Submitted by Angela Maria de Oliveira (amolivei@uepg.br) on 2018-07-24T16:47:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Silvia Ap F Albuquerque.pdf: 2057064 bytes, checksum: ca90a9ed638cc415e9baf99ff0b848ab (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-24T16:47:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Silvia Ap F Albuquerque.pdf: 2057064 bytes, checksum: ca90a9ed638cc415e9baf99ff0b848ab (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Rizobactérias promotoras do crescimento vegetal (PGPR) estimulam o desenvolvimento das plantas hospedeiras, e a planta, por sua vez, em conjunto com as condições de cultivo, têm um significativo efeito sobre a estrutura da comunidade bacteriana da rizosfera. Nesse estudo, foi analisada a diversidade de rizobactérias isoladas de milho inoculado com diferentes biofertilizantes e cultivado na presença de diferentes doses de nitrogênio. Além disso, foi avaliado o perfil dos isolados por espectrometria de massa e o potencial de tais isolados na produção de sideróforos, protease, compostos indólicos, cianeto e celulase e na solubilização de fosfato; atividades relacionadas à promoção do crescimento vegetal. Os setenta e sete isolados bacterianos obtidos a partir do uso de cinco diferentes meios de cultivo (JMV, JNFb, NFb, LGI e LGI-P) livres de amônia, foram identificados pelo sequênciamento parcial do gene 16S rRNA. O biofertilizante e as dosagens de nitrogênio não interferiram significativamente na composição da comunidade de bactérias diazotróficas isoladas da rizosfera de milho. O meio JNFb permitiu o isolamento de um número maior de indivíduos, e esses apresentaram maior riqueza e diversidade. Dentre os isolados, houve a predominância das classes β e γProteobacteria, sendo Burkholderia o gênero mais abundante. A análise por espectrometria de massa mostrou potencial para separar gêneros bem representados em nível de estirpe. Mais da metade dos isolados produziram sideróforos (58%) e protease (50,7%); solubilização de fosfatos (36,2%) e aproximadamente um quarto deles (23,1%) foram capaz de produzir celulase. A produção de cianeto de hidrogênio se mostrou bastante rara, sendo detectada em apenas 4,3% dos isolados, todos pertencentes ao gênero Pseudomonas sp. Todas as bactérias analisadas apresentaram ao menos uma atividade e 55% apresentam três ou mais. Análises de componentes principais indicaram que (1) os gêneros Burkholderia sp. e Luteibacter sp., tem correlação significativa (p <0,05 ou p<0,001) com a produção de protease, sideróforos e solubilização de fosfato, (2) Bacillus sp. e Luteibacter sp., com produção de compostos indólicos e celulase e (3) Pseudomonas sp., com produção de protease, cianeto e sideróforos, compostos indólicos e celulase. Diante da demanda de biofertilizantes de gramíneas capazes de substituir parcialmente ou integralmente o uso de fertilizantes químicos, os isolados que apresentaram diversas atividades promotoras do crescimento vegetal se mostram promissores para aplicação como biofertilizante. / Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) stimulate the development of their host plant, and the plant, in turn, together with the culture conditions has a significant effect on rhizospheric bacterial community structure. In this study, the diversity of cultivable bacteria associated with the rizosphere of maize inoculated with different biofertilizers and growth in different nitrogen doses was analyzed. It was also evaluated the mass spectrometry profile of the isolates and their potential to produce siderophores, protease, indole compounds, cyanide and cellulose, and to solubilize phosphate, all activities related to plant growth promotion. The seventy seven bacterial isolates obtained by the use of five different nitrogen-free media (JMV, JNFb, NFb, LGI e LGI-P) were identified by partial sequencing of the 16S rRNA gene. The biofertilizers and the nitrogen doses did not interfere in the composition of the isolated diazotrophs from maize rhizosphere. JNFb medium permitted the isolation of a greater number of individuals, and they presented the highest richness and diversity. Among the isolates, there was a predominance of β e γ-Proteobacteria classes, being Burkholderia the most abundant genus. Mass spectrometry analysis showed potential to separate well represented genus into strain, evidencing new species of the Burkholderia genus. More than half of the isolates produced siderophores (58%) and protease (50.7%); solubilize phosphate (36.2%) and approximately a quarter of them (23.1%) were able to produce cellulase. The hydrogen cyanide production showed to be rare, being detected in only 4.3% of isolates, all belonging to the genus Pseudomonas sp.. All analyzed bacteria showed at least one activity and 55% showed three or more. Principal component analysis indicated that (1) Burkholderia sp. e Luteibacter sp. genus have significant correlation (p <0,05 or p<0,001) with protease and siderophores production and phosphate solubilization, (2) Bacillus sp. and Luteibacter sp. have significant correlation with indole compounds and cellulase production and (3) Pseudomonas sp. has significant correlation with protease, cyanide, siderophores, indole compounds and cellulase production. Based on the demand for grass biofertilizers able to partially or completely replace chemical fertilizers, the isolates which have several activities that promote plant growth are promising to be used as biofertilizer. Some genus clearly they share at least three equal activities featuring redundant function among them.

O objetivo do presente estudo foi avaliar o desempenho, saúde intestinal e metabolizabilidade de dietas para frangos de corte alimentados com o uso contínuo ou mudança brusca de diferentes rações à base de milho e sorgo moído ou inteiro. No Exp. 1 foi estudada a mudança no tipo de grão com as dietas: M100% (ração à base de milho); S100% (ração à base de sorgo); M:S50% (ração à base de 50% milho e 50% sorgo); PS-M (ração à base de sorgo na fase pré-inicial e milho nas demais fases); PM-S (ração à base de milho na fase pré-inicial e sorgo nas demais fases). No Exp. 2 foi estudada a mudança na forma do grão de sorgo: Sm100% (ração à base de sorgo moído); Si100% (ação à base de sorgo inteiro); PSm-Si (ração à base de sorgo moído na fase pré-inicial e inteiro nas demais fases) e PSi- Sm (ração à base de sorgo inteiro na fase pré-inicial e moído nas demais fases). Os experimentos foram conduzidos em um delineamento em blocos casualizados (blocos no tempo) para avaliar o desempenho e epitélio jejunal (r=8), microbiota intestinal (r=4) e metabolizabilidade das dietas (r=10). As mudanças entre milho e sorgo não alteraram o desempenho, epitélio jejunal nem a metabolizabilidade das rações, mas influenciaram a porcentagem de Clostridium, Weissella, Bacillus e Alkaliphilus no intestino delgado e Lactobacillus e Desulfotomaculum nos cecos. O uso de sorgo inteiro piorou o desempenho aos sete dias. Aos 40 dias, Sm100% e PSm-Si apresentaram desempenhos semelhantes, PSi-Sm apresentou menor ganho de peso, mas melhor conversão alimentar e Si100% apresentou o pior desempenho. Si100% e PSm-Si apresentaram aumento no peso relativo da moela e na metabolizabilidade das rações, assim como diminuição de Clostridium e aumento de bactérias das famílias Actinomycetales e Bacillales no intestino delgado, Si100% resultou em menor porcentagem de Alkaliphilus e Enterococcus que Sm100% nos cecos. Conclui-se que a melhor estratégia de uso do sorgo é a substituição total de milho por sorgo moído ao alojamento com posterior mudança para sorgo inteiro, pois não afeta o desempenho e epitélio jejunal das aves, melhora a metabolizabilidade das rações e potencializa a redução de Clostridium no intestino delgado de frangos de corte. / The aim of this study was to evaluate performance, intestinal health and metabolizability of diets in broilers fed different corn- or sorghum (ground or whole)- based diets, continuously or with abrupt change between the diets. Exp. 1 - Change in the type of grain: C100% (corn-based diet); S100% (sorghum-based diet); C:S50% (50% corn and 50% sorghum-based diet); PC-S (corn-based diet in pre-starter phase and sorghum-based diet in other phases); PS-C (sorghum-based diet in pre-starter phase and corn-based diet in other phases). Exp. 2 - Change in the form of sorghum grain: Gs100% (ground sorghum-based diet); Ws100% (whole sorghum-based diet); PGs-Ws (ground sorghum-based diet in pre-starter phase and whole sorghum-based diet in other phases); PWs-Gs (whole sorghum-based diet in pre-starter phase and ground sorghum-based diet in other phases). Experiments were conducted in a randomized block design for to evaluate performance and jejunal epithelium (r=8), intestinal microbiota (r=4) and metabolizabilty of diets (r=10). The changes between corn and sorghum did not affect performance, jejunal epithelium or metabolizability of the diets, but influenced the genera Clostridium, Weissella, Bacillus and Alkaliphilus in the small intestine, and Lactobacillus and Desulfotomaculum in the caecum. Whole sorghum resulted in decreased performance at seven days of age. At 40 days, Gs100% and PGs-Ws showed similar performance, PWs-Gs showed lower weight gain and the best feed conversion rate, and Ws100% showed the worst performance. Ws100% and PGs-Ws resulted in the biggest gizzard relative weight and the highest diet metabolizability values, as well as the lowest level of Clostridium and highest level of Actinomycetales and Bacillales in the small intestine. Ws100% showed lower level of Alkaliphilus and Enterococcus than Gs100% in the caecum. The best strategy to use sorghum in broilers diets is replacing 100% of corn for ground sorghum since the first day followed by change to whole sorghum, because this diet did not affect performance or jejunal epithelium, improved diet metabolizability values, and reduced Clostridium in the small intestine of broilers.

Os gêneros Isocheles e Loxopagurus são endêmicos da América e ocorrem em águas tropicais e subtropicais. Isocheles é composto por cinco espécies, duas encontradas no Atlântico oeste (I. sawayai e I. wurdemanni) e três no Pacífico leste (I. pilosus, I. pacificus, e I. aequimanus). Loxopagurus é um gênero monotípico e ocorre apenas na costa sudeste da América do Sul. Estes dois gêneros são morfologicamente semelhantes, tendo como principal diferença a heteroquelia em Loxopagurus em contraste com a isoquelia de Isocheles. Há poucas informações na literatura sobre estes gêneros, e dúvidas quanto a seu status taxonômico foram recentemente ressuscitadas. Dessa forma este estudo visa elucidar as relações filogenéticas de Isocheles e Loxopagurus e avaliar a sua validade taxonômica. Para isso, foram realizadas análises moleculares utilizando os genes 16S rRNA, COI e H3, e análises morfológicas, buscando caracteres que facilitem a identificação destas espécies, bem como a contextualização de ambos os gêneros dentro da Família. Os tipos de I. aequimanus e I. pilosus foram perdidos e erros de identificação entre as espécies de Isocheles são bem comuns. Assim, foram propostos caracteres que delimitam de maneira clara estas espécies, como ornamentação e formato dos quelípodos e o número de dentes presentes no segundo segmento da antena. A proposição de neótipos não foi necessária, uma vez que não há problemas taxonômicos entre estas espécies que não puderam ser resolvidos com base nas descrições originais e desenhos. Um dos lotes de I. wurdemanni do Museum of Comparative Zoology foi identificado pelo presente estudo como o holótipo da espécie. Isocheles e vii Loxopagurus se mostraram gêneros monofiléticos distintos, com base nos 3 marcadores utilizados, e grupos irmãos dentro de Diogenidae. Além disso, constatou-se que as espécies de Isocheles também formam grupos monofiléticos e uma nova espécie foi encontrada, divergindo tanto morfológica quanto molecularmente das demais. Assim, com base na morfologia, na topologia das árvores geradas e nas distâncias genéticas, conclui-se que, não somente os dois gêneros, mas também as espécies englobadas, são unidades taxonômicas distintas válidas. / The genera Isocheles and Loxopagurus are endemic to America and occur in tropical and subtropical waters. There are five species of Isocheles, two of them are found in West Atlantic (I. sawayai and I. wurdemanni) and three are found in East Pacific (I. pilosus, I. pacificus and I. aequimanus). Loxopagurus is a monotypic genus and occurs only in southeast coast of South America. These two genera are morphologically similar, but the main difference between them is the heterochelia of Loxopagurus, while the chelipeds of Isocheles are similar in shape and size. There are few published information about these genera, and some doubts about their taxonomic status arised recently. Thus, this study aims to elucidate the phylogenetic relationship of Isocheles and Loxopagurus and evaluate their taxonomic validity. For that, molecular analyses were performed based on the genes 16S rRNA, COI and H3, as well as morphological analysis, seeking characters that facilitate the identification of these species, and that contextualize both genera in the family. The type specimens of I. aequimanus and I. pilosus were lost and identification errors are common between Isocheles species. Therefore, characters that clearly delimit these species were stated, as the ornamentation and shape of the chelipeds and the number of teeth in the second segment of the antenna. There was no need to designate neotypes, once there are no taxonomic problems between the species that could not be solved based on the original descriptions and illustrations. Also, we identified that one of the lots of I. wurdemanni from the Museum of Comparative Zoology is the holotype of the species. The analysis based on the three ix molecular markers showed that Isocheles and Loxopagurus are two different monophyletic genera, and sister taxa among Diogenidae. We also verified that each one of the species of Isocheles are monophyletic, and found a new species that differs both molecular and morphologically from the others. Thus, based on the morphology, on the tree topology and on genetic divergences, we concluded that not only the two genera, but also the species that they encompass, are valid taxonomic units.

Devido à gravidade da manifestação clínica e pelas altas taxas de mortalidade em populações de risco, o controle e a prevenção da listeriose, doença causada pela L. monocytogenes, representa um importante desafio às autoridades sanitárias. A dificuldade de recuperar organismos envolvidos nos surtos, a sub-notificação e a demora na realização de análises convencionais são alguns dos fatores que retardam ou impedem intervenções em situações de surto. Com o advento da biologia molecular,novas técnicas têm sido empregadas para a identificação e tipificação da L. monocytogenes, com o intuito de contribuir com os estudos epidemiológicos e de vigilância sanitária de alimentos. O presente estudo visou confirmar a taxonomia e o perfil genotípico de 31 cepas isoladas de diversos tipos de carne, supostamente identificadas como L. monocytogenes, por intermédio das técnicas de Reação de Cadeia pela Polimerase (PCR), com o emprego de iniciadores de identificação dos genes 16S rRNA e Internalina A e B, para confirmação da espécie. Os resultados indicaram que apenas 20 (65%) das cepas foram confirmadas como sendo da espécie investigada. Foi realizada ainda a avaliação de similaridade nas 20 cepas confirmadas, através da Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), que revelou grande diversidade genotípica, caracterizada por 18 diferentes perfis, segundo o coeficiente de similaridade de Pearson. Os resultados demonstraram que as técnicas moleculares são de grande utilidade para a identificação e tipificação de L. monocytogenes, caracterizando-se como importantes ferramentas epidemiológicas. / Due to the seriousness of clinical manifestations and high rates of mortality of the listeriosis disease in populations at risk, control and prevention of this disease, caused by L. monocytogenes, represent an important challenge to sanitation authorities. Difficulties of recovering organisms involved in outbreaks; sub notification; and, the delay in accomplishing conventional analysis are some of the factors that slow-down or even prevent health interventions in outbreak occurrences. With the advent of the molecular biology, new techniques have been employed for identifying and typifying the L. monocytogenes aiming at contributing to studies on epidemiology and sanitary surveillance of foods. The present study aimed at ratifying the taxonomy and the genotypic profile of 31 isolated stocks of varied types of meats supposedly identified as L. monocytogenes by means of the Polymerase Chain Reaction (PCR) employing identification starters of genes 16 rRNA and A and B Internalin in order to confirm the species. Results indicated that only 20 (65.0%) of the stocks were confirmed as being from the investigated species. Another evaluation of similarity were also carried out along with the 20 stocks ratified through pulsed field gel electrophoresis (PFGE), which disclosed a great genotypic diversity characterized by 18 different profiles, according to the Pearson’s similarity coefficient. Results demonstrated that the molecular techniques are very helpful for identifying and typifying the L. monocytogenes, characterizing themselves as important epidemiological tools.

Neste trabalho desenvolvemos métodos analíticos e moleculares para a detecção, isolamento e classificação filogenética de Alicyclobacillus spp. a partir de sucos de laranja e frutos ácidos, pelas técnicas: RT-PCR, nested RT-PCR, RAPD, seqüenciamento do 16S rRNA e análise por métodos eletroforéticos. A sensibilidade na detecção dos A. acidoterrestris foi melhorada por meio de reações de nested RT-PCR, utilizando primers internos (amplicon de 191 bp) que foram desenhados a partir do primeiro amplicom de 294 bp. O limite de detecção foi estudado com as reações RT-PCR e nested RT-PCR, sendo capazes de detectar concentrações de 0,1 UFC mL-1 para culturas puras e 2 UFC mL-1 em sucos de laranja artificialmente inoculados. A inibição de esporos de A. acidoterrestris também foi estudada para monitorar a diminuição da viabilidade com tratamento térmico e Sapindus saponaria (200 mg L-1), utilizando RT-PCR e nested RT-PCR. Com o tratamento térmico de 99 oC por 1 h o grau de inibição dos esporos foi de 96,3%. Enquanto que, com a fração purificada de S. saponaria (200 mg L-1) incubada à 45 oC por 2 dias foi de 93,6%, mas com incubação de 99 oC por 1 h foi de 98,7%, na mesma concentração de saponina. Todas as análises de quantificação de produtos de RT-PCR e nested RT-PCR foram analisadas por meio de eletroforese em gel de agarose e eletroforese capilar em microchip no Bioanalyzer 2100 (Agilent), com os kits DNA 500 e DNA 1000 LabChip®, obtendo-se maior sensibilidade nos microchips. A classificação molecular de dezenove cepas, isoladas a partir de diferentes sucos e frutos ácidos, foram estudadas utilizando RAPD-PCR e eletroforese capilar em microchips. Utilizando cinco primers aleatórios nas reações de RAPD, foi possível estudar os polimorfismos analisados nos microchips. Segundo as análises eletroforéticas, as cepas de suco concentrado e diluído de laranja (1, 2, 6) suco concentrado de limão (lim) e suco de laranja in natura (T2, T3), apresentaram similaridades genéticas com a A. acidoterrestris. O estudo de análise filogenética baseada na comparação de seqüências de DNA da região variável do gene 16S rRNA de Alicyclobacillus acidoterrestris, foi utilizado para identificar e agrupar onze cepas isoladas de superfícies e sucos de frutos ácidos. Na árvore filogenética gerada pelo método neighbor joining e bootstrap 1000x, as cepas analisadas mostraram similaridades de 99% entre todas elas, observando-se uma maior similaridade do controle A. acidoterretris (C2) com a cepa isolada de suco concentrado de limão (lim), e uma boa discriminação entre controles das espécies A. acidocaldarius, A. cicloheptanicus, A. sendaiensis e Sulfobacillus acidophilus. / In this work, we developed analytical and molecular methods for detection, isolation and phylogenetic classification of Alicyclobacillus spp. from orange juice and acid fruits using RT-PCR, nested RT-PCR, RAPD and sequencing of 16S rRNA techniques and electrophoretic methods of analysis. The sensitivity on the detection of A. acidoterrestris in orange juice was improved by nested RT-PCR, using internal primers (amplicon of 191 bp) that were designed after sequencing the first amplicon (294 bp). The detection limit was studied with RT-PCR and nested RT-PCR assay, it was able to detect concentrations of 0.1 UFC mL-1 for media culture and 2 UFC mL-1 in inoculated orange juice. The inhibition in spores from A. acidoterrestris was also studied to monitoring the diminution of viability with heat treatment and Sapindus saponaria (200 mg mL-1), using RT-PCR and nested RT-PCR assays. The inhibition by heat treatment at 99 oC for 1 h was 96.3%. However, incubation with S. saponaria at 45 oC for 2 days inhibited 93,6%, however, with incubation of 99 oC for 1 h was 98,7%, in the same concentration of saponin. The quantification of the RT-PCR and nested RT-PCR amplification product were accomplished by capillary electrophoresis in microchips using the Bioanalyzer 2100 in conjunction with the LabChip (TM) DNA 500 and DNA 1000. The molecular classification of nineteen strains isolated from different juice and acidic fruit, were studied using RAPD-PCR and capillary electrophoresis in microchips. Using five random primers in the RAPD assay, it was possible to study the polymorphisms analyzed in microchips. According to electrophoresis analyses, the strains from concentrated and diluted orange juices (1, 2, 6), lemon concentrated juice (lim) and natural orange juice (T2, T3), showed genetic similarities with the A. acidoterrestris. The study of the phylogenetic analyses based on DNA comparison sequences of the variable region of 16S rRNA gene from Alicyclobacillus acidoterrestris, was utilized for the identification and grouping of eleven strains isolated from surface and juice of acid fruits. In the phylogenetic tree produced by neighbor joining and bootstrap 1000, the strains showed similarities of 99% among all strains, showing a high similarity of A. acidoterrestris with a strain isolated from lemon concentrate juice (lim), and a good discrimination between the species A. acidocaldarius, A. cycloheptanicus, A. sendaiensis and Sulfobacillus acidophilus.

Currently, we observe a growing number of researches that seek to unravel the causes, effects and possible biotechnological uses of the rhizosphere microbiota communities modulation in the complex interactions between plants and soil. We also know that the attack of herbivorous insects is a factor of considerable damage to agriculture and that has well established evolutionary relationships in natural systems. The present work tried to test some hypotheses about the direct connection between the rhizosphere microbiota and the insect pest attack. Beginning from the point that plants have well- established defense mechanisms against insects, it was verified that the rhizosphere microbiota seems to contribute actively to this system and thus to establish holobionte relationships. We had broad access to communities of the fungi and bacterial domain, through the new generation sequencing for rRNA 16S gene, region V3, and intergenic region ITS amplicons on soil, semi-soil and, insect gut samples from pest insects with general behavior (Order: Lepidoptera). Our results from the data analysis to Illumina Miseq sequencing outputs and, additional experiments, resulted in three articles presented here in chapters. In the first chapter, we discuss the modulating effect from the pest insect attack (Spodoptera frugiperda), on the Arabidopsis thaliana microbiota rhizosphere, for different physiological plant\'s stages. As a result, it was possible to discuss the differences between the modulation in the structure of bacterial communities and the modulation in the structure of the fungal communities after the attack of herbivorous insects. In the second chapter, we highlight the difference in the modulation of the bacterial community structure for different plant families. We used seedlings of Arabidopsis thaliana, Zea mays Sh2, Faseolus vulgaris, Solano lycopersicum and, Beta vulgaris exposed to the attack of Trichoplusia ni for one week. The rhizosphere microbiota analysis for each host plant groups, suggests that the influence of the plant species should be considered on the bacteria rhizosphere communities modulation after the insect attack. Besides, specific plant species may be less susceptible to rhizosphere modulation by insect attack. Another highlight was the microbiota rhizosphere effect in the biomass loss for plants sown on transplanted semi-soil. Based on the phenotypic data, we suggest the rhizosphere microbiota modulation after the herbivore may be involved in the plant biomass inhibition on the next seedlings generation. Finally, in the third chapter, we explore the Trichoplusia ni gut microbiota modulation through the microbial load obtained in the restricted feeding. The T. ni larvae from the same original population were divided into three populations. Each population was fed individually and restrictively with leaves of A. thaliana, S. lycopersicum or artificial caloric diet. We accessed the gut microbiota in T. ni after three generations of restricted feeding, and we verified that the gut microbiota in caterpillars of general behavior, could be altered due the obtaining of microbial load through alimentary diet. This modulation may be related to the degradation of metabolites that may be harmful to insect homeostasis. The gut microbiota of each population can also directly influence the food preferences of successive generations. In summary, all our results presented in each one of the chapters are important points that can help to clarify the complex relationships between plants/insects/microorganisms and, contributing to a better understanding of this holobiont system. / Atualmente observamos um crescente número de pesquisas que buscam desvendar as causas, os efeitos e as possíveis utilizações biotecnológicas da modulação de comunidades da microbiota de rizosfera nas interações complexas entre plantas e solo. Sabemos também que o ataque de insetos herbívoros é um fator de considerável prejuízo para a agricultura e que tem relações evolutivas bem estabelecidas em sistemas naturais. O presente trabalho procurou testar algumas hipóteses a cerca da relação direta entre a microbiota de rizosfera e o ataque de insetos praga. Partindo do ponto de que plantas possuem mecanismos de defesa contra insetos, bem conhecidos, foi verificado que a microbiota de rizosfera parece contribuir ativamente para esse sistema, e assim estabelecer relações holobiontes. Tivemos um profundo acesso á comunidades do domínio bactéria e fungi, através da tecnologia de sequenciamento de nova geração para amplicons do gene RNAr 16S, região V3 e região intergênica ITS em amostras de solo, semi- solo e intestino de insetos praga (Ordem: Lepidoptera) de comportamento generalista. Nossos resultados, resultaram em três artigos aqui apresentados em capítulos. No primeiro capítulo é discutido o efeito modulador da herbívora da praga agrícola Spodoptera frugiperda na microbiota de rizosfera de Arabidopsis thaliana em diferentes estágios fisiológicos da planta. Como resultados foi possível perceber que o efeito na modulação da estrutura de comunidades de bactérias é diferente do efeito na modulação de comunidades de fungos após o ataque de insetos herbívoros. Os efeitos são diferentes tanto em abundância relativa quando na diversidade para cada um dos domínios de microrganismos estudados. No segundo capítulo destacamos a diferença na modulação da estrutura de comunidades de bactérias para diferentes famílias de plantas. Utilizamos mudas de A. thaliana, Zea mays Sh2, Phaseolus vulgaris, Solanum lycopersicum e Beta vulgaris, expostas ao ataque de Trichoplusia ni durante uma semana. As análises da microbiota de rizosfera de cada um dos grupos de plantas hospedeiras, sugere que a influência da espécie vegetal deve ser considerada na modulação das comunidades de bactérias da rizosfera após a herbívora. Adicionalmente, determinadas espécies de plantas podem ser menos susceptíveis a modulação da rizosfera pela herbívora. Outro destaque foi o efeito da modulação da microbiota de rizosfera, na perda de biomassa de plantas semeadas em semi-solo transplantado. Com base nos dados fenotípicos das diferentes espécies de plantas avaliadas, sugerimos que a modulação da microbiota de rizosfera após a herbívora, pode estar envolvida na inibição da produção de biomassa vegetal na geração seguinte de plântulas. Por fim, no terceiro capítulo exploramos a modulação na microbiota no intestino de larvas de Trichoplusia ni através da carga microbiana obtida na alimentação restrita. Larvas T. ni de mesma origem foram divididas em três populações. Cada população foi alimentada de forma específica e restrita com folhas de A. thaliana ou S. lycopersicum ou dieta artificial calórica. Acessamos a microbiota do intestino das larvas, após três gerações de alimentação restrita e verificamos que a microbiota intestinal em lagartas de comportamento generalista, pode ser alterada devido à obtenção de carga microbiana por via alimentar. Essa modulação pode estar relacionada a degradação de metabólitos que podem ser prejudiciais à homeostase dos insetos. A microbiota intestinal de cada população também pode influenciar diretamente as preferências alimentares de gerações sucessivas. Em resumo, todos os nossos resultados, apresentados em cada um dos capítulos a seguir, são chaves no conhecimento e podem ajudar a clarificar as complexas relações entre plantas, insetos e microrganismos. Contribuindo assim para um maior entendimento desse tipo de sistema holobionte.

Pienarūgščių bakterijų paieška ir jų identifikavimas migruojančių didžiųjų ančių (Anas platyrhynchos) žarnyne naudojant dalinių 16S rRNR geno sekų analizę ir kultivavimu paremtus metodus Klaidas VARNA Vilniaus Universiteto Ekologijos Institutas, Hidrobiontų Ekologijos ir Fiziologijos Laboratorija bei Populiacinės Genetikos Laboratorija, Akademijos-2, Vilnius-21, 08412, Lietuva. Šiame tyrime pavasarinių ir rudeninių didžiųjų ančių (Anas platyrhynchos) migrantų iš Nemuno deltos virškinamojo trakto pieno rūgšties bakterijų įvairovė buvo ištirta naudojant molekulinius metodus (polimerazės grandininės reakcijos amplifikacija ir dalinių 16S rRNR geno sekų sekvenavimas) ir kultivavimu paremtus metodus. Migruojančių didžiųjų ančių (Anas platyrhynchos) pieno rūgšties bakterijų paieška buvo atlikta pirmą kartą. Rudeniniai didžiųjų ančių migrantai plonojo žarnyno sienelėse (1.2×107 iki 2.1×107 k.f.v./g) ir jų turinyje (nuo 3.4×107 iki 1.1×108 k.f.v./g) turi didesnį pieno rūgšties bakterijų skaičių nei pavasariniai migrantai (atitinkamai nuo 3.2×106 iki 4.8×106 k.f.v./g ir nuo 1.0×107 iki 2.2×107 k.f.v./g). Tiek rudeninių tiek ir pavasarinių didžiųjų ančių migrantų plonojo žarnyno sienelėse ir jų turinyje dominavo kokinės pieno rūgšties bakterijų formos (atitinkamai 65% ir 83.5% bei 81.4% ir 91.6%), o lazdelių buvo mažiau (atitinkamai 35% ir 16.5% bei 18.6% ir 8.4%). Manoma, kad minėtus skirtumus įtakoja keli veiksniai: ilgai trunkanti migracija, perėjimo periodas, skirtingas maistas ir... [toliau žr. visą tekstą] / Identification of lactic acid bacteria in the migrant mallard ducks Anas platyrhynchos intestinal tract by partial 16S rRNA gene sequence analysis and using culture-based techniques Klaidas VARNA Institute of Ecology of Vilnius University, Laboratory of Hydrobionts Ecology and Physiology, Laboratory of Population Genetics, Akademijos-2, Vilnius-21, 08412, Lithuania. In this study the lactic acid bacteria diversity of the intestinal tract content of the vernal and autumnal migrant mallard ducks (Anas platyrhynchos) from Nemuno delta has been investigated by molecular methods: polymerase chain reaction amplification and sequencing of partial 16S rRNA genes and using culture-based techniques. The investigation of the lactic acid bacteria of the migrant mallard ducks has been performed the first time. Autumnal migrant mallard ducks in the small intestine walls (from 1.2×107 until 2.1×107 c.f.u./g) and in their content (from 3.4×107 until 1.1×108 c.f.u./g have the greatest number of the lactic acid bacteria then vernal migrants (respectively from 3.2×106 until 4.8×106 c.f.u./g and from 1.0×107 until 2.2×107 c.f.u./g). In the small intestine walls and in their content of the autumnal and vernal migrant mallard ducks, dominated cocci-shaped lactic acid bacteria (respectively 65% and 83.5%, 81.4% and 91.6%), whereas rod-shaped was under (respectively 35% and 16.5%, 18.6% and 8.4%). Supposedly, that these defferences determine some factors: a long migration, period of incubate... [to full text]

With an adoption of modern methods of polyphasic approach to the study of cyanobacteria, an increased demand for the revision of the traditional taxonomy has emerged. This thesis is devoted to the systematic revisions of selected terrestrial cyanobacteria at several taxonomic levels. The methodology included thorough morphological characterization of cultured cyanobacterial strains using light and electron microscopy complemented with analyses of the molecular data: DNA sequencing, phylogenetic analyses based on 16S rRNA gene and the adjacent 16S-23S ITS region, and comparison of the predicted secondary structures of this region. Descriptions of new species, genera, families and an in-depth characterization of a previously poorly known family were achieved.

Made available in DSpace on 2015-04-01T12:09:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4073387 bytes, checksum: 8309cf98c379c11892e9d5cd2fae29dd (MD5) Previous issue date: 2011-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Soil samples of native pasture (site A) and of soil cultivated with grass Paspalum conjugatum, Bergius (site B) collected from Caatinga vegetation in the semi-arid region in Paraíba state (07°23‟27 S 36°31‟58 W) were utilized for constructing four metagenomic libraries, aiming the evaluation of microbial diversity through amplification of gene 16S rRNA of domains Bacteria and Archaea. The metagenomic DNAs were extracted by utilizing FastDNA® SPIN Kit for Soil (BIO 101), which were amplified by PCR, by using universal primers 27F / 1525R (Bacteria) and 20F / 958R (Archaea). The purified fragments were linked to vector pGEM Teasy and transformed by thermal shock in chemically competent Escherichia coli DH10B. Transformants were cultivated in LB/Ampicillin medium (100 μM/ml), IPTG (800 μg/mL) and XGal (80 μg/mL) at 37ºC/18-20 h. A selection of 250 clones of each library was performed, sequenced and after discarding the low quality sequences and chimerics, 64 and 68 sequences were obtained (Bacteria) and 89 and 141 sequences (Archaea) from soils of sites A and B, respectively, which were compared to public bank of data RDB and NCBI (similarity >95%). In site A the phylum Acidobacteria (48.4%) was the most abundant, followed by phyla Bacteroidetes (10.9%), Proteobacteria (10.9%), and Firmicutes (6.3%). In site B Proteobacteria (45.6%) was the most abundant, followed by Firmicutes (10.3%), Acidobacteria (8.8%), Bacterioidetes (7.3%); and also Cyanobacteria (1.5%) and Planctomycetes (1.5%) which were not found in site A. Among the sequences obtained, 23.4% (site A) and 25.0% (site B) were not classified (similarity <95%). In the domain Archaea the phyla found were Euryarchaeota (3.4 and 45.4%) and Crenarchaeota (2.2 and 3.5%), in sites A and B, respectively; it should be observed that 94.4% and 51.1% of the sequences were not classified (similarity <95%), between sites A and B, respectively. Larger diversity (Shannon‟s índex), richness (Chao 1), and distribution (equity index) of communities were observed at species level, in the phyla Bacteria and Archaea, in both sites. The metagenomic libraries 16S rRNA of Bacteria and Archaea, when compared by using the LIBSHUFF program, differed significantly (p<0.0001). The results of the present study showed the occurrence of a great diversity of bacteria and archaea in that semi-arid environment, with peculiar features of elevated temperature and hydric limitations, emphasizing the possibility of investigations on search of new genes and/or microbial isolates with biotechnological potential. / Amostras do solo da pastagem nativa (sítio A) e sob cultivo do capim marrequinho (Paspalum conjugatum, Bergius) (sítio B), coletadas na região semi-árida do bioma Caatinga, Paraíba, (07°23‟27 S 36°31‟58 O), foram utilizadas para construção de quatro bibliotecas de clones metagenômicos, para avaliação da diversidade microbiana pela amplificação do gene 16S rRNA dos domínios Bacteria e Archaea. Os DNA metagenômicos foram extraídos utilizando FastDNA® SPIN Kit for Soil (BIO 101), os quais foram amplificados por PCR utilizando primers universais, 27F / 1525R (Bacteria) e 20F / 958R (Archaea). Os fragmentos purificados foram ligados ao vetor pGEM Teasy e transformados por choque térmico em Escherichia coli DH10B quimicamente competente. Os transformantes foram cultivados em meio Agar LB/Ampicilina (100 μ/mL), IPTG (800 μg/μL) e XGal (80 μg/μL), a 37ºC/18-20 h. Foram selecionados 250 clones de cada biblioteca os quais foram sequenciados e após descarte das sequências de baixa qualidade e quiméricas, foram obtidas 64 e 68, 89 e 141 sequências para Bacteria e Archaea, nos solos dos sítios A e B, respectivamente, as quais foram comparadas em banco de dados públicos RDB e NCBI (≥95% de similaridade). No sítio A o filo Acidobacteria (48,4%) foi o mais abundante, seguido dos filos Bacteroidetes (10,9%), Proteobacteria (10,9%), e Firmicutes (6,3%). No sítio B Proteobacteria (45,6%) foi o de maior destaque, seguido de Firmicutes (10,3%), Acidobacteria (8,8%), Bacterioidetes (7,3%); e ainda Cyanobacteria (1,5%) e Planctomycetes (1,5%), que não foram encontrados no sítio A. Entre as sequências geradas, 23,4% (sítio A) e 25,0% (sítio B) não foram classificadas (similaridade <95%). No domínio Archaea foram encontrados os filos Euryarchaeota (3,4 e 45,4%) e Crenarchaeota (2,2 e 3,5%), nos sítios A e B, respectivamente; destacando-se que 94,4% e 51,1% das sequências não foram classificadas (similaridade <95%), entre os sítios A e B, respectivamente. Uma maior diversidade (índice de Shannon), riqueza (índice Chao 1) e distribuição (índice de equidade) das comunidades foram observadas no nível de espécies, tanto para Bacteria como para Archaea, nos dois sítios. As bibliotecas de clones metagenômicos 16S rRNA de Bacteria e Archaea, quando comparadas, utilizando-se o programa LIBSHUFF, diferiram significativamente (p<0,0001). Os resultados desse estudo mostraram a ocorrência de uma grande diversidade de bactérias e arqueas, nesse tipo de ambiente pouco estudado e com características peculiares de temperatura elevada e limitações hídricas, com possibilidade de busca de novos genes e/ou isolados microbianos, com potencial biotecnológico.

Made available in DSpace on 2015-04-01T14:16:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1357815 bytes, checksum: a8f6776ded44373a63e29cc1331535eb (MD5) Previous issue date: 2013-04-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Reproductive disorders in bovines can be caused by various pathogens, which might already be present in the reproductive tract. The microbial community of the reproductive apparatus, when known, can provide information about the health of the host. The metagenomics has been used to characterize and obtain genetics information about microbial communities in various environments and can relate certain diseases with changes in community composition. In this study, samples were collected from the secretion of mucosa of vaginal surface of 05 healthy cows and 05 cows that showed symptoms of reproductive disorders. Metagenomics DNA samples were extracted of secretion samples and amplified with primers for the V5-V6 regions of the 16S rRNA and sequenced on the platform "Ion Torrent Personal Genome Machine - PGM". The data were processed to remove low quality sequences and chimeras, with the Mothur program, then the data were released in the Ribosomal Database Project for classification of OTU's. Local blastn was performed and this results was loaded in MEGAN program, for viewing profiles and taxonomic microbial attributes. The control profile showed a total of 15 taxa, being the taxa Bacteroides, Enterobacteriaceae and Victivallis, with the highest representation of OTU's; the positive profile showed 68 taxa, and Bacteroides, Enterobacteriaceae, Histophilus, Victivallis, Alistipes and Coriobacteriaceae, the taxa with more OTU's representation. The genus Histophilus have pathogenics species in reproductive tract of cattle. There was a change in the community composition, well as in microbial attributes of profiles there may be a relationship between the pathogen and of other representatives taxa, in production of metabolites to disease progression. / Distúrbios reprodutivos em bovinos podem ser causados por diversos patógenos, que poderiam já estar presentes no trato reprodutivos. A comunidade microbiana dos aparelhos reprodutivos, quando conhecida, pode fornecer informações a respeito da saúde do hospedeiro. A metagenômica tem sido utilizada para caracterizar e obter informações genéticas a respeito de comunidades microbianas de diversos ambientes, podendo relacionar determinadas doenças com alterações na composição das comunidades. Nesse trabalho, foram coletadas amostras de secreção de mucosa da superfície vaginal de 05 vacas sadias e 05 vacas que apresentaram sintomas de distúrbios reprodutivos. Amostras de DNA metagenômico foram extraídas das amostras de secreção e amplificadas com primers para as regiões V5-V6 do gene 16S rRNA e sequenciadas na plataforma Ion Torrent Personal Genome Machine PGM . Os dados foram tratados para retirada de sequencias de baixa qualidade e quimeras, com o programa Mothur; em seguida, os dados foram lançados no Ribosomal Database Project para classificação das OTU´s. Blastn local foi efetuado e seus resultados foram carregados no programa MEGAN, para visualização de perfis taxonômicos e atributos microbianos. O perfil controle apresentou um total de 15 taxa, sendo os taxa Bacteroides, Enterobacteriaceae e Victivallis, os de maior representação de OTU´s; o perfil com distúrbios apresentou 68 taxa, sendo Bacteroides, Enterobacteriaceae, Histophilus, Victivallis, Alistipes, e Coriobacteriaceae, os taxa com maior representação de OTU´s. O gênero Histophilus possui espécies patogênicas em trato reprodutivo de bovinos. Observou-se uma alteração na composição das comunidades estudadas, bem como nos atributos microbianos dos perfis podendo haver uma relação entre patógenos e representantes de outros taxa, na produção de metabólitos para progressão da doença.