Spelling suggestions: "subject:"στόχους"" "subject:"στόχου""
1 |
Παρασκευή και μελέτη σταθερότητας ανοσολιποσωμάτων με μονοκλωνικό αντίσωμα OX26 και πεπτίδια ApoE3 στην επιφάνειά τουςΠαπαδιά, Κωνσταντίνα 07 June 2013 (has links)
Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η παρασκευή και μελέτη λιποσωμάτων διπλής στόχευσης με το μονοκλωνικό αντίσωμα Ox-26 και με πεπτιδικό ανάλογο της Απολιποτρωτεΐνης Ε3 (ApoE3) στην επιφάνειά τους, για στόχευση των υποδοχέων της τρανσφερρίνης (TfR) και της Απολιποτρωτεΐνης (LDL) αντίστοιχα, και η μελέτη πιθανής συνεργικής δράσης των δύο προσδετών.
Για την ακινητοποίηση των προσδετών στην επιφάνεια των λιποσωμάτων, χρησιμοποιήθηκαν δύο μεθοδολογίες. Η αλληλεπίδραση βιοτίνης-στρεπταβιδίνης-βιοτινυλιωμένου αντισωματος για την πρόσδεση του Ox-26 και η τεχνική της δημιουργίας θειοαιθερικού δεσμού (μέσω πρόσδεσης της κυστεΐνης του πεπτιδίου σε ομάδα μαλεϊμίδιου που υπάρχει σε λιπιδικό παράγωγο πολθαιθυλενογλυκόλης, το οποίο προστίθεται στη λιπιδική μεμβράνη κατα τη διάρκεια παρασκευής των λιποσωμάτων). Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε η απόδοση της πρόσδεσης αυτών, ακολουθώντας δύο πορείες με σκοπό την επίτευξη μέγιστης πρόσδεσης και για τους δύο προσδέτες.
Τα λιποσώματα χαρακτηρίστηκαν ως προς το μέγεθος, το ζ-δυναμικό, καθώς και τη σταθερότητά τους παρουσία πρωτεϊνών ορού. Το μέσο μέγεθος των λιποσωμάτων προσδιορίστηκε μεταξύ 150-200nm. Τόσο το μέγεθος, όσο και η σταθερότητα των λιποσωμικών μορφώμ
Πραγματοποιήθηκαν μελέτες πρόσληψης με τη χρήση ανθρώπινων αθανατοπιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων του εγκεφάλου, hCMEC/d3, όπου η πρόσληψη των λιποσωμάτων που φέρουν και τους δύο προσδέτες παρουσιάζεται μεγαλύτερη συγκριτικά με τα λιποσώματα που φέρουν μόνο έναν προσδέτη στην επιφάνεια τους, όπως επίσης και σε σύγκριση με απλά λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας στο αίμα, που δεν φέρουν κανένα ειδικό προσδέτη.
Πραγματοποιήθηκαν, επίσης, μελέτες τοξικότητας όλων των λιποσωμικών μορφών, οι οποίες απέδειξαν πως όλοι οι τύποι λιποσωμάτων που αναπτύχθηκαν δεν εμφανίζουν τοξικότητα προς τα κύτταρα, σε συνθήκες παρόμοιες με αυτές στις οποίες πραγματοποιήθηκαν τα in vitro πειράματα, αποδεικνύοντας ότι το πειραματικό αποτέλεσμα (αυξημένη πρόσληψη των λιποσωμάτων με διπλό σύστημα προσδετών από κύτταρα του εγκεφάλου) δεν οφείλεται σε τοξικότητα.
Τελικό συμπέρασμα της παρούσας διατριβής είναι ότι η χρήση δύο διαφορετικών προσδετών στο ίδιο λιπόσωμα προσφέρει μεγαλύτερη ικανότητα στόχευσης του αιματεγκεφαλικού φραγμού, και πιθανώς μεγαλύτερη δυνατότητα διαπέρασης στον εγκέφαλο. / The aim of this study is the preparation of dually decorated liposomes with Ox26 monoclonal antibody and ApoE 3 derivative peptide on their surface and the investigation of a higher targeting potential of Blood Brain Barrier (BBB), as they are targeting both transferrin (Tfr) and apolipoprotein (LDLr) receptors.
Two methods were used for the preparation of dually decorated liposomes. Biotin-streptavidin-biotinilated Mab, for Ox26 aattachement, and maleimide-cysteine-peptide for attachment of the ApoE3 peptide derivative. Two procedures were followed in order to achieve high attachment yield of both ligands, as calculated by ELISA technique for Ox26 and fluorescence intensity for ApoE.
All types of liposomes were characterized for their size, z-potential and their stability in PBS or in the presence of serum proteins. Mean diameter of all types of liposomes was between 150-200nm, and their integrity and stability were found to be adequate for in vivo use.
Uptake studies were performed by using hCMEC/d3 cell line. The uptake of ApoE liposomes or Ox26 liposomes, is demonstrated to be higher compare to the uptake of plain pegylated liposomes, while the uptake is further increased when both two ligands are immobilized on the same vesicle.
MTT studies were also performed for all types of liposomes and proved that all the liposomal types developed herein were non toxic for the cells, in the same conditions as used in all in-vitro studies.
|
2 |
Μελέτη υβριδικών μαγνητικών νανοσωματιδίων για την ελεγχόμενη χορήγηση αντικαρκινικών ουσιώνΑναγνώστου, Ελένη-Χριστίνα 29 April 2014 (has links)
Στο τομέα της νανοϊατρικής ένας από τους σημαντικότερους στόχους είναι η ανάπτυξη φαρμακευτικών νανοφορέων που θα μεταφέρουν και θα αποδεσμεύουν εκλεκτικά το φάρμακο στον πάσχοντα ιστό. Η χορήγηση δοξορουβικίνης (Dox), για παράδειγμα, εμφανίζει σημαντικά προβλήματα έλλειψης εκλεκτικότητας και συστημικής τοξικότητας. Μία πιθανή προσέγγιση για την περισσότερο εκλεκτική χορήγηση της Dox στους καρκινικούς όγκους είναι η χορήγηση της μετά τον εγκλεισμό της σε μαγνητικά στοχευόμενους νανοφορείς.
Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ειδίκευσης ήταν η μελέτη μαγνητικών νανοφορέων με βάση συμπολυμερή πολύ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολύ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(MAA-g-EGMA) με διαφορετικά χαρακτηριστικά πολυμερικού κελύφους και ο προσδιορισμός εκείνων των χαρακτηριστικών που προσδίδουν στους νανοφορείς βέλτιστη συμπεριφορά. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η σταθερότητα των μαγνητικών νανοφορέων με διαφορετικό μήκος αλυσίδων πολύ(αιθυλενογλυκόλης) και διαφορετική πυκνότητα αρνητικού φορτίου σε διάφορα μέσα όπως υδατικά διαλύματα χλωριούχου νατρίου (ΝαCl), ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS), δοξορουβικίνης καθώς επίσης και σε υδατικά διαλύματα διαφόρων τιμών pH. Μελετήθηκε επίσης η φόρτωση του φαρμάκου σε αυτούς καθώς επίσης και η αποδέσμευση του από τους συγκεκριμένους νανοφορείς σε διάφορα μέσα (νερό, υδατικό διάλυμα PBS και διάλυμα αλβουμίνης σε PBS). Οι νανοφορείς παρασκευάστηκαν μέσω πρόσδεσης του συμπολυμερούς πολυ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολυ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(MAA-g-EGMA) στην επιφάνεια νανοκρυσταλλιτών Fe2O3 κατά τη διάρκεια ανάπτυξής τους. Η μελέτη της σταθερότητας έγινε με τη μέθοδο της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Η μελέτη της φόρτωσης και της αποδέσμευσης του φαρμάκου στους και από τους νανοφορείς έγινε με τη μέθοδο της φασματοφωτομετρίας φθορισμού.
Στο πρώτο κεφάλαιο παρουσιάζονται συνοπτικά τα διάφορα είδη νανοφορέων, οι ιδιότητες καθώς και οι εφαρμογές αυτών. Γίνεται επίσης μια σύντομη βιβλιογραφική ανασκόπηση σε ότι αφορά τη φόρτωση και αποδέσμευση φαρμάκων από νανοφορείς.
Το δεύτερο κεφάλαιο είναι αφιερωμένο στις τεχνικές και τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν στα πλάισια της συγκεκριμένης εργασίας καθώς επίσης και των πειραματικών διαδικασιών.Τέλος, το τρίτο κεφάλαιο αφορά στην παράθεση και τον σχολιασμό των αποτελεσμάτων,τα οποία μπορούν να συνοψιστούν στα εξής συμπεράσματα:
Οι μαγνητικοί νανοφορείς με βάση συμπολυμερή πολύ(μεθακρυλικού οξέος)-g-πολύ(μεθακρυλικής αιθυλενογλυκόλης) (p(MAA-g-EGMA) έχουν ικανοποιητικά
7
χαρακτηριστικά μεγέθους και ζ δυναμικού για παρατεταμένη παραμονή στην κυκλοφορία μετά από ενδοφλέβια χορήγηση, γεγονός που αποτελεί προϋπόθεση για την εφαρμογή τους ως συστήματα εκλεκτικής μεταφοράς (στόχευσης) αντικαρκινικών φαρμάκων.
Οι υψηλές τιμές φόρτωσης της δοξορουβικίνης στους νανοφορείς με υψηλή πυκνότητα ανιονικών φορτίων, λόγω ισχυρότερων ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων με το θετικά φορτισμένο φάρμακο αποτελεί σημαντικό πλεονέκτημα των νανοφορέων αυτών σαν συστήματα χορήγησης δοξορουβικίνης.
Η αύξηση του ρυθμού αποδέσμευσης της δοξορουβικίνης από τους νανοφορείς σε διαλύματα αλβουμίνης με ελάττωση του pH είναι σημαντική καθώς παρέχει τη δυνατότητα μιας σχετικά εκλεκτικής διάθεσης του φαρμάκου στους καρκινικούς όγκους όπου επικρατούν συνθήκες χαμηλότερου από το το φυσιολογικό pH.
Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα που λήφθηκαν δικαιολογούν την περαιτέρω μελέτη των μαγνητικών νανοφορέων δοξορουμπικίνης για την καταλληλότητά τους ως φορείς στοχευμένης χορήγησης του φαρμάκου σε καρκινικούς όγκους. / In the field of nanomedicine, one of the most important targets is the development of functional nanoassemblies which will deliver and release selectively the drug to the suffering tissue. For example, the administration of doxorubicin (Dox) displays lack of selectivity and systemic toxicity issues. A possible approach towards a more selective delivery of Dox to the target tissue is its encapsulation at magnetically targeted nanoparticles.
The present postgraduate thesis’ aim was the study of magnetic nanocarriers based on copolymers of poly(methacrylic acid)- graft -poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(MAA -g- EGMA)) with different structural characteristics and the determination of those characteristics, that impart to the nanocarriers the optimal performance. Specifically, the stability of magnetic nanoparticles, with different chain length of poly(ethyleneglycol) and different density of negative charges, was studied at various media such as NaCl, pH and Dox concentration. The drug loading in the nanocarriers was also studied, as well as its release by the specific nanocarriers at various media (distilled water, PBS and albumin solution in PBS). The nanoparticles were prepared via a self-assembly process of the polymers [poly(methacrylic acid)-graft-poly(ethyleneglycol methacrylate) (p(MAA-g-EGMA)] on the surface of the growing iron oxide nanocrystallites.
The stability studies were performed with the use of DLS technique. The study of the drug loading and release from the nanoparticles was followed using the fluorescence spectroscopy.
In the first chapter, the various types of nanoparticles, their properties, as well as their applications are presented briefly. Additionally, a short literature review with regard to the loading and release of drugs from nanoparticles is presented.
The second chapter refers to the techniques and methods that were utilized in the context of the present thesis, as well as to the experimental procedures. Finally, in the third chapter the experimental results are presented and discussed.
Based on the results of this study:
The magnetic nanocarriers based on copolymers poly(methacrylic acid)- graft -poly(ethyleneglycolmethacrylate) (p(MAA -g- EGMA)) have satisfying characteristics of size and z potential for long blood residence time after an intravenous injection, which is a prerequisite for their application as controlled (targeted) delivery systems for anticancer drugs. The high values of doxorubicin loading without stability loss is an important advantage.
The increase in the release rate of doxorubicin by the nanocarriers in albumin solutions with low pH (5-6) is important, since it facilitates a relatively selective release of the drug in cancer tumors which display lower pH than that of the normal tissues.
In conclusion, the results of the research justify the further in-vitro study of the suitability of the magnetic doxorubicin nanocarriers as selective delivery systems of the drug to the cancer tumors.
|
3 |
Σύνθεση και χαρακτηρισμός φερριτικών νανοκολλοειδών με προσθήκη προσμίξεων ψευδαργύρου και μαγγανίου / Synthesis and characterization of ferrite nanocolloids doped with zinc and manganeseΠαπαϊωάννου, Νικόλαος 10 December 2013 (has links)
Τα δομικά χαρακτηριστικά των μαγνητικών κολλοειδών με βάση το οξείδιο του σιδήρου είναι ιδιαίτερα σημαντικά κατά την χρήση τους σε βιοϊατρικές εφαρμογές όπως η απεικόνιση σε μαγνητικό τομογράφο (MRI), η μεταφορά φαρμάκων, η μαγνητική υπερθερμία και στόχευση. Ιδιαίτερα για την μαγνητική στόχευση, η αύξηση της μαγνήτισης κορεσμού των κολλοειδών είναι ιδιαίτερης σημασίας. Συνεπώς, η μελέτη της σχέσης δομής-ιδιοτήτων είναι απαραίτητη για την περαιτέρω βελτίωση της απόδοσης των εν λόγω συστημάτων στις προαναφερθείσες εφαρμογές. Με στόχο τη βελτίωση της μαγνήτισης κορεσμού αυτών των υλικών έχει μελετηθεί στο παρελθόν μια στρατηγική αντικατάστασης ενός ποσοστού ιόντων σιδήρου στη δομή του νανοκρυστάλλου με άλλα μεταλλικά ιόντα. Οι μελέτες αυτές έχουν δείξει πως αναλόγως της συνθετικής πορείας άλλοτε επιτυγχάνεται το επιθυμητό αποτέλεσμα και άλλοτε όχι. Σε αυτά τα πλαίσια, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η εφαρμογή αυτής της στρατηγικής σε μία συνθετική πορεία ανάπτυξης μαγνητικών νανοκολλοειδών στην οποία δεν έχει εκτιμηθεί μέχρι τώρα η επιτυχία της. Το ενδιαφέρον έγκειται στο γεγονός ότι η συγκεκριμένη συνθετική πορεία οδηγεί σε νανοκρυσταλλίτες οξειδίου του σιδήρου με αυξημένες μαγνητικές ιδιότητες σε σχέση με τη βιβλιογραφία, οι οποίες θα μπορούσαν (πιθανώς) να βελτιωθούν ακόμα περισσότερο με μερική ιοντική αντικατάσταση.
Τα νανοκολλοειδή παρασκευάστηκαν με την μέθοδο της υδρολυτικής αλκαλικής καταβύθισης από μία πρόδρομη ένωση σιδήρου (FeCl2 ή FeSO4), με προσμίξεις διαφόρων αναλογιών με Zn(Cl2/SO4) ή Mn(Cl2/SO4). Η χημική τροποποίηση της επιφάνειας των μαγνητικών νανοκολλοειδών έγινε με στοχευμένη προσθήκη του φυσικού βιοπολυμερούς του αλγινικού νατρίου κατά τη διαδικασία κρυστάλλωσης του ανόργανου μαγνητικού πυρήνα.
Η μελέτη των φυσικοχημικών χαρακτηριστικών και της δομής των νανοφορέων πραγματοποιήθηκε με την χρήση των παρακάτω αναλυτικών τεχνικών: Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (SEM) σε συνδυασμό με Φασματομετρία Ενεργειακής Διασποράς Ακτινοβολίας-X (EDS), Περίθλαση Ακτινοβολίας-X (XRD), Θερμοσταθμική Ανάλυση (TGA), Δυναμική Σκέδαση Φωτός (DLS), Ηλεκτροκινητικές Μετρήσεις, Μαγνητομετρία Δονούμενου Δείγματος (VSM), Μαγνητοφόρηση και Μαγνητική Υπερθερμία Δείγματος. / Structural characteristics of magnetic ferrite nanocolloids are particularly important in biomedical applications such as magnetic resonance imaging (MRI), drug delivery, magnetic hyperthermia and targeting. Particularly about magnetic targeting, increasing saturation magnetization is crucial. Therefore, studying the structure-properties relation of colloids is necessary, in order to improve further the performance of these systems in the above applications. In order to enhance the saturation magnetization of those materials, substitution of a percentage of iron ions in the structure of the nanocrystal with other metal ions has been previously studied. Results have shown that the desired properties are obtained under certain circumstances, depending on the synthetic route. Within this frame, the goal of the present work is to test this strategy on a synthetic route which has not been so far evaluated. The interest lies in the fact that this synthetic route leads to iron oxide nanocrystallites with increased magnetic properties compared to the literature, which could (possibly) be further improved with partial ionic replacement.
Nanocolloids were synthesized by hydrolytic alkaline precipitation from a single iron molecular precursor (FeCl2 or FeSO4), doped at different ratios with Zn(Cl2/SO4) or Mn(Cl2/SO4). The surface modification of the magnetic nanocolloids was performed by in-situ grafting of the natural biopolymer of sodium alginate, during the crystallization process of the inorganic magnetic core.
The evaluation of the structural, magnetic and physicochemical characteristics of the nanocarriers was performed with the use of the following analytical techniques: Scanning Electron Microscopy (SEM) in conjunction with Energy-Dispersive X-Ray Spectrometry (EDS), X-Ray Diffraction (XRD), Thermal Gravimetric Analysis (TGA), Dynamic Light Scattering (DLS), Electrokinetic Measurements, Vibrating Sample Magnetometer (VSM), Magnetophoresis and Magnetic Hyperthermia of the Sample.
|
4 |
Μελέτες επί της τροποποίησης της ενζυμικής δραστικότητας του ριβοενζύμου ριβονουκλεάση Ρ / Studies on the modification of the enzymatic activity of the ribozyme ribonuclease PΤουμπέκη, Χρυσαυγή 28 May 2013 (has links)
Η RNase P είναι το ένζυμο που ωριμάζει το 5΄ άκρο των πρόδρομων μορίων tRNA, ενώ έχει βρεθεί και στις τρεις φυλογενετικές περιοχές, καθώς και σε υποκυτταρικά οργανίδια. Είναι ριβονουκλεοπρωτεϊνικής φύσεως στις περισσότερες περιπτώσεις, ενώ έχουν βρεθεί και ένζυμα RNase P αποκλειστικά πρωτεϊνικής φύσεως. Η υπομονάδα RNA των βακτηριακών ολοενζύμων είναι καταλυτικά ενεργή απουσία πρωτεϊνικών παραγόντων in vitro, καθιστώντας την ένα πραγματικό ριβοένζυμο. Η ικανότητα της RNase P να αναγνωρίζει συγκεκριμένες δομές στα μόρια των υποστρωμάτων της και όχι αλληλουχίες, δημιούργησε τη δυνατότητα χρήσης αυτού του ενζύμου ως ενός μοριακού εργαλείου για τη στόχευση πολλών ιικών και παθολογικών μορίων RNA in vitro και in vivo, καταστέλλοντας την έκφραση των μορίων αυτών, μέσω της τεχνολογίας των μορίων EGS (external guide sequence) και των ριβοενζύμων M1GS.
Η RNase P, σύμφωνα με πολλές μελέτες, έχει δειχθεί ότι αποτελεί στόχο πολλών φαρμακευτικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων πολλών γνωστών αντιβιοτικών, οι οποίοι κατά κύριο λόγο αναστέλλουν τη δραστικότητα του ενζύμου. Πρόσφατα δείχτηκε, μέσω αναλυτικής κινητικής μελέτης, ότι ένα μακρολίδιο, η σπιραμυκίνη, ενεργοποιεί σημαντικά τη δραστικότητα της βακτηριακής RNase P και του M1 RNA κατά ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο, λειτουργώντας έτσι ως μη-ειδικός ενεργοποιητής μικτού τύπου. Μέχρι σήμερα, στη διεθνή βιβλιογραφία, δεν έχει αναφερθεί άλλη ουσία η οποία προκαλεί θετική επίδραση στη δραστικότητα της RNase P. Στην παρούσα μελέτη, αρχικά μελετήθηκε η ενεργοποίηση της δραστικότητας της βακτηριακής RNase P και αποκαλύφθηκε ότι η σπιραμυκίνη δεν αλληλεπιδρά με ιοντικούς δεσμούς με το μόριο Μ1 RNA, αλλά προκαλεί αλλαγή διαμόρφωσης στο δομικό στοιχείο P10/11 του ριβοενζύμου. Το δομικό αυτό στοιχείο εμπλέκεται στην αναγνώριση του υποστρώματος, αποτέλεσμα το οποίο έρχεται σε συμφωνία με τις τιμές KD που προσδιορίστηκαν για το σύμπλοκο ριβοενζύμου–υποστρώματος, απουσία και παρουσία σπιραμυκίνης.
Με δεδομένο ότι η σπιραμυκίνη δεν επηρεάζει την πρωτεϊνοσύνθεση ή τη δραστικότητα της RNase P των ευκαρυωτικών κυττάρων, κατασκευάστηκε ένα ριβοένζυμο M1GS, ώστε να ελεγχθεί η επίδραση του αντιβιοτικού στη δραστικότητα αυτού του ριβοενζύμου in vivo, σε καλλιεργούμενα ανθρώπινα κύτταρα ΗΕΚ293. Ως στόχος του συγκεκριμένου M1GS, επιλέχτηκε ο μεταγραφικός παράγοντας Ets2 λόγω της μεγάλης κλινικής σημασίας του, εφόσον έχει συσχετιστεί με αρκετούς τύπους καρκίνου και παθολογικές καταστάσεις, καθώς και με διαδικασίες διαφοροποίησης. Ο σπουδαίος ρόλος του Ets2, σε συνδυασμό με τα ελλιπή δεδομένα σχετικά με την έκφρασή του, είχαν αποτρέψει μέχρι σήμερα την αποτελεσματική στόχευσή του με τη χρήση των υπαρχουσών μεθοδολογιών που βασίζονται στο RNA, όπως το RNAi.
Μετά από ανάλυση της δευτεροταγούς δομής του Ets2 mRNA, σχεδιάστηκαν δύο οδηγοί αλληλουχίες. Οι αλληλουχίες αυτές, αρχικά, δοκιμάστηκαν ως εξωτερικές οδηγοί αλληλουχίες (EGS) σε συνδυασμό με το βακτηριακό ολοένζυμο της RNase P. Η EGS303 (το νούμερο υποδεικνύει το νουκλεοτιδικό κατάλοιπο του στόχου που δρα η RNase P), εμφάνισε τη μεγαλύτερη ικανότητα να επάγει τη δράση της RNase P in vitro. Η οδηγός αυτή αλληλουχία, στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε στο 3΄ άκρο του M1 RNA, παράγοντας το ριβοένζυμο M1GS303, το οποίο είναι δραστικό έναντι του μορίου–στόχου του in vitro. Η δραστικότητα του συγκεκριμένου ριβοενζύμου ενεργοποιείται εντυπωσιακά κατά 160% παρουσία σπιραμυκίνης. Προκειμένου να ελεγχθεί η δραστικότητα αυτού του ριβοενζύμου in vivo, το μόριο–στόχος και το ριβοένζυμο εκφράστηκαν ελεγχόμενα σε κύτταρα E. coli, προκαλώντας μείωση της έκφρασης του μορίου–στόχου από το M1GS303 κατά 95% μετά από 12 ώρες έκφρασης των μορίων. Μείωση στα ίδια επίπεδα ανιχνεύτηκε μόλις μετά από 4 ώρες έκφρασης εφόσον στα κύτταρα είχε προστεθεί σπιραμυκίνη, γεγονός που υποστηρίζει την εντυπωσιακά θετική επίδραση της σπιραμυκίνης επί της δραστικότητας του ριβοενζύμου.
Η ίδια σειρά πειραμάτων επαναλήφθηκε σε ευκαρυωτικά κύτταρα, με έκφραση του ριβοενζύμου σε HEK293 κύτταρα. Η δραστικότητα του ριβοενζύμου προσδιορίστηκε ποιοτικά και ποσοτικά, από την έκφραση της χιμαιρικής φθορίζουσας πρωτεΐνης Ets2–EGFP (μόριο–στόχος), σε διαφορετικούς χρόνους έκφρασης. Παρατηρήθηκε ότι το M1GS δρα αποτελεσματικά έναντι του μορίου–στόχου του και σε ευκαρυωτικά κύτταρα in vivo, προκαλώντας μείωση στην έκφραση του Ets2, η οποία αυξάνεται επιπλέον παρουσία σπιραμυκίνης. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν τη σημαντική ενεργοποίηση της δραστικότητας του M1GS σε ανθρώπινα κύτταρα και καθιστούν τη σπιραμυκίνη ένα σημαντικό ενεργοποιητή στη χρήση των ριβοενζύμων M1GS ως εργαλεία γονιδιακής αποσιώπησης. Ο συνδυασμός βελτιωμένων ριβοενζύμων M1GS με την παρουσία σπιραμυκίνης αυξάνει ακόμα περισσότερο την πρακτική χρήση της συγκεκριμένης τεχνολογίας τόσο in vitro όσο και in vivo, επιτυγχάνοντας ακόμα πιο αποτελεσματική αποσιώπηση της γονιδιακής έκφρασης. / RNase P is the enzyme that endonucleolytically cleaves the precursor tRNA transcripts to produce their mature 5΄ ends. It has been found in all three phylogenetic domains of life, as well as in subcellular organelles. In most cases, it has been described as a ribonucleoprotein complex. However, few RNase P enzymes that are exclusively proteinaceous have been also reported recentrly. The RNA subunit of bacterial holoenzyme is catalytically active in the absence of protein factors in vitro, making it a true ribozyme. The ability of RNase P to recognize specific structures in its substrate molecules instead of specific sequences, allowed the use of this enzyme as a molecular tool for targeting pathological and viral RNA molecules in vitro and in vivo, by suppressing gene expression through the technology of EGS (external guide sequence) and M1GS ribozymes.
RNase P, according to numerous studies, has been the target of several pharmaceutical agents, including most of the mainstream antibiotics. It has been shown recently, through analytical kinetic studies that the macrolide spiramycin significantly enhances the activity of bacterial RNase P and M1 in a dose dependent manner, acting as a non-specific mixed-type activator. Until now, no other compound has been reported to induce a positive effect on RNase P activity. In the present study, the enhancement of bacterial RNase P activity by spiramycin was tested initially, and it was revealed that spiramycin does not interact with the M1 RNA molecule through ionic bonds. On the contrary, it induces a conformational change of the P10/11 structural element of M1 RNA, which is mainly responsible for substrate recognition. The above results are in agreement with the KD values determined for the ribozyme-substrate complex, in the absence or in the presence of spiramycin.
Since spiramycin does not affect eucaryotic protein synthesis or eucaryotic RNase P activity, an M1GS ribozyme was constructed, in order to examine the effect of spiramycin on the ribozyme activity in vivo, using human HEK293 cells. The target of this M1GS was the transcription factor Ets2, a factor with great clinical importance, since it has been associated with several types of cancer and disease, as well as essential processes during differentiation. The important role of Ets2 in combination with the lack of data on Ets2 expression, had hitherto prevented its effective targeting by using the existing methodologies based on RNA, such as RNAi.
After analysis of the secondary structure of Ets2 mRNA, two guide sequences were designed. These sequences were originally tested in trans as external guide sequences (EGS), in combination with the bacterial RNase P. The EGS303 (the number indicates the nucleotide residue cleaved by RNase P), showed an ability to induce RNase P activity in vitro. The guide sequence was then cloned and fused into the 3' end of M1 RNA ribozyme, thus producing the M1GS303 ribozyme, which was found to be effective against the target molecule. The activity of this specific ribozyme is impressively enhanced by 160% in the presence of spiramycin. In order to examine the activity of this ribozyme in vivo, the expression of the target molecule and the ribozyme were induced in E. coli cells. After 12 hours of expression, a reduced level of the target molecule was detected, because of the M1GS303 activity (about 95%). Reduction to similar levels was observed after only 4 hours from the induction of both molecules expression, in the presence of spiramycin. This observation strongly supports spiramycin’s striking positive effect on the ribozyme activity.
The same set of experiments was repeated in human HEK293 cells. The activity of the ribozyme was determined qualitatively and quantitatively, by the determination of the expression of the chimeric fluorescent protein Ets2-EGFP (target molecule) at different times of expression. The M1GS ribozyme cleaves efficiently the target molecule in human cells as well in vivo, resulting in a reduction in the expression of Ets2, which is further increased in the presence of spiramycin. This result indicates the significant activation of M1GS activity in human cells, making spiramycin an important activator in using M1GS ribozymes as tools in gene silencing. The combination of improved M1GS ribozymes in the presence of spiramycin, further increases the practical utilization of this technology both in vitro and in vivo, thus achieving an even more effective suppression in gene expression.
|
5 |
Μελέτη των παραμέτρων της σύνθεσης υβριδικών κολλοειδών νανοκρυστάλλων με υπερπαραμαγνητικές ιδιότητες για την ανάπτυξη πολυλειτουργικών συστημάτων ελεγχόμενης χορήγησης αντικαρκινικών ουσιώνΣεργίδης, Ανδρέας 28 May 2015 (has links)
Η Πακλιταξέλη (PTX) αποτελεί ένα ευρέως διαδεδομένο αντινεοπλασματικό φάρμακο και ενδείκνυται σε μεταστατικό καρκίνο του μαστού, καρκίνο ωοθηκών, μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και σε σάρκωμα Kaposi ασθενών με AIDS. Παρ’ όλα αυτά, η σημαντική τοξικότητα που εμφανίζει (μυελοκαταστολή, νευροτοξικότητα, αντιδράσεις υπερευαισθησίας), υπογραμμίζει την αναγκαιότητα για μορφοποίησή της σε Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης Φαρμάκων (DDS), με σκοπό τη μείωση των ανεπιθύμητων ενεργειών και την αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας του φαρμάκου.
Τα πολυμερικά μικκύλια έχουν μελετεθεί εκτενώς τα τελευταία χρόνια ως Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης Φαρμάκων. Η ενσωμάτωση υπερπαραμαγνητικών νανοκρυσταλλιτών οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) στον πυρήνα των PTX-μικκυλίων, παρέχει τη δυνατότητα μαγνητικής στόχευσης του φαρμάκου στην επιθυμητή περιοχή δράσης, καθώς και τη θεραπεία του καρκίνου μέσω επαγωγής μαγνητικής υπερθερμίας, με την εφαρμογή εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου. Επιπλεόν, η χρήση των SPIONs ως σκιαγραφικά μέσα (Τ2-contrast enhancement) στη μαγνητική τομογραφία πυρηνικού συντονισμού (MRI), εξασφαλίζει το πλεονέκτημα ταυτόχρονης διάγνωσης και θεραπείας (Theranostics), αποκαλύπτοντας την πολυλειτουργικότητα των συστημάτων αυτών. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς, έχοντας μικρό μέγεθος (100-200nm), θεωρούνται κατάλληλοι για να αποφύγουν την οψωνινοποίηση απο τις λιποπρωτεϊνες του αίματος, την επίθεση απο τα φαγοκύτταρα του Δικτυοενδοθηλιακού συστήματος (RES) καθώς και την ταχεία νεφρική κάθαρση, με αποτέλεσμα την παρατεταμένη κυκλοφορία τους στο αίμα (stealth systems) και την εκλεκτική πρόσληψη τους απο τους συμπαγείς καρκινικούς όγκους, μέσω του φαινομένου της ενισχυμένης διαπερατότητας και κατακράτησης (EPR effect). Οι ιδιότητες αυτές, καθιστούν τα συγκεκριμένα συστήματα πολύτιμα εργαλεία στον τομέα της νανοϊατρικής.
Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή πραγματεύεται τη σύνθεση υδρόφοβων SPIONs μέσω της τεχνικής της θερμικής αποικοδόμησης. Μελετήθηκαν οι συνθετικές παράμετροι (πρόδρομη ένωση, ποσότητα ελαϊκού οξέος, θερμοκρασία και διάρκεια αντίδρασης, ρυθμός αύξησης της θερμοκρασίας κ.α) που επηρεάζουν το μέγεθος, το σχήμα και τη διασπορά του μεγέθους των σχηματιζομένων νανοκρυσταλλιτών (5-13nm, σ: 10-20%), καθώς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη μαγνητική συμπεριφορά των υβριδικών νανονοφορέων. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε σύνθεση υβριδικών νανοφορέων με εγκλωβισμό των SPIONs σε πολυμερικά μικκύλια. Η παρασκευή των υπερπαραμαγνητικών μικκυλίων επιτελέστηκε με την τεχνικη solvent diffusion and evaporation (nanoprecipitation), με χρήση του αμφίφιλου συμπολυμερούς πολυ(γαλακτικό οξύ)-πολυ(αιθυλενογλυκόλη) (PLA-PEG). Στον υδρόφοβο πυρήνα των μικκυλίων (PLA) δεσμεύονται υδρόφοβες ενώσεις (PTX, SPIONs), ενώ το υδρόφιλο κέλυφος (PEG) προσδίδει κολλοειδή σταθερότητα σε υδατικά μέσα (δομή πυρήνα-κελύφους). Διερευνήθηκαν διάφορες συνθετικές παράμετροι (μοριακό βάρος συμπολυμερούς, ποσότητα SPIONs, ρυθμός προσθήκης οργανικής φάσης κ.α) και προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες για την παρασκευή υπερπαραμαγνητικών μικκυλίων μεγέθους <200nm, με αξιοσημείωτη κολλοειδή σταθερότητα (μέχρι και έξι μήνες), σε συνθήκες παρόμοιες με αυτές του ανθρώπινου πλάσματος (pH: 7.4, ιοντική ισχύς: 0.15Μ).
Στο επόμενο στάδιο της παρούσας εργασίας, μελετήθηκαν οι παράγοντες που επηρεάζουν τη φόρτωση-ενκαψυλίωση της PTX και των SPIONs στα πολυμερικά μικκύλια (ποσότητα PTX, ποσότητα και μέγεθος SPIONs, μοριακό βάρος PLA-PEG, ρυθμός προσθήκης οργανικής φάσης κ.α), σε φυσιολογικές συνθήκες (pH:7.4, ιοντική ισχύς: 0.15Μ). Αναπτύχθηκε πρωτόκολλο μέσω του οποίου έγινε κατορθωτός ο διαχωρισμός των μαγνητικών νανοφορέων απο τους μη μαγνητικούς, καθώς και ο υπολογισμός της φόρτωσης-ενκαψυλίωσης PTX και SPIONs ξεχωριστά, τόσο στους μαγνητικούς και μη μαγνητικούς νανοφορείς, όσο και στο μέιγμα αυτών. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς χαρακτηρίζονται απο εξαιρετικά υψηλή απόδοση ενκαψυλίωσης φαρμάκου (93 %wt.) και φόρτωση φαρμάκου που ανέρχεται στο 4.8 %wt. Oι αμιγώς μαγνητικοί νανοφορείς επιδεικνύουν υψηλή απόδοση ενκαψυλίωσης νανοκρυσταλλιτών (70 %wt.), ενώ η φόρτωση σε φάρμακο και SPIONs ανέρχεται σε 5.2 και 20 %wt. αντίστοιχα. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις οι νανοφορείς, μεγέθους (υδροδυναμική διάμετρος) 170nm, χαρακτηρίζονται απο ικανοποιητική μαγνητική συμπεριφορά. Εξετάστηκε η επίδραση του μεγέθους των νανοκρυσταλλιτών στη μαγνητική συμπεριφορά των νανοφορέων. Οι αμιγώς μαγνητικοί νανοφορείς με μεγαλύτερο μέγεθος SPIONs παρουσιάζουν καλύτερη μαγνητική συμπεριφορά.
Τέλος, πραγματοποιήθηκαν μελέτες αποδέσμευσης του φαρμάκου σε PBS (0.14Μ, pH:7.4) στους 37oC και διερευνήθηκε η επίδραση της εφαρμογής εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου στην αποδέσμευση της PTX απο τους μαγνητικούς νανοφορείς (Triggered Drug Release). Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε ελεγχόμενη αποδέσμευση του φαρμάκου για 24 ώρες, σε συνθήκες που προσομοιάζουν με αυτές του πλάσματος. Ο φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των νανοφορέων πραγματοποιήθηκε με HPLC, DLS, TGA, TEM και μαγνητοφόρηση. / Paclitaxel (PTX) is one of the most successful anticancer drugs against a broad range of solid tumors, such as metastatic breast cancer, ovarian cancer, non-small-cell lung cancer and AIDS-related Kaposi sarcoma. However, the serious systematic side effects of PTX (myelosuppression, neurotoxicity, hypersensitivity) underline the need for formulation of PTX in Drug Delivery Systems (DDS), in order to reduce the side effects and increase the bioavailability of the drug.
Among DDS, polymeric micelles have drawn much attention due to their great flexibility in tuning drug solubility, micelle size, targeted drug delivery and stability. Incorporation of Superparamagnetic Iron Oxide Nanocrystals (SPIONs) inside the core of drug-loaded polymeric micelles, imparts to the final Drug Delivery System the prospect of physical (magnetic) targeting, intrinsic therapeutic function (hyperthermia-based cancer therapy under alternating external magnetic field), T2-based contrast enhancement in magnetic resonance imaging (MRI) and remotely triggered drug release. These core-shell polymeric micelles having small size (100-200nm), are considered appropriate for avoiding both opsonization, macrophages attack by ReticuloEndothelial System (RES) and rapid renal clearance, thus allowing micelles to be taken up preferably by solid tumors through Enhanced Permeability and Retention (EPR) effect. Therefore, such nanoassemblies encode high potential in nanomedicine, due to their dual nature (Therapeutic+Diagnostic = Theranostics).
In particular, we have studied the synthesis of organophilic SPIONs through thermal decomposition. The synthetic parameters (precursor, precursor:oleic acid ratio, reaction temperature and duration, heat rate, etc.) affecting the size, shape and size distribution of the nanocrystals have also been examined thoroughly, since they play a key-role concerning the magnetic behavior of the final hybrid. Nanosized SPIONs with narrow size distribution were synthesized (5-13nm, σ: 10-20%). The preparation of poly(lactic acid)-block-poly(ethyleneglycol) (PLA-PEG) micelles encapsulating hydrophobic SPIONs, by varying the molecular weight of the polymers, the amount of SPIONs and the addition rate during micelle assembly, has also been investigated. The core-shell superparamagnetic micelles were prepared through solvent diffusion and evaporation technique (nanoprecipitation). PTX and SPIONs are being incorporated into the micelle’s hydrophobic core (PLA) through hydrophobic interactions, whereas the hydrophilic shell (PEG) stabilizes the micelles in aqueous dispersions, optimizing their colloidal stability and providing prolonged circulating time. The optimum parameters were determined, conferring to the micelles (Hydrodynamic Diameter < 200nm) high colloidal stability (up to six months) at biorelevant conditions (pH:7.4, ionic strenght: 0.15M).
The next phase of the present master thesis focused on studying the factors (amount of PTX and SPIONs, molecular weight of PLA-PEG, addition rate, etc.) affecting the Loading of PTX and SPIONs into the polymeric micelles and how they can be fine-tuned towards high drug loading, while retaining their size at a scale where long circulation would not be precluded. Through protocol establishment, we have managed to separate the magnetic and non magnetic micelles, and to determine individually the loading of PTX and SPIONs for magnetic, non magnetic micelles, as well as for the mixture of them. The micelles’ mixture exhibits very high Drug Encapsulation Efficiency (93 %wt.) and 4.8 %wt. Drug Loading (D.L). Magnetic nanocarriers display high Magnetic Encapsulation Efficiency (70 %wt.), with D.L and Magnetic Loading of 5.2 and 20 %wt. respectively, In both cases, micelles demonstrate adequate magnetic behavior and small sizes (hydrodynamic diameter: 170nm), under conditions which simulate with human plasma (pH:7.4, ionic strenght: 0.15M). The effect of SPIONs’ size on the magnetic behavior of hybrid colloids, was also examined. Magnetic nanocarriers encapsulating SPIONs of greater size exhibit better magnetic behavior.
Finally, we have conducted Drug release studies in PBS (0.14M, pH:7.4) at 37oC. The effect of SPIONs presence on the release profile of PTX, including triggered drug-release by application of AC magnetic field, has also been investigated. PTX-magnetic micelles exhibit Controlled Drug release for 24 hours. Several techniques have been used for the characterization of such nanoassemblies, like: HPLC, DLS, TGA, TEM, XRD, Magnetophoresis and Triggered Drug release by application of AC magnetic field.
|
Page generated in 0.0197 seconds