation in bone strength can be explained by variations in areal bone density. In this study, we mainly stood in dual energy X-ray absorptiometry, peripheral quantitative computed tomography (pQCT) and magnetic resonance imaging (MRI). Clinical and experimental studies have shown that magnetic resonance imaging has the potential to be a useful method for the study of trabecular bone. The technical background of this method can be explained by the differences in the magnetic susceptibilities between the inter-surfaces of trabecular bone and bone marrow, leading to spatial inhomogeneities of the magnetic field. These inhomogeneities result in additional dephasing of transverse magnetization. The change in Τ2* together with the characteristics of this relaxation time, provide information on the density and structure of trabecular bone matrix (ms). The main objectives of this study were: a) To determine the ability of the active transverse relaxation time Τ2* measurements, to achieve discrimination between women with normal or osteoporotic trabecular bone architecture. b) The correlation of the transverse relaxation time Τ2* with aBMD, vBMD and Trabecular Density indicators, obtained through DXA and pQCT examinations, respectively. c) The assessment of Τ2* magnetic resonance measurements accuracy in certain parts of the human body, with primary target the area of lumbar spine and tibia. After the approval of Ethics and Research Committees of Attikon University Hospital and K.A.T. General Hospital, 15 postmenopausal women and 5 healthy, which formed the control group, participated in our study. All the participants performed the pQCT tibia and lumbar spine bone mineral density examinations, at the same pQCT and DXA systems of K.A.T. General Hospital. Then, for the magnetic resonance imaging examination conduct of lumbar spine – tibia, the 15 postmenopausal women were divided into two groups. The group A, consisting of 9 postmenopausal women, conducted the MRI examinations at the MRI scanner of Eugenedion Hospital and respectively, the group B, consisting of 6 postmenopausal women performed the MRI scans at the MRI scanner of Attikon University Hospital. The group of the 5 healthy subjects performed the examination in both magnetic resonance imaging scanners in order to investigate whether the magnetic field affects the parameters that were to be calculated. To calculate the BMD of the lumbar spine, anteroposterior views of the lumbar spine and more specifically of the lumbar vertebrae L1 - L4 were obtained. The mean BMD of L1 - L4 and the BMD for each vertebra separately, were calculated. Additionally, for each patient, the data resulting from the study of the section 4% of the tibia length from the lower articular surface were taken into account. The section 4% provides information on the trabecular bone and the proposed parameters which were collected were the volumetric density of the trabecular bone (trabecular density) and the total bone density (total density, vBMD). In magnetic resonance imaging, multiple echoes (multi echo) and multiple slices (multi slice) sequences were received for measuring the transverse relaxation time Τ2*, without fat suppression in transverse and coronal plane. Thereafter, for assessing the transverse relaxation time Τ2, Τ2 - weighted anatomical sequences were received, without fat suppression in transverse and coronal plane. In the central section corresponding to 4% of the tibia length from the lower articular surface and in the central sections of lumbar vertebrae L1 - L4, were designed regions of interest (ROI) in all different TE images. Then, using the IDL software, Levenberg - Marquadt analysis algorithm was held, in which Τ2* and Τ2 times were calculated. The results in this study show a significant positive correlation between the parameters of lumbar spine and tibia bone density, (r = 0.76 - 0.86, p <0.05). Additionally, there was correlation of all parameters of bone mineral density with the age of the examined women, where there were sufficient negative correlations, (r = -0.66 - -0.73, p <0.05). Still, there has been good correlation between the transverse relaxation time Τ2*, especially for the region of the tibia, with the age of the examined women (r = 0.59 - 0.67, p <0.05). For the system of 3T, the Τ2* time, in the lumbar spine, was lower in the control group (4,9 ± 0,4 ms) compared to the group B of postmenopausal women (5,5 ± 0,8 ms). For the Τ2 time, the differentiation seemed to be clearer, as for the control group, the Τ2 was 65,7 ± 2,4 ms, while for group B 84,7 ± 2,7 ms. For the tibia measurements, Τ2* times which were recorded, were 7,8 ± 0,6 ms for the control group and 9,4 ± 0,4 ms for group B and the mFFE sequence. Respectively, for the shortest sequence, relaxation times were 9,0 ± 0,5 ms and 10,8 ± 0,4 ms. However, the Τ2 time difference for the two groups, did not allow safe separation, based on this time. For the system of 1.5 T, the Τ2* time, in the lumbar spine, was lower in the control group (14,0 ± 1,5 ms) compared to the group C of postmenopausal women (20,4 ± 1,2 ms). In contrast, the Τ2 time results, did not offer a clear conclusion. Regarding the tibia measurements, there were seen satisfactory differences between the Τ2* times of the two groups, for both sequences (mFFE and mFFE shortest). The recorded times were 16,7 ± 1,2 ms for the control group and 20,9 ± 1,7 ms for group C, for the mFFE sequence. Respectively, for the shortest sequence the relaxation times was 16,5 ± 1,2 ms and 20,6 ± 1,6 ms. Also, the Τ2 time difference between the two groups was satisfactory, (91,6 ± 2,4 ms for group A and 99,0 ± 2,8 ms for group C). In conclusion, this study demonstrated that, through the phenomenon of magnetic resonance recovery and hence the measurement of the transverse recovery (relaxation) times Τ2* and Τ2, can assess changes in bone status related to age and bone mineral density, between healthy and postmenopausal women.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιλαμβάνεται το αποτέλεσμα εκτεταμένης συγκριτικής μελέτης των μεθόδων που χρησιμοποιούνται στη διάγνωση της εισαγωγής και της εξέλιξης της οστεοπόρωσης. Η οστεοπόρωση, όπως και όλες οι μεταβολικές νόσοι των οστών, αποτελούν ένα σημαντικό πρόβλημα της παγκόσμιας υγείας. Πολλές τεχνικές έχουν προταθεί και εφαρμόζονται για τη διάγνωση της οστεοπόρωσης αλλά και για την παρακολούθηση της εξέλιξής της, με ταυτόχρονη αξιολόγηση της επίδρασης των θεραπευτικών αγωγών. Η μέθοδος της μέτρησης του Μορφικού Συντελεστή Απόσβεσης αποτελεί μια τεχνική γνωστή στην παγκόσμια βιβλιογραφία για την εκτίμηση της ποιότητας των κατασκευών με μη καταστροφικό τρόπο. Η διερεύνηση της δυνατότητας εφαρμογής της μεθόδου στην αξιολόγηση της δομικής ακεραιότητας των οστών με παράλληλη ανάπτυξη θεωρητικού μοντέλου το οποίο υποστηρίζει την ορθότητα των πειραματικών αποτελεσμάτων αποτέλεσε το βασικό στόχο της έρευνας. Ειδικότερα, περιλαμβάνεται αναλυτική έρευνα βιβλιογραφίας στην περιοχή του μη καταστροφικού ελέγχου συμβατικών κατασκευών και υλικών, και ανάπτυξη των κυριότερων τεχνικών που εφαρμόζονται στην καθημερινή κλινική πρακτική για τον διαγνωστικό έλεγχο της οστεοπόρωσης και γενικότερα των παθήσεων του μυοσκελετικού συστήματος [τεχνικές πυκνομετρίας (pQCT, DEXA, QUS, κ.λ.π) αλλά και τεχνικές που ανιχνεύουν μεταβολές των οστών σε επίπεδο αρχιτεκτονικής (ιστομορφομετρία) και σε μοριακό επίπεδο (βιοχημικοί δείκτες), καθώς και φασματοσκοπία Raman] με τα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα κάθε μεθόδου. Λόγω της πολυπλοκότητας του υλικού του οστού, παρατίθενται αναλυτικά οι μηχανικές του ιδιότητες. Στη συνέχεια αναπτύσσεται το θεωρητικό μοντέλο υπολογισμού του Μορφικού Συντελεστή Απόσβεσης και παρουσιάζεται το εκτεταμένο πειραματικό μοντέλο που εφαρμόστηκε σε επίμυες και γυναίκες. Από τη σύγκριση των πειραματικών αποτελεσμάτων της μεθόδου του Συντελεστή Απόσβεσης και των συμβατικών τεχνικών που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση της οστεοπόρωσης με τις αναλυτικές τιμές υπολογισμού του Συντελεστή Απόσβεσης αναδεικνύεται η υψηλή ευαισθησία της προτεινόμενης μεθόδου και τεκμηριώνεται η ωριμότητά της για αποτελεσματική, επαναλήψιμη, έγκυρη και αξιόπιστη αξιολόγηση της δομικής ακεραιότητας των οστών. / Extended comparative study of the methods used in the diagnosis of osteoporosis is included in this thesis. Osteoporosis, as well as all metabolic diseases of bones, consist an important health problem. Many techniques have been proposed and are applied for monitoring of osteoporosis with simultaneous assessment of the effect of therapeutical treatment. Measurement of Modal Damping Factor is a worldwide known technique for the non destructive assessment of structural integrity. The potential of application of this method on the assessment of structural integrity of bones, in combination with development of theoretical model supporting the experimental results has been the main target of this research. Specifically, in the frame of the research, a thorough state of the art has been elaborated in the domain of non destructive testing of conventional structures and materials, as well as on the main techniques applied on everyday clinical practice for diagnosis of osteoporosis and of metabolic diseases of bones [bone density techniques (pQCT, DEXA, QUS), techniques detecting architectural changes (histomorphometry), molecular changes (biochemical markers) and Raman Spectroscopy], accompanied by the advantages and disadvantages of each approach. Due to the complexity of bone structure, its mechanical properties are presented, accompanied by the theoretical model, from which the Modal Damping Factor is calculated, and the experimental model that was applied on osteoporotic rats and women. The comparison between experimental results of Modal Damping Factor and of data from conventional methods used for diagnosis of osteoporosis with the analytical values of Modal Damping Factor permits for elevating the high sensitivity of the proposed method and documenting its maturity for effective, repetitive, and accurate assessment of bone structural integrity.

Σκοπός: Πρόσφατα δεδομένα, υποδεικνύουν ότι διαταραχή της ισορροπίας του λιπιδικού μεταβολισμού επηρεάζει τη λειτουργία των κυττάρων του οστού, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη εκφυλιστικών και μεταβολικών νόσων, όπως η οστεοπόρωση. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε τον ρόλου της απολιποπρωτεΐνης Ε (apoE), βασικού συστατικού του συστήματος μεταβολισμού των χυλομικρών και της VLDL (Very Low-Density Lipoprotein), στη ρύθμιση της οστικής ανακατασκευής και στην παθογένεια της οστεοπόρωσης, σε πειραματικά μοντέλα ποντικιών που έλαβαν δίαιτα πλούσια σε λιπαρά. Υλικά και μέθοδοι: Για τον λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα ποντικών με έλλειψη του γονιδίου της apoE (apoE-/-) και αγρίου τύπου (C57BL/6) (ομάδα ελέγχου) που τους χορηγήθηκε για 24 εβδομάδες δίαιτα δυτικού τύπου (WTD) πλούσια σε λιπαρά (10 ζώα/ομάδα). Επιλέχθηκε η δίαιτα δυτικού τύπου διότι προσομοιάζει τις διατροφικές συνήθειες του σύγχρονου δυτικού κόσμου. Κάθε 6 εβδομάδες γινόταν μέτρηση σωματικού βάρους. Δύο και επτά ημέρες προ της ευθανασίας πραγματοποιήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση καλσεΐνης. Την 24η εβδομάδα τα ζώα θυσιάστηκαν, απομονώθηκαν χειρουργικά το μηριαίο οστό και οι οσφυϊκοί σπόνδυλοι και έγιναν ιστολογικές και ιστομορφομετρικές αναλύσεις. Με τη χρήση microCT scanner (στατική ιστομορφομετρία) εκτιμήθηκε η ποιότητα και η ποσότητα του σπογγώδους και του φλοιώδους οστού. Με τη χρώση TRAP και την εναπόθεση καλσεΐνης (δυναμική ιστομορφομετρία) ελέγχθηκε η οστική αποδόμηση και ο ρυθμός σύνθεσης νεοσχηματιζόμενου οστού, αντίστοιχα. Με τη χρήση φασματοσκοπίας Raman, αξιολογήθηκε η κατάσταση του δικτύου κολλαγόνου των μηριαίων οστών. Επιπλέον, μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των οστών (BMMSC) απομονώθηκαν από το μηριαίο οστό των πειραματόζωων και καλλιεργήθηκαν με σκοπό την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, μορίων που εμπλέκονται στην οστεοβλαστική λειτουργία [(Runx2, Osterix (Osx), Κολλαγόνο I τύπου 1a (Col1a1)], στην οστεοκλαστική λειτουργία [osteprotegerin (OPG), RANK-Ligand (RANKL), λόγος OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin Κ] καθώς και στην λιπογένεση [Peroxisome-Proliferator-Activated receptor γ (PPARγ)]. Για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήσαμε τις μοριακές τεχνικές Western Blot και κυτταρομετρία ροής ενώ για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA χρησιμοποιήσαμε τη RT-PCR. Αποτελέσματα: 1) Τα apoE-/- πειραματόζωα που έλαβαν WTD δεν ανέπτυξαν παχυσαρκία σε αντίθεση με τα C57BL/6 WTD. 2) Στον μυελό των οστών των apoE-/- WTD ποντικιών παρατηρήθηκε πλήρης απουσία λιποκυττάρων, σε αντίθεση με τα C57BL/6 WTD ζώα των οποίων ο μυελός των οστών ήταν πλούσιος σε λιποκύτταρα. 3) Ο αριθμός των οστεοκλαστών ήταν σημαντικά αυξημένος, ενώ των οστεοβλαστών σημαντικά ελαττωμένος στα apoE-/- WTD πειραματόζωα σε σύγκριση με τα C57BL/6 WTD. 4) Η στατική και η δυναμική ιστομορφομετρία έδειξαν ότι τα apoE-/- ποντίκια, σε δίαιτα δυτικού τύπου, εμφάνισαν σημαντική ελάττωση της οστικής τους μάζας. 5) Το δίκτυο του κολλαγόνου στα apoE-/- WTD ποντίκια εμφανίστηκε σημαντικά πιο σκληρό, πιο άκαμπτο και κατά συνέπεια λιγότερο ελαστικό συγκρινόμενο με αυτό των C57BL/6 WTD. 6) Τα apoE-/- WTD ποντίκια, εμφάνισαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης του ρυθμιστή της οστεοβλαστογένεσης Runx2, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, συγκρινόμενα με τα C57BL/6 WTD ζώα. 7) Τα επίπεδα έκφρασης των ρυθμιστών της οστικής ανακατασκευής RANK και RANKL, ήταν σημαντικά αυξημένα στα apoE-/- WTD ποντίκια σε σχέση με τα C57BL/6 WTD ποντίκια. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της OPG καθώς και η αναλογία OPG/RANKL, ήταν σημαντικά μειωμένα στα apoE-/- WTD ποντίκια. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των οστεοκλαστικών ρυθμιστών cathepsin K και TRAP μεταξύ των δύο υπό εξέταση ομάδων ζώων. 8) Ο ρυθμιστής της λιπογένεσης PPARγ, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, ήταν σημαντικά μειωμένος στα apoE-/- WTD ποντίκια σε σχέση με τα C57BL/6 WTD. Συμπεράσματα: 1) Η έλλειψη της apoE εμπλέκεται στην ελάττωση της οστικής μάζας σε ποντίκια υπό δίαιτα δυτικού τύπου 2) Η apoE φαίνεται ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της λειτουργίας των οστεοβλαστών, ενώ δεν είναι σαφής ο ρόλος της στη λειτουργία των οστεοκλαστών 3) Η έλλειψη της apoE, προστατεύει από την παχυσαρκία αλλά και την εναπόθεση λιποκυττάρων στον μυελό των οστών, κατόπιν λήψεως δίαιτας πλούσιας σε λιπαρά. 4) Η apoE ρυθμίζει τη διαφοροποίηση των MSC’s σε ερχόμενο στάδιο, καθώς η έλλειψή της επηρεάζει τόσο την οστεοβλαστική όσο και τη λιποβλαστική διαφοροποίηση, μετά από κατανάλωση δίαιτας δυτικού τύπου, πλούσιας σε λιπαρά. / Introduction: Recent data suggest that lipid metabolism imbalances affect bone cell function and therefore may result in the development of metabolic diseases such as osteoporosis. In the present study, we investigated the role of apoE, a plasma protein playing cardinal role in lipoprotein metabolism, in the regulation of osteoblasts, osteoclasts and lipoblasts and in the pathogenesis of osteoporosis. Material and Methods: We used apoE deficient (apoE-/-) and wild type (C57BL/6) mice (10 animals/ group). Mice were fed with standard western-type diet (WTD) for 24 weeks. Body weight measurements were obtained every 6 weeks. Two and seven days before euthanasia calcein was injected intraperitonealy for the determination of new bone formation rate. Following sacrifice, lumbar vertebrae and femora were removed and quantitative/qualitative study of the cortical and cancellous bone was performed using microCT scanner. In the tissue sections we perfomed histological (H&E) and histochemical (TRAP) analyses. Static and dynamic histomorphometry were employed for the determination of bone quality and bone cell function. Using Raman spectroscopy, the quality and biochemical composition of the collagen fibers of the examined femora were evaluated. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) were isolated from mice femora and then assessed for the expression of the osteoblastic (Runx2, OSX, Col1a1), osteoclastic (OPG, RANKL, OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin K) and lipoblastic (PPARγ) regulators using Western Blotting, Flow Cytometry and RT-PCR. Results: 1) apoE-/- mice under WTD did not develop obesity and their BM was devoid of adipocytes, in contrast to the control mice. 2) Osteoclast number was significantly increased, while bone synthesis was significantly reduced in apoE-/- compared to the C57BL/6 mice that consumed WTD. 3) Static and dynamic histomorphometry showed that apoE-/- mice had sugnificantly reduced bone mass and impared bone architecture. 4) The collagen network in apoE-/- WTD mice was significantly stiffer and more rigid compared to the C57BL/6 WTD mice. 5) BMMSCs from apoE-/- WTD mice displayed significantly reduced Runx2 expression at both protein and mRNA levels compared to the control group. 6) The expression levels of RANK and RANKL, were significantly elevated in apoE-/- WTD mice compared to C57BL/6 WTD mice. In contrast, the gene expression levels of OPG and the ratio OPG / RANKL, were statistically significantly reduced in apoE-/- WTD mice. No significant differences were observed in the expression of cathepsin K and TRAP genes between the two test groups of animals. 7) The expression of the major lipoblastic regulator PPARγ was significantly reduced in apoE-/- WTD compared to their WT counterparts. Conclusions: 1) Low levels of apoE result in reduced bone mass following WTD. 2) apoE is implicated in the regulation of osteoblast function; nevertheless, its role in osteoclast function warrants further investigation. 3) The absence of apoE prevents obesity and BM adipocity after the consumption of WT (high-fat) diet. 4) apoE deficiency, regulates MSC differentiation at early stages, since its absence affects both the osteoblastic and lipoblastic differentiation, after the consumption of high fat diet.

Σκοπός της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας είναι η μελέτη της εξέλιξης της νόσου της οστεοπόρωσης στη σπονδυλική στήλη με τη χρήση της μεθόδου των πεπερασμένων στοιχείων. Συγκεκριμένα, μοντελοποιείται η εφαρμογή θλιπτικού φορτίου στον δωδέκατο θωρακικό σπόνδυλο ασθενούς με οστεοπόρωση σε δύο διαδοχικές καταστάσεις – πριν και ένα χρόνο μετά την χορήγηση φαρμακευτικής αγωγής. Επιπλέον, κατά τη μελέτη, δοκιμάστηκαν διαφορετικές αποδόσεις μηχανικών ιδιοτήτων (μέτρο ελαστικότητας και βαθμός ανισοτροπίας) στο οστό, αρχικά στο μοντέλο ενός υγιούς σπονδύλου και στη συνέχεια στο εν λόγω μοντέλο του οστεοπορωτικού. Όλα τα μοντέλα κατασκευάστηκαν με την ίδια μεθοδολογία. Η σύγκριση τόσο των δύο καταστάσεων της νόσου, όσο και των διαφορετικών αποδόσεων των μηχανικών ιδιοτήτων, γίνεται βάσει των ισοδύναμων Τάσεων και Παραμορφώσεων κατά von Mises και των Μετατοπίσεων κατά τον οβελιαίο άξονα z. Οι υπό εξέταση μέγιστες τιμές των προαναφερθέντων μεγεθών που προκύπτουν από την ανάλυση πεπερασμένων στοιχείων, παρουσιάζουν μείωση στη δεύτερη κατάσταση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της διαφορετικής απόδοσης μηχανικών ιδιοτήτων, μαρτυρούν ότι ο βαθμός ανισοτροπίας και ο τρόπος συσχέτισης του μέτρου ελαστικότητας με την οστική πυκνότητα, επηρεάζουν το αποτέλεσμα της μηχανικής ανάλυσης. Παρόλα αυτά, η συγκριτική αξιολόγηση των δύο διαδοχικών καταστάσεων του σπονδύλου δεν φαίνεται να επηρεάζεται από τον τρόπο ορισμού των μηχανικών ιδιοτήτων. Γενικά, η αλλαγή που παρατηρείται στις αξονικές τομογραφίες της δεύτερης κατάστασης σε σχέση με την πρώτη σε συνδυασμό με τη μεταβολή των υπό εξέταση μεγεθών, ιδιαίτερα της ισοδύναμης Παραμόρφωσης κατά von Mises, οδηγούν στο συμπέρασμα ότι στη δεύτερη κατάσταση ο υπό εξέταση σπόνδυλος καταπονείται λιγότερο που σημαίνει ότι η ακολουθούμενη φαρμακευτική αγωγή έχει θετικά αποτελέσματα. / The purpose of this master thesis is to perform a computational (finite element, FEM) study on the progress of the spinal osteoporosis, between two sequential examinations consisting of CT scanning. For this purpose, two finite element models of the twelfth thoracic vertebra of a patient with osteoporosis were created, one for every examination – before and one year after the prescription of medication – and compression loading was simulated. Moreover, a material sensitivity study has taken place, first on a FE model of a healthy vertebra and then on the two models of the osteoporotic one. All FE models were created with the same methodology. For the comparison of the two sequential examinations, as well as of the different material assignment, three mechanical quantities were used: equivalent von Mises Stress, equivalent von Mises Strain and Displacement on the sagittal axis (z). From the output of FE analysis, it seems that the maximum values of the beforementioned quantities decrease in the second model of the osteoporotic vertebra. Also, it becomes clear that the degree of anisotropy and the correlation of bone mineral density vs. Young’s modulus, significantly affect the output of FE analysis. However, the comparison of the two osteoporotic models is not affected by the material assignment. As a conclusion, there is a remarkable change in the CT scans of the second examination combined with a reduction of the strains in the vertebra - coming as a result of the FE analysis - that shows the positive influence of the prescribed medication.

Ένα από τα βασικά χαρακτηριστικά της ομόζυγης β-θαλασσαιμίας είναι η οστεοπάθεια, η οποία αποτελεί μία πολυπαραγοντική διαταραχή, που δεν έχει πλήρως διευκρινισθεί. Μελετήσαμε τους οσφυϊκούς σπονδύλους 48 ασθενών με τις μεθόδους Dual-Energy X-ray Absorptiometry (DXA) και Quantitative Computed Tomography (QCT), και εστιάσαμε στις δομικές οστικές ιδιότητες, όπως προσδιορίζονται από την υψηλής ευκρίνειας Υπολογιστική τομογραφία (HRCT). Οι τιμές της οστικής πυκνότητας (BMD values) εκφράσθηκαν ως Z-scores και τα αποτελέσματα συσχετίσθηκαν. Εκτιμήθηκε η επίδραση της ηλικίας, του φύλου, του τύπου της θαλασσαιμίας και των ορμονικών παραγόντων στις τιμές ΒΜD. Αξιολογήσαμε, με βάση την HRCT, την ακεραιότητα του φλοιού και τον αριθμό και πάχος των δοκίδων της σπογγώδους ουσίας. Με βάση τον αριθμό των δοκίδων ταξινομήσαμε τους ασθενείς σε κλίμακα τριών βαθμίδων. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο συνολικός επιπολασμός της οστεοπόρωσης με την μέθοδο DXA ήταν 44 % και με την QCT 6 %. Και οι δύο μέθοδοι έδειξαν μία αρνητική συσχέτιση μεταξύ της ηλικίας και της BMD, ενώ οι ορμονικοί παράγοντες παρουσίασαν συσχετίσεις τόσο με τις μετρήσεις της QCT όσο και με τις αντίστοιχες της DXA. Ο συντελεστής συσχέτισης μεταξύ της BMD της DXA και της σπογγώδους BMD της QCT ήταν 0,545 (p<0,001) ενώ η αντίστοιχη τιμή για τα Ζ-scores ήταν 0,491 (p<0,001). Η ομαδοποίηση των ασθενών σε φυσιολογικούς, οστεοπενικούς και οστεοπορωτικούς, με βάση το Ζ της QCT, ήταν σε καλύτερη συμφωνία με την ταξινόμηση με βάση τον αριθμό των δοκίδων (K=0,209, p=0,053), σε σύγκριση με την ομαδοποίηση σύμφωνα με το Ζ της μεθόδου DXA (K=0,145, p=0,120). Η εκτίμηση του φλοιού με την HRCT έδειξε διακοπές στη συνέχειά του σε 15 ασθενείς. Και οι δύο μέθοδοι δείχνουν μία επιδείνωση της οστεοπόρωσης με την πρόοδο της ηλικίας. Η ανεπάρκεια των ορμονών συσχετίζεται με την θαλασσαιμική οστεοπόρωση, ενώ η οτπική εκτίμηση του φλοιώδους οστού δείχνει ότι οι ενδιάμεσου τύπου θαλασσαιμικοί πάσχουν σε μεγαλύτερο βαθμό από τους ασθενείς με μείζονα μορφή θαλασσαιμίας. Με τον αριθμό των δοκίδων ως δείκτη οστεοπόρωσης, φαίνεται ότι η QCT μπορεί να εκτιμήσει την οστεοπάθεια καλύτερα από την DXA. Δεδομένου ότι η QCT έχει την ικανότητα να μετρήσει την οστική πυκνότητα του σπογγώδους και φλοιώδους οστού, ξεχωριστά, μπορεί να παρέχει πρώιμη ένδειξη του ποιο από τα δύο μεταβάλλεται πιο γρήγορα και σε τι βαθμό. - / Osteopathy, as a major feature of homozygous beta-thalassaemia, is a multifactorial disorder, not fully understood. We studied the lumbar vertebrae of 48 patients using Dual-Energy X-ray Absorptiometry (DXA) and Quantitative Computed Tomography (QCT), and we focused on structural properties, assessed by High Resolution Computed Tomography (HRCT). Bone Mineral Density (BMD) values were expressed as Z scores and the results were correlated. The effect of age, sex, type of thalassaemia and hormonal factors on BMD was assessed. We estimated, with HRCT, the cortex integrity and the number and thickness of trabeculae; the latter were classified to a three-grade scale. Our results showed the overall prevalence of osteoporosis to be 44 % with DXA and 6 % with QCT. Both techniques revealed an inverse correlation between age and BMD, whereas hormonal factors demonstrated associations with QCT and DXA measurements. The correlation coefficient between DXA’s BMD and QCT’s trabecular BMD was 0.545 (p<0.001) whereas the corresponding value for Z scores was r=0.491 (p<0.001). The classification of the patients into normal, osteopenic and osteoporotic categories, using QCT’s Z, was in better agreement with the assignment based on trabecular number (K=0.209, p=0.053) than the classification using DXA’s Z (K=0.145, p=0.120). Cortex evaluation by HRCT showed discontinuity in 15 patients. Both methods indicate a progression of osteoporosis with age. Hormonal deficiency is associated with thalassaemic osteoporosis whereas the visual estimation of cortex indicate that TI could be more affected than TM. Using the trabecular number as an indicator of osteoporosis, it seems that QCT may evaluate osteopathy better than DXA. Since the former has the ability to measure trabecular and cortical BMD separately, it could give early indication of which changes more rapidly and to what degree.

Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η επίδραση της ατορβαστατίνης στην εξέλιξη της οστεοπόρωσης. Ως πειραματικό μοντέλο επιλέχθηκε ο επίμυς, που, κατόπιν, απώλειας των οιστρογόνων λόγω ωοθηκεκτομής, αναπτύσσει οστεοπόρωση. Η επαγωγή της οστεοπόρωσης επιβεβαιώθηκε με πληθώρα μεθόδων. Αρχικά, (ημέρα 0) στο πειραματικό δείγμα (n=25) πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις, στο αίμα, των βιοχημικών δεικτών του μεταβολισμού του οστού, (Αμινοτελικό πεπτίδιο του κολλαγόνου Τύπου Ι – NTx και οστεοκαλσίνη) με τη μέθοδο ELISA, μέτρηση της οστικής πυκνότητας με τη μέθοδο pQCT και αξιολόγηση της δομικής ακεραιότητας – ποιότητας του οστού με τη μέθοδο MDF. Ακολούθησε η αφαίρεση των ωοθηκών άμφω και, μετά από 60 ημέρες, επαναλήφθηκαν οι παραπάνω μετρήσεις. Όλες οι παραπάνω μέθοδοι, επιβεβαίωσαν την επαγωγή της οστεοπόρωσης μετά την ωοθηκεκτομή, και, άρα, την επιτυχία του πειραματικού μοντέλου. Αφού εξασφαλίσθηκε το οστεοπορωτικό μοντέλο, ο πειραματικός πληθυσμός χωρίστηκε τυχαία σε τρεις υπο-πληθυσμούς. Στον ένα υπο-πληθυσμό (n=10) χορηγήθηκε ατορβαστατίνη (4mg/kg/ημέρα), στον δεύτερο υπο-πληθυσμό (n=10) χορηγήθηκε αλενδρονάτη (4mg/kg/ημέρα), ενώ ο τρίτος υπο-πληθυσμός (n=5) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας και δεν έλαβε καμία θεραπεία (no-therapy control). Η χορήγηση των φαρμακευτικών αγωγών ήταν δια στόματος μέσω στοματογαστρικού καθετήρα και διήρκεσε από την ημέρα 60 έως την ημέρα 145. Μετά το πέρας χορήγησης των φαρμακευτικών αγωγών, επαναλήφθηκαν οι προαναφερθείσες μετρήσεις, τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν και απομονώθηκαν οστά κνήμης για ιστολογική μελέτη, καθώς και μελέτη πρωτεϊνικών μορίων που εμπλέκονται στην κυτταρική βιολογία των κυττάρων του οστίτη ιστού. Συγκεκριμένα, η ιστολογική μελέτη συμπεριελάμβανε εκτίμηση των οστών με χρώση αιματοξυλίνης – ηωσίνης σε τομές παραφίνης, ιστομορφομετρία, ανοσοϊστοχημική χρώση των μορίων Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) και Fas (παράγοντας οστεοκλαστικής απόπτωσης) σε τομές σε πλαστικό, καθώς και ανοσοαποτύπωση κατά Western των αυτών πρωτεϊνών. Γενικά, όλες οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν, έδειξαν να ακολουθούν όλες τις μεταβολές στην δομική – ποιοτική κατάσταση των οστών, καθ’όλη την πειραματική πορεία. Ιδιάιτερη ευαισθησία στην ανίχνευση των μεταβολών αυτών, φάνηκε να παρουσιάζουν οι βιοχημικοί δείκτες του οστικού μεταβολισμού, αλλά και η νέα μέθοδος μέτρησης του Συντελεστή Εσωτερικής Απόσβεσης (MDF). Όσον αφορά στις φαρμακευτικές αγωγές, και η ατορβαστατίνη και η αλενδρονάτη παρουσίασαν θετική επίδραση στην εξέλιξη της οστεοπόρωσης, επιβραδύνοντάς την. Ειδικότερα, η ομάδα που έλαβε ατορβαστατίνη επέδειξε μια ισχυρότερη απόκριση στη χορήγηση της ουσίας, συγκριτικά με την ομάδα που έλαβε αλενδρονάτη. Προς την ίδια κατεύθυνση, φάνηκε να τείνουν και τα ευρήματα σχετικά με την έκφραση της BMP-2 και του Fas, αφού η ατορβαστατίνη ήταν η ουσία εκείνη που αύξησε την έκφραση και των δυο αυτών μορίων και, συνεπώς, την παραγωγή οστού από τους οστεοβλάστες και την απόπτωση των οστεοκλαστών. Στο σημείο αυτό θα ήταν σκόπιμο να σημειωθεί πως τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής είναι ενδεικτικά και θα μπορούσαν να ισχυροποιηθούν με εφαρμογή των πειραματικών μεθόδων σε μεγαλύτερο πειραματικό δείγμα, μεγαλύτερη διάρκεια χορήγησης των φαρμάκων και δοκιμές διαφορετικών δόσεων αυτών. / The effects of the administration of atorvastatin on the development of ovariectomy-induced osteoporosis were evaluated in this study. The ovariectomized rat was employed as the experimental model. The development of osteoporosis, following ovariectomy was confirmed by a plethora of experimental methods and techniques. Initially (day 0), the experimental population (n=25) was submitted to blood measurements of the bone biochemical markers, NTx and osteocalcin (ELISA protocol), bone density measurements by pQCT and assessment of bone structural integrity with MDF methodology. MDF (Modal Damping Factor) is a new analytical and arithmetic method, based on the measurement of the dynamic characteristics of bone (quality factor and modal damping factor) by applying vibration excitation in the range of acoustic frequencies. Ovariectomy was performed to all test animals, and 60 days later, the same biochemical and radiological measurements were repeated. All the above methodologies confirmed the development of osteoporosis renderring, thus, the experimental animal model successful. Since osteoporosis had been confirmed, the experimental population was randomly divided (two cases to one control) into 3 sub-populations. The first sub-population (n=10) was administered atorvastatin (4mg/kg/day), the second sub-population (n=10) was administered alendronate (4mg/kg/day), whereas the third sub-population (n=5) was not administered any drug (no-therapy control). Drug administration was oral by gavage, from day 60 up to day 145. At the end of therapy, the test animals were again tested for levels of bone biochemical markers NTx and osteocalcin, and submitted to pQCT and MDF evaluation. They were, then, euthanized and tibiae were isolated for further histological studies. Specificly, histology studies included the evaluation of bone quality by eosin – hematoxylin staining of paraffin – embedded tibia sections, Histomorphometry, immunohistochemistry of methyl-methacrylate – embedded sections and Western Blotting for Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) and apoptotic factor Fas. In general, all methods applied followed the changes in bone integrity and quality, throughout the whole experimental course. Higher sensitivity in detecting these changes was exhibited by the bone biochemical markers and the new MDF method. With regard to the therapeutical agents administered, both atorvastatin and alendronate seemed to have a positive impact on the progression of osteoporosis, decelerating it. Especially, the atorvastatin – treated group presented a greated response to the administration of the drug, compared to the alendronate – treated one. The findings concerning the expression of BMP-2 and Fas, seemed to point to the same direction, since atorvastatin administration increased the levels of BMP-2 and Fas expression, increasing, thus, the bone production and osteoclast apoptosis, respectively. At this point, it would be wise to notice that our results are indicative, not conclusive and could be fortified by application of the methods used on a larger experimental sample size, longer administration of the drugs and tests of different drug dosages.

- / -

Το αξιόπιστο πειραματικό μοντέλο της ωοθηκεκτομής σε επίμυες εφαρμόστηκε για τη μελέτη των παθογενετικών μηχανισμών της οστεοπόρωσης. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση του ρόλου της λεπτίνης και των κυτοκινών RANKL και οστεοπροτεγερίνης (OPG) στην εξέλιξη της οστεοπόρωσης. Για την διεκπεραίωση της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν 40 ενήλικοι θηλυκοί επίμυες ηλικίας 9 μηνών. Πριν την ωοθηκεκτομή στους επίμυες εφαρμόστηκε η τεχνική της ποσοτικής υπολογιστικής τομογραφίας (pQCT) παράλληλα με την πρωτοποριακή μη επεμβατική τεχνική του θερμοδυναμικού συντελεστή εσωτερικής απόσβεσης (MDF) ώστε να διαπιστωθεί η κατάσταση της οστικής πυκνότητας των πειραματόζωων. Σε χρονικά διαστήματα 20, 40 και 60 ημερών μετά την ωοθηκεκτομή πραγματοποιήθηκαν τυχαίες ομαδικές θυσίες με σκοπό τη συλλογή αίματος και την απομόνωση μηριαίων οστών και οστών κνήμης. Την 60η ημέρα πριν τη θυσία στην τελευταία ομάδα των ωοθηκεκτομήθέντων επίμυων επαναλήφθηκαν οι μετρήσεις pQCT και MDF για να διαπιστωθεί η εγκατάσταση σοβαρής οστεοπόρωσης με τη λήξη της πειραματικής πορείας. Οι οροί αίματος που συλλέχθηκαν από όλα τα χρονικά πειραματικά σημεία χρησιμοποιήθηκαν για τη διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης των βιοχημικών δεικτών του οστικού μεταβολισμού NTx και οστεοκαλσίνης καθώς και της ελεύθερης λεπτίνης με την τεχνική της ενζυμικής ανοσοπροσρόφησης (ELISA). Στα οστά της κνήμης εφαρμόστηκε η τεχνική της ιστομορφομετρίας για τη μελέτη των μεταβολών της μικροαρχιτεκτονικής δομής των οστών κατά την εξέλιξη της οστεοπόρωσης. Επιπρόσθετα η τεχνική της ανοσοϊστοχημείας εφαρμόστηκε στα οστά της κνήμης για τη διερεύνηση των μεταβολών που προκαλεί η ωοθηκεκτομή στα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα της λεπτίνης και των κυτοκινών RANKL και οστεοπροτεγερίνης στους οστικούς κυτταρικούς πληθυσμούς. Στα μηριαία οστά εφαρμόστηκαν οι τεχνικές της ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE electrophoresis) και του ανοσοστυπώματος (Western Blot) για να συλλεχθούν επιπλέον πληροφορίες σχετικά με τις μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα της λεπτίνης και των κυτοκινών RANKL και οστεοπροτεγερίνης κατά την εξέλιξη της οτεοπόρωσης. Τα συμπεράσματα που διεξάγονται από τα επιμέρους πειραματικά δεδομένα επιβεβαιώνουν την υπόθεση ότι η λεπτίνη κατέχει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του οστικού μεταβολισμού και συμμετέχει ενεργά μέσω κάποιου άγνωστου μέχρι στιγμής μηχανισμού στη διαδικασία της οστικής ανακατασκευής στην οστεοπόρωση. Όσον αφορά τις ρυθμιστικές κυτοκίνες της οστεοκλαστογένεσης RANKL και OPG, διαπιστώθηκε ότι μεταβάλλονται σημαντικά κατά την εξέλιξη της οστεοπόρωσης στους ωοθηκεκτομηθέντες επίμυες, υποδηλώνοντας τη σημαντικότητα του ρόλου τους στον οστικό μεταβολισμό. / Ovariectomy in mature rats mimics the changes in bone metabolism observed in postmenopausal women and results in osteoporosis. The aim of this thesis was to investigate the role of leptin and the cytokine RANKL and Osteoprotegerin (OPG) in the progression of ovariectomy-induced osteoporosis. Nine–month-old female Wistar rats were bilaterally ovariectomized (n=40). Before the operation, pQCT and MDF technology were applied on rats in order to estimate the bone mineral density of the animals. On days 20, 40 and 60 after the operation the rats were randomly sacrificed and blood samples, dissected knees and femurs were collected. On day 60, pQCT and MDF techniques were applied in order to confirm the establishment of severe osteoporosis until the end of the experimental procedure. Leptin, and the biochemical markers of bone metabolism, osteocalcin and NTx, were measured in blood serum from all time points, by an ELISA method. Bone sections from the knees of the rats were examined by histomorphometric techniques in order to investigate the alterations in the micro-architectural structure of the skeleton caused by ovariectomy. Furthermore, immunohistochemistry was applied on knee sections and SDS-PAGE electrophoresis and western blot techniques were performed in femur homogenized tissueς, in order to investigate whether the expression levels of leptin receptor, RANKL and OPG were altered during the progression of osteoporosis. The results indicate that leptin is involved in the molecular mechanisms of bone remodeling in osteoporosis. The regulators of osteoclastogenesis, RANKL and OPG are also important players in the field of bone metabolism