Resumo: Lipases são enzimas amplamente distribuídas nos seres vivos e apresentam a função biológica de hidrolisar ligações ésteres de triacilgliceróis, liberando diacilgliceróis, monoacilgliceróis, ácidos graxos e glicerol. Dependendo da atividade de água estas enzimas catalisam outras reações como esterificação, transesterificação, aminólise e lactonização, importantes em diversas aplicações biotecnológicas dessas enzimas. Neste trabalho, uma linhagem de Candida viswanathii foi selecionada, entre outras noventa linhagens de fungos filamentosos e leveduras, como produtora de lipase e suas condições de cultivo foram estudadas em cultivos submersos e em substratos sólido, visando o aumento da produção da enzima. Outro objetivo deste trabalho também foi purificar, imobilizar e caracterizar a lipase produzida nas condições estabelecidas em cultivos submersos. Os resultados obtidos nos cultivos submersos indicaram que, entre as substâncias puras testadas, trioleína e ácido oléico foram os melhores indutores da atividade lipase. Contudo, as melhores condições de cultivo e produção de lipase foram alcançadas utilizando azeite de oliva 1,5% (m/v), extrato de levedura 0,2% (m/v), agitação de 210 rpm, pH 6,0, temperatura de 27,5 ºC, após 72 h de cultivo (biomassa 19,0 g/L; atividade 100 U). A adição de 0,1% (m/v) de lecitina de soja aumentou em 1,5 vezes a produção de lipase (147,5 U). A caracterização bioquímica da lipase do caldo fermentado revelou que se tratava de uma lipase ácida com pH ótimo de 3,5, propriedade descrita pela primeira vez para uma lipase do gênero Candida. A temperatura ótima foi de 40 ºC. Esta enzima bruta mostrou-se altamente estável na faixa de pH 4,0 a 5,0 e na temperatura de 40 ºC após 24 h (100%). Nos cultivos sólidos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lipases are widely distributed enzymes in animals, plants, bacteria, yeasts and fungi, which hydrolyses ester bonds of triacylglycerols and fatty acids. In addition, these enzymes also catalyse other reactions as esterification, transesterification, aminolysis and lactonization, depending their water activity. The ability of lipases to perform very specific chemical transformation and their enantioselective properties has made them increasingly popular in many biotechnological applications. In this work, Candida viswanathii was selected among ninety filamentous fungi and yeast strains, due to as its lipase activity and culture conditions were studied aiming to increase the enzyme production. Furthermore, this study aimed to purify, immobilize and characterize the lipase produced in submerged cultures. The results showed that triolein and oleic acid are the best inducers of lipase activity. However, the highest lipase production was obtained from 1.5% (w/v) olive oil and 0.2% (w/v) yeast extract in rotary shaker experiments at 27.5 ºC, pH 6.0 and 210 rpm, after 72 h (19.0 g/L biomass; 100 U lipase activity). The addition of 0.1% (w/v) soy lecithin increased 1.5-fold the lipase production (147.5 U). Biochemical characterization of the crude enzyme revealed an acid lipase with optimum pH of 3.5, a property first described in Candida genus. Optimum temperature activity was 40 ºC. Crude lipase was highly stable at pH 4.0 to 5.0 and at temperature 40 ºC during 24 h (100%). Solid substrates cultures from industrial byproducts, xiv the highest lipase production was obtained in wheat bran and barley spent grain (1:1), 40% (w/w) chicken fat, 3.5% (w/w) yeast extract, humidity 40% after 5 days, at 30°C (153 U/gds). Under these culture conditions, the lipase showed optimum activity at pH 5.0 and 50 ºC, and thermal enzyme stability at pH... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sâmia Maria Tauk-Tornisielo / Coorientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: Carlos Renato Corso / Banca: Cintia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Rosa dos Prazeres Melo Furriel / Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-17Bitstream added on 2014-06-13T18:44:35Z : No. of bitstreams: 1 almeida_af_dr_rcla.pdf: 976430 bytes, checksum: 62d71f04fc87fbdf0fbaee3d090185df (MD5) / Lipases são enzimas amplamente distribuídas nos seres vivos e apresentam a função biológica de hidrolisar ligações ésteres de triacilgliceróis, liberando diacilgliceróis, monoacilgliceróis, ácidos graxos e glicerol. Dependendo da atividade de água estas enzimas catalisam outras reações como esterificação, transesterificação, aminólise e lactonização, importantes em diversas aplicações biotecnológicas dessas enzimas. Neste trabalho, uma linhagem de Candida viswanathii foi selecionada, entre outras noventa linhagens de fungos filamentosos e leveduras, como produtora de lipase e suas condições de cultivo foram estudadas em cultivos submersos e em substratos sólido, visando o aumento da produção da enzima. Outro objetivo deste trabalho também foi purificar, imobilizar e caracterizar a lipase produzida nas condições estabelecidas em cultivos submersos. Os resultados obtidos nos cultivos submersos indicaram que, entre as substâncias puras testadas, trioleína e ácido oléico foram os melhores indutores da atividade lipase. Contudo, as melhores condições de cultivo e produção de lipase foram alcançadas utilizando azeite de oliva 1,5% (m/v), extrato de levedura 0,2% (m/v), agitação de 210 rpm, pH 6,0, temperatura de 27,5 ºC, após 72 h de cultivo (biomassa 19,0 g/L; atividade 100 U). A adição de 0,1% (m/v) de lecitina de soja aumentou em 1,5 vezes a produção de lipase (147,5 U). A caracterização bioquímica da lipase do caldo fermentado revelou que se tratava de uma lipase ácida com pH ótimo de 3,5, propriedade descrita pela primeira vez para uma lipase do gênero Candida. A temperatura ótima foi de 40 ºC. Esta enzima bruta mostrou-se altamente estável na faixa de pH 4,0 a 5,0 e na temperatura de 40 ºC após 24 h (100%). Nos cultivos sólidos... / Lipases are widely distributed enzymes in animals, plants, bacteria, yeasts and fungi, which hydrolyses ester bonds of triacylglycerols and fatty acids. In addition, these enzymes also catalyse other reactions as esterification, transesterification, aminolysis and lactonization, depending their water activity. The ability of lipases to perform very specific chemical transformation and their enantioselective properties has made them increasingly popular in many biotechnological applications. In this work, Candida viswanathii was selected among ninety filamentous fungi and yeast strains, due to as its lipase activity and culture conditions were studied aiming to increase the enzyme production. Furthermore, this study aimed to purify, immobilize and characterize the lipase produced in submerged cultures. The results showed that triolein and oleic acid are the best inducers of lipase activity. However, the highest lipase production was obtained from 1.5% (w/v) olive oil and 0.2% (w/v) yeast extract in rotary shaker experiments at 27.5 ºC, pH 6.0 and 210 rpm, after 72 h (19.0 g/L biomass; 100 U lipase activity). The addition of 0.1% (w/v) soy lecithin increased 1.5-fold the lipase production (147.5 U). Biochemical characterization of the crude enzyme revealed an acid lipase with optimum pH of 3.5, a property first described in Candida genus. Optimum temperature activity was 40 ºC. Crude lipase was highly stable at pH 4.0 to 5.0 and at temperature 40 ºC during 24 h (100%). Solid substrates cultures from industrial byproducts, xiv the highest lipase production was obtained in wheat bran and barley spent grain (1:1), 40% (w/w) chicken fat, 3.5% (w/w) yeast extract, humidity 40% after 5 days, at 30°C (153 U/gds). Under these culture conditions, the lipase showed optimum activity at pH 5.0 and 50 ºC, and thermal enzyme stability at pH... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-20Bitstream added on 2014-06-13T19:14:46Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_bh_me_rcla.pdf: 1162673 bytes, checksum: f5fe030f67c2007c0812e4e797484647 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Dentre as principais enzimas utilizadas em biocatálise destacam-se as lipases, pois apresentam capacidade de catalisar reações tanto em meio aquoso como em meio orgânico. Do ponto de vista econômico e industrial, as lipases obtidas de micro-organismos são as mais utilizadas, devido a sua relativa facilidade de produção e abundância de micro-organismos capazes de sintetizá-las. A principal barreira à implantação de lipases em sistemas de biocatálise é seu custo elevado. A utilização de técnicas como método de planejamento fatorial e análise de superfície tem sido utilizadas para a otimização das condições de cultivo e catálise, visando aumento de atividade e redução de custos de fermentação. Outra estratégia importante tem sido o desenvolvimento de técnicas de imobilização enzimática, permitindo a recuperação e reutilização da enzima após a catálise. A adsorção é a abordagem de imobilização mais utilizada, devido à facilidade de uso e baixo custo. Este trabalho apresenta a otimização da produção de lipase pelo fungo filamentoso Fusarium oxysporum, utilizando delineamento fatorial (DCCR) e análise de superfície de resposta (MSR), a imobilização da enzima em diferentes suportes e a caracterização da lipase imobilizada. Inicialmente, foram estudados separadamente oito fontes de carbono e cinco fontes de nitrogênio. No DCCR foram avaliadas quatro variáveis na produção de lipase: concentração da fonte de carbono, concentração da fonte de nitrogênio, surfactante Triton X-100 e adição de extrato de levedura. Após o estudo de condições de cultivo, a enzima foi imobilizada em diferentes suportes: encapsulação em gel de polióxido de etileno (PEO) e alginato de cálcio e, adsorção em Celite® 545 e Octil Sepharose CL-4B. Neste trabalho também foi estudada a caracterização bioquímica... / Of the main enzymes used in biocatalysis lipases stand out, since they have the ability to catalyze reactions in both aqueous and in organic medium. From the economical and industrial point of view, lipases obtained from microorganisms are the most used due to their relative ease of production and the abundance of microorganisms capable of synthesizing them. The main barrier to implementation of lipases in biocatalysis systems is their high cost. The use of techniques such as method of factorial design and response surface methodology has been used for the optimization of culture conditions and catalysis, aiming to increase activity and reduce costs of fermentation. Another important strategy has been the development of techniques for immobilizing enzymes, allowing the recovery and reuse of the enzyme after catalysis. The adsorption is the approach most widely used for immobilization, due to ease of use and low cost. This work presents the optimization of lipase production by the filamentous fungus Fusarium oxysporum, using central composite design (CCD) and response surface methodology (RSM), the enzyme immobilization in different media and characterization of immobilized lipase. Initially were studied eight separate carbon sources and five nitrogen sources. In CCD four variables were evaluated in the production of lipase: carbon source concentration, nitrogen source concentration, surfactant Triton X-100 and yeast extract adding. After the study of the cultivation conditions, the enzyme was immobilized onto various matrix: encapsulation in polyethylene oxide (PEO) gel and calcium alginate, and adsorption on Celite® 545 and Octyl Sepharose CL-4B. This work also studied partial biochemical characterization of free and immobilized enzyme on Celite. Among the carbon sources studied, the oils that gave the highest values of lipase... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Valéria Marta Gomes de Lima / Banca: Cintia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Alessandra Machado Baron / Resumo: Dentre as principais enzimas utilizadas em biocatálise destacam-se as lipases, pois apresentam capacidade de catalisar reações tanto em meio aquoso como em meio orgânico. Do ponto de vista econômico e industrial, as lipases obtidas de micro-organismos são as mais utilizadas, devido a sua relativa facilidade de produção e abundância de micro-organismos capazes de sintetizá-las. A principal barreira à implantação de lipases em sistemas de biocatálise é seu custo elevado. A utilização de técnicas como método de planejamento fatorial e análise de superfície tem sido utilizadas para a otimização das condições de cultivo e catálise, visando aumento de atividade e redução de custos de fermentação. Outra estratégia importante tem sido o desenvolvimento de técnicas de imobilização enzimática, permitindo a recuperação e reutilização da enzima após a catálise. A adsorção é a abordagem de imobilização mais utilizada, devido à facilidade de uso e baixo custo. Este trabalho apresenta a otimização da produção de lipase pelo fungo filamentoso Fusarium oxysporum, utilizando delineamento fatorial (DCCR) e análise de superfície de resposta (MSR), a imobilização da enzima em diferentes suportes e a caracterização da lipase imobilizada. Inicialmente, foram estudados separadamente oito fontes de carbono e cinco fontes de nitrogênio. No DCCR foram avaliadas quatro variáveis na produção de lipase: concentração da fonte de carbono, concentração da fonte de nitrogênio, surfactante Triton X-100 e adição de extrato de levedura. Após o estudo de condições de cultivo, a enzima foi imobilizada em diferentes suportes: encapsulação em gel de polióxido de etileno (PEO) e alginato de cálcio e, adsorção em Celite® 545 e Octil Sepharose CL-4B. Neste trabalho também foi estudada a caracterização bioquímica... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Of the main enzymes used in biocatalysis lipases stand out, since they have the ability to catalyze reactions in both aqueous and in organic medium. From the economical and industrial point of view, lipases obtained from microorganisms are the most used due to their relative ease of production and the abundance of microorganisms capable of synthesizing them. The main barrier to implementation of lipases in biocatalysis systems is their high cost. The use of techniques such as method of factorial design and response surface methodology has been used for the optimization of culture conditions and catalysis, aiming to increase activity and reduce costs of fermentation. Another important strategy has been the development of techniques for immobilizing enzymes, allowing the recovery and reuse of the enzyme after catalysis. The adsorption is the approach most widely used for immobilization, due to ease of use and low cost. This work presents the optimization of lipase production by the filamentous fungus Fusarium oxysporum, using central composite design (CCD) and response surface methodology (RSM), the enzyme immobilization in different media and characterization of immobilized lipase. Initially were studied eight separate carbon sources and five nitrogen sources. In CCD four variables were evaluated in the production of lipase: carbon source concentration, nitrogen source concentration, surfactant Triton X-100 and yeast extract adding. After the study of the cultivation conditions, the enzyme was immobilized onto various matrix: encapsulation in polyethylene oxide (PEO) gel and calcium alginate, and adsorption on Celite® 545 and Octyl Sepharose CL-4B. This work also studied partial biochemical characterization of free and immobilized enzyme on Celite. Among the carbon sources studied, the oils that gave the highest values of lipase... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Eulazio Mikio Taga / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T05:20:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Buzalaf_MariliaAfonsoRabelo_D.pdf: 5040554 bytes, checksum: 5d7774aeca4271c23aebb3bb510d14d7 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A PTP de BMr do fígado de carneiro foi purificada 1350 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 2,6%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, diálise, cromatografia de troca iônica em SP-Sephadex com eluição por íon afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os critérios de pureza utilizados foram a AE, P AGE, SDSPAGE e filtração em gel (Superdex HR 200). A enzima purificada (AE de 81,18 µmol min-1 mg-1) é composta por uma cadeia polipeptídica simples e possui Mr de 17,4 e 18,3 kDa, como determinado através de filtração em gel e SDS-PAGE, respectivamente. O estudo do efeito do pH na atividade enzimática revelou que o pH ótimo é em tomo de 5,5. A enzima apresentou uma atividade máxima a 50°C. A energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pelo gráfico de Arrhenius, foi de 49,674 kJ mol-1. A adição de BSA (0,1 a 0,75 mg/mL) ao meio de reação enzimática promoveu um incremento de até 40% na atividade enzimática, sendo que concentrações maiores tiveram pouco efeito. Já a adição de BSA ao meio de diluição enzimática elevou a velocidade em até 350%, tendo provocado um ligeiro aumento na Km, praticamente sem interferir com a Ea. A atividade da enzima foi pouco sensível a diversos compostos e íons metálicos, exceto pela ativação por guanosina e inibição por SDS, ácido úrico, Ag+, Hg+, CU2+ e Zn2+. O estudo de inibidores demonstrou insensibilidade ao tartarato e fluoreto e inibição por vanadato (Ki de 0,097µM), fosfato inorgânico (Ki de 0,94 mM), molibdato de amônio (Kic de 12,8 µM e Kia de 2,7 µM) e pCMB. Dos substratos testados, apenas pNPP, ß-Naftil-P, Tyr-P e FMN foram hidrolisados significativamente, com Km de 0,151, 0,726, 3,873e 0,12 mM, no pH 5,0 e 1,861, 4,447, 5,673 e 0,11 mM no pH 7,0, respectivamente. Também houve hidrólise sobre o acetil-P (Km de 0,18 mM) no pH 5,0, entretanto com uma velocidade 100 vezes menor em relação ao pNPP / Abstract: A low molecular weight sheep liver phosphotyrosine protein phosphatase was purified 1350-fold to homogeneity, with 2.6% recovery, by a procedure involving ammonium sulfate fractionation, dialysis, SP-Sephadex ion-exchange chromatography with ion-affinity elution and molecular exclusion chromatography. The following homogeneity criteria were used: specific activity, P AGE, SDS-P AGE and gel filtration (Superdex HR 200). The purified enzyme (specific activity 81,18 µmol min-1 mg-l) contained a single peptide chain and had a relative molecular mass of 17.4 and 18.3 kDa, as determined by gel filtration chromatography and SDS-PAGE, respectively. pNPP hydrolysis cata1yzed by this enzyme had a pH optimum of 5.5 and maximal activity at 50°C. An activation energy value of 49.674 kJ mol-1 for the reaction of pNPP hydrolysis was determined from Arrhenius plot. Addition of BSA (0.1 to 0.75 mg/mL) to enzyme reaction media increased unti140% enzyme activity, but higher concentrations of BSA had a small effect. Addition of BSA to enzyme dilution media increased velocity until 350%, causing a slight increase in Km, without interfering in activation energy. Different compounds and meta1lic ions did not significant1y affect enzyme activity, except for inhibition by SDS, uric acid, Ag+, Hg+,Cu2+ and Zn2+ and activation by guanosine. Enzyme was also inhibited by vanadate (Ki, 0.097 µM), inorganic phosphate (Ki 0.94 µM), ammonium molybdate (Kic, 12.8 µM and Kia, 2.7 µM) and pCMB. Both tartrate and fluoride were very weak inhibitors. Apparent Km values obtained, at 37°C were 0.151, 0.726, 3.873 and 0.12 mM at pH 5.0 and 1.861, 4.447, 5.673 and 0.11 mM, at pH 7.0, for pNPP, ßNaftil-P, Tyr-P and FMN, respectively. Acetyl-P was also hydrolyzed CKm, 0,18 mM) at pH 5.0, but the velocity was 100 times smaller in respect to pNPP / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-07Bitstream added on 2014-06-13T18:44:32Z : No. of bitstreams: 1 leite_rsr_dr_rcla.pdf: 371019 bytes, checksum: 830cbb582aca2919cbcad799c2e9420b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste trabalho as ß-glicosidases produzidas pelos microrganismos Thermoascus aurantiacus e Aureobasidium pullulans foram purificadas, caracterizadas termodinamicamente, físico-quimicamente e aplicadas em terpenos e isoflavonas. O processo de purificação da enzima do T. aurantiacus apresentou rendimento final de 63,6% e fator de purificação de 46,3 vezes. Após a purificação da enzima do A. pullulans, esta apresentou fator de purificação de 35,5 vezes e rendimento de 19%. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou atividade ótima em pH 4,5 a temperatura de 75ºC. Esta manteve-se estável na faixa de pH 4,5 a 6,5 e reteve sua atividade original após 1 hora a 70ºC. A enzima purificada do A. pullulans apresentou maior atividade catalítica nos valores de pH 4,0-4,5 a temperatura de 80ºC. A mesma foi estável em ampla faixa de pH 4,0 a 9,5, e, reteve sua atividade original após 1 hora a 75ºC. A maior termoestabilidade, da enzima produzida pelo microrganismo mesofílico, A. pullulans, foi comprovada pela análise dos parâmetros termodinâmicos. A ß-glicosidase do T. aurantiacus apresentou valores menores de t(1/2), ∆G, ∆H e Ea em todas as temperaturas analisadas. As duas enzimas foram fortemente inibidas por Hg+2 e Ag+, sugerindo que o grupo tiol (SH) é essencial para atividade das mesmas. O pNPßG foi utilizado para a determinação dos parâmetros cinéticos, os valores de Km e Vmax obtidos foram 0,53 mM e 590,8 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do T. aurantiacus, e, 0,93 mM e 29,9 μmol/ min/mg de proteína para a enzima do A. pullulans. A presença de etanol no meio de reação ativou a ß-glicosidase do T. aurantiacus, indicando atividade glicosil transferase, o mesmo não foi observado para enzima do A. pullulans. As duas ß-glicosidases atuaram em diferentes substratos glicosídicos, inclusive sobre terpenos e isoflavonas, o que confirma a ampla especificidade das enzimas. / In this work, ß-glucosidases produced by the microorganisms Thermoascus aurantiacus and Aureobasidium pullulans were purified, thermodynamically and physical-chemically characterized and applied on terpenes and isoflavones. Purification process of the enzyme from T. aurantiacus exhibited final yield of 63.6% and purification factor of 46.3 -fold. Purification process of the enzyme from A. pullulans resulted in 19% yield and purification factor of 35.5-fold. ßglucosidase from T. aurantiacus exhibited optimum activity at pH 4.5 and at temperature of 75ºC. It remained stable at pH range of 4.5 to 6.5 and maintained its original activity after 1 hour at 70ºC. Purified enzyme from A. pullulans exhibited a higher catalytic activity in pH values of 4.0-4.5 at an optimum temperature of 80ºC. It was stable over a wide pH range, from 4.0 to 9.5, and, maintained its original activity after 1 hour at 75ºC. The higher thermal stability of the enzyme produced by the mesophilic microorganism, A. pullulans, was confirmed by analysis of the thermodynamic parameters. ß-glucosidase from T. aurantiacus exhibited lower values for t(1/2), ∆G, ∆H and Ea in all temperatures tested. Both enzymes were strongly inhibited by Hg+2 and Ag+, suggesting that a thiol group (SH) is essential for their activities. pNPßG was used for the kinetic parameters determination and the values for Km and Vmax were 0.53 mM and 590.8 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from T. aurantiacus, and, 0.93 mM and 29.9 μmol/ min/mg of protein for the enzyme from A. pullulans. The presence of ethanol in the reaction mixture activated the ß-glucosidase from T. aurantiacus, indicating glucosil transferase activity, which was not observed for the enzyme from A. pullulans. Both ß-glucosidases exhibited activity on different glucosidic substrates, including terpenes and isoflavones, confirming the broad specificity of the enzymes.

Orientador: Paulo Roberto Bueno / Banca: Ronaldo Censi Faria / Banca: Paulo Olivi / Resumo: Este trabalho está centrado no desenvolvimento, caracterização e utilização de uma superfície composta por monocamada auto-organizada (self assembled monolayer - SAM) de L-cisteína, funcionalizada com a enzima metalo-β-lactamase (MβL). A função designada a este sensor foi de detecção da velocidade da cinética enzimática, em tempo real, da reação da penicilinase com seu substrato, um antibiótico β-lactâmico, por técnica piezelétrica, microbalança a cristal de quartzo (QCM), e por técnicas eletroquímicas. As curvas de progresso foram obtidas pela variação da frequência no cristal de quartzo, demonstrando a cinética em tempo real. Não foram obtidas curvas com perfil hiperbólico, como esperado pelo modelo de Michaelis-Menten, por ambas as técnicas devido às baixas concentrações de substrato utilizadas nas análises. Foram obtidos gráficos com padrões lineares e a partir deles foi possível calcular a constante de Michaelis-Menten ( ). A obtida a partir da técnica eletroquímica mostrou-se mais próxima ao valor fornecido pelo fabricante da enzima. No entanto, pela técnica piezelétrica a foi maior, refletindo em perda de sensibilidade da enzima pelo substrato. / Abstract: The aim of this study was to develop, characterize, and apply the functionalized tranducer imobilized with metalo-β-lactamase (MβL) enzyme using appropriate procedures based on L-cysteine self-assembling monolayer-SAM. The enzymatic activity of MBL under β-lactam antibiotic was measured, on real time, by piezoeletric quartz crystal microbalance (QCM) and eletrochemical techniques. The progress curves were obtained by varying the frequency of quartz crystal. The hyperbolic pattern corresponding to the pattern set on the model of the Michaelis-Menten was not obtained due to low concentration of substrate. On the other side, linear graphic was obtained and the Km was calculated. The Km obtained from electrochemical analyses showed a value similar to manufacturer's instructions of fabricant, and the Km obtained by QCM showed higher, reflecting the lost of sensibility. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-30Bitstream added on 2014-08-13T18:01:30Z : No. of bitstreams: 1 000747006.pdf: 3768762 bytes, checksum: 6cb20d492a096743121ca347a299f63e (MD5) / Este trabalho está centrado no desenvolvimento, caracterização e utilização de uma superfície composta por monocamada auto-organizada (self assembled monolayer – SAM) de L-cisteína, funcionalizada com a enzima metalo-β-lactamase (MβL). A função designada a este sensor foi de detecção da velocidade da cinética enzimática, em tempo real, da reação da penicilinase com seu substrato, um antibiótico β-lactâmico, por técnica piezelétrica, microbalança a cristal de quartzo (QCM), e por técnicas eletroquímicas. As curvas de progresso foram obtidas pela variação da frequência no cristal de quartzo, demonstrando a cinética em tempo real. Não foram obtidas curvas com perfil hiperbólico, como esperado pelo modelo de Michaelis-Menten, por ambas as técnicas devido às baixas concentrações de substrato utilizadas nas análises. Foram obtidos gráficos com padrões lineares e a partir deles foi possível calcular a constante de Michaelis-Menten ( ). A obtida a partir da técnica eletroquímica mostrou-se mais próxima ao valor fornecido pelo fabricante da enzima. No entanto, pela técnica piezelétrica a foi maior, refletindo em perda de sensibilidade da enzima pelo substrato. / The aim of this study was to develop, characterize, and apply the functionalized tranducer imobilized with metalo-β-lactamase (MβL) enzyme using appropriate procedures based on L-cysteine self-assembling monolayer-SAM. The enzymatic activity of MBL under β-lactam antibiotic was measured, on real time, by piezoeletric quartz crystal microbalance (QCM) and eletrochemical techniques. The progress curves were obtained by varying the frequency of quartz crystal. The hyperbolic pattern corresponding to the pattern set on the model of the Michaelis-Menten was not obtained due to low concentration of substrate. On the other side, linear graphic was obtained and the Km was calculated. The Km obtained from electrochemical analyses showed a value similar to manufacturer’s instructions of fabricant, and the Km obtained by QCM showed higher, reflecting the lost of sensibility.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2012-10-22T18:55:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225985.pdf: 2489469 bytes, checksum: f9317609185391153b21ab5ba854dc83 (MD5) / Os ésteres são importantes compostos orgânicos, utilizados em diversos setores industriais como petroquímica, alimentos, cosméticos, tintas e vernizes, entre outros. Uma grande aplicação deles está relacionada à sua utilização como aromas. Quando sintetizados utilizando enzimas como catalisador podem ser considerados aromas naturais, aumentando seu valor no mercado. Nesse trabalho estudou-se a obtenção do éster alifático (aroma) octanoato do n-pentila por esterificação direta utilizando enzima Lipozyme TL IM como catalisador. Foi verificada a influência da concentração inicial dos reagentes (0,1 a 0,95 mol.L-1) na velocidade inicial da reação em função da temperatura de síntese (30, 40 e 50 ºC). A velocidade inicial da reação foi determinada através do consumo de ácido octanóico ao longo do tempo. A concentração de ácido foi determinada por titulação ácido-base com solução alcoólica de KOH e o éster caracterizado por FTIR. Modelos cinéticos encontrados na literatura foram ajustados aos dados experimentais. Os resultados obtidos demonstram que a enzima sofre inibição em concentrações iniciais de substrato acima de 0,65 mol.L-1, para qualquer valor de temperatura utilizada. A velocidade máxima atingida pela reação possui valores aproximados de 0,0067, 0,0092 e 0,0080mol.L-1.min-1 para 30, 40 e 50ºC, respectivamente. O modelo proposto por Wu e colaboradores se adaptou bem ao comportamento reação. Os parâmetros Ki= 0,738 0,032 mol.L-1e n= 17,11 1,83 mostraram ser independentes da temperatura. O parâmetro Vm mostrou ser afetado pelo efeito da temperatura, apresentando valores de 0,0163 (30 ºC), 0,0298 (40ºC) e 0,0155(50ºC)mol.L-1.min-1. Para o parâmetro Ks ele variou de maneira dependente a Vmax atingindo valores de 0,969, 1,473 e 0,702 mol.L-1 para as temperaturas de 30, 40 e 50ºC respectivamente. A enzima pode ser reutilizada por aproximadamente 6, 16 e 26 vezes para as temperaturas de 50, 40 e 30ºC, respectivamente. A maior quantidade de éster produzida pode ser obtida à temperatura de 30ºC (0,057 mol) para bateladas de 10 mL com concentração inicial dos reagentes igual a 0,65 mol.L-1.

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-23. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:11Z : No. of bitstreams: 1 000856545.pdf: 1630760 bytes, checksum: c65e7ba9d827276c90827f03611f61ae (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As lipases (triacilglicerol acil hidrolases, E.C. 3.1.1.3) catalisam a hidrólise das ligações éster de triacigliceróis, operando na interface água/óleo. Estas são enzimas ubíquas, porém as de origem microbiana têm se destacado no cenário industrial atual devido ao seu amplo espectro de aplicação. Dessa maneira, a prospecção de novas fontes de lipases com propriedades distintas é uma linha de pesquisa importante. Dentre os micro-organismos, os fungos vêm sendo explorados para a produção de enzimas por secretarem grandes quantidades de proteínas no meio extracelular que não são nocivas à saúde humana, em sua grande maioria. Este trabalho se insere neste contexto, uma vez que visa purificar e caracterizar as principais propriedades bioquímicas da lipase produzida pelo fungo filamentoso Penicillium sect. Gracilenta CBMAI 1583, isolado de solo de Mata Atlântica e ainda não estudado em relação a essa enzima. O pH e a temperatura ótimos de atividade lipásica foram 4,0 e 70 °C, respectivamente, tanto para a enzima presente no filtrado de cultura quanto para a enzima purificada. As energias de ativação da reação de hidrólise do p-nitrofenil palmitato catalisada pela lipase presente no filtrado de cultura e pela lipase purificada foram 27,01 e 8,77 kJ.mol-1, respectivamente. A enzima do filtrado se mostrou mais estável em relação à temperatura (T(1/2) de 1,5 h, 6,3 e 2,3 min a 50, 60 e 70 °C, respectivamente) e menos estável em relação ao pH (estável apenas entre os pH 5,0 e 7,0) que a enzima purificada. A enzima purificada apresentou T(1/2) de 8,5 min, 33,6 e 15,4 s nas mesmas temperaturas e estabilidade em pH de 2,0 a 8,5. Em relação à estabilidade na presença de surfactantes, os detergentes aniônicos desestabilizaram a estrutura proteica, com consequente perda de atividade, enquanto detergentes não iônicos a 1 % (m/v) ativaram a enzima. A lipase foi purificada em uma única etapa, através de... / Lipases (triacylglycerol acyl hydrolases, EC 3.1.1.3) are ubiquitous enzymes. However microbial enzymes stand out on the current industrial scenario, due to their wide spectrum of application. In this sense, prospection of new sources of lipases with distinct characteristics is an important research field. Among microorganisms, fungi are being explored for enzyme production, because they secrete high amounts of proteins to extracellular medium that are generally regarded as safe for human health. This work is inserted in this context once it aims to purify and to characterize the main biochemical properties of lipase produced by the filamentous fungus Penicillium sect Gracilenta CBMAI 1583, isolated from soil under Atlantic Rainforest and yet not studied in respect to this enzyme. Optima pH and temperature of activity were 4.0 and 70 °C, respectively, for both crude and purified lipase. Activation energys of hydrolysis of pNPP catalyzed by crude and purified lipase were 27.01 and 8.77 KJ.mol-1, respectively. Crude lipase was more stable to temperature (T(1/2) of 1.5 h, 6.3 and 2.3 min at 50, 60 and 70 °C, respectively) and less stable to pH (stable only at pH 5.0 to 7.0), while purified lipase showed the opposite behavior (T(1/2) of 8.5 min, 33.6 and 15.4 s at the same temperatures; and stable at pH 2.0 to 8.5). Regarding the stability in presence of surfactants, anionic detergents destabilized the protein structure with consequent loss of activity, while nonionic detergents at 1 % (w/v) activated the enzyme. Lipase was purified to homogeneity by one step, through a hydrophobic interaction chromatography at low ionic strength using the Phenyl Sepharose resin, as revealed by SDS-PAGE. By this strategy it was possible to recover 80.8 % of initial activity and achieve a purification factor of 516.1. Enzyme molecular mass was estimated to be 52.9 kDa by SDS-PAGE and 85.3 kDa by size exclusion chromatography, suggesting the formation of ...