Los viroides, los agentes infecciosos conocidos más simples, están constituidos por una molécula circular de RNA monocatenario. A pesar de su pequeño tamaño (246-401 nt) y de no codificar proteínas, son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y causar enfermedades en ciertas plantas. En el presente trabajo hemos profundizado en el estudio de dos metodologías para el control de viroides basadas en ribozimas de cabeza de martillo con motivos de estabilización terciaria, y en RNAs interferentes que inducen en la planta una respuesta defensiva de silenciamiento génico mediado por RNA. Las ribozimas derivadas del viroide latente de la berenjena (Eggplant latent viroid, ELVd), que en su contexto natural median el autocorte de los RNAs multiméricos generados por un mecanismo de replicación de círculo rodante, son particularmente interesantes para adaptarlas a un formato trans. Hemos observado que la secuencia del trinucleótido que precede el sitio de autocorte de la ribozima de polaridad (+) del ELVd afecta a su actividad autocatalítica. Las constantes catalíticas de distintas variantes de este trinucleótido (AUA, AUC, GUA, GUC) determinadas in vitro a baja concentración de magnesio son diferentes en condiciones co- y postranscripcionales. Estos resultados sugieren que la ribozima de polaridad (+) del ELVd, y muy posiblemente otras ribozimas de cabeza de martillo naturales, han sido evolutivamente seleccionadas para actuar durante la transcripción de los RNAs viroidales, y que el trinucleótido AUC que precede al sitio de autocorte no se encuentra en la mayoría de las ribozimas de cabeza de martillo naturales por favorecer la adopción de estructuras metaestables catalíticamente inactivas durante la transcripción. La variante ELVd(+)-GUC, que presenta una constante catalítica alta e induce el corte de una amplia fracción del transcrito primario, fue seleccionada para diseñar variantes en trans frente al viroide del tubérculo fusiforme de la patata (Potat / Carbonell Olivares, A. (2008). Resistencia a viroides inducida por ribozimas de cabeza de martillo y RNAs interferentes [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2005

La tristeza de los cítricos es una de las enfermedades de mayor importancia en el cultivo de los cítricos. Dada la imposibilidad práctica de contener su dispersión y evitar su evolución hacia formas más virulentas, el control de los daños mediante protección cruzada o mediante resistencia mediada por genes del patógeno utilizando plantas transgénicas requiere un conocimiento detallado de las interacciones CTV-cítricos. Para este estudio se inocularon cuatro aislados con distintas características patogénicas en lima Mexicana (LM), Citrus macrophylla (CM), naranjo dulce (ND) y naranjo amargo (NA). La estimación de la carga viral mediante ELISA y RT-PCR cuantitativa a tiempo real en la primera brotación y al cabo de 9 meses, mostró que NA ofrece una resistencia inicial a la invasión por CTV. Asimismo, sugirió que la intensidad de los síntomas inducidos por CTV no era una consecuencia directa de la acumulación viral. El análisis de la actividad replicativa de las distintas combinaciones aislado/huésped reveló una cinética de acumulación viral paralela a la actividad replicativa. Por otro lado, mientras en los huéspedes susceptibles se detectaron siRNAs de CTV en la primera brotación, la activación del silenciamiento en NA fue mucho más tardía indicando que la resistencia inicial a la acumulación viral en este huésped no era consecuencia del silenciamiento. Posteriormente, se analizó en más detalle el tipo de limitaciones que ofrecía NA a la invasión sistémica de CTV observándose que éste presentaba una limitación al movimiento viral. El virus se detectó inicialmente en la raíz y el nivel de acumulación del mismo afectaba la posterior carga viral en la copa, de forma variable según los aislados, así para el aislado T385 la raíz actuaría como reservorio viral. Finalmente, el empleo de la tecnología de las micromatrices de cDNA permitió analizar a nivel transcriptómico la respuesta del NA al inicio de la infección por CTV y confirmar las hipótesis formuladas anteriormente. / Comellas Serra, M. (2009). Estudio de la interacción entre naranjo amargo y el virus de la tristeza de los cítricos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/7323

Los virus de plantas constituyen, en ocasiones, una seria amenaza para numerosos cultivos. A pesar de las numerosas investigaciones realizadas, existe todavía un gran desconocimiento de las rutas y los mecanismos que operan en la invasión viral de los correspondientes huéspedes. Es importante destacar que el bloqueo en el movimiento viral constituye uno de los mecanismos de resistencia natural más frecuentes a los virus. El progreso en el conocimiento de estas etapas del ciclo viral puede llevar a estrategias antivirales. En el presente trabajo se ha pretendido caracterizar estructural y funcionalmente las 5 proteínas codificadas por el genoma del MNSV, haciendo especial hincapié en caracterizar los factores, tanto virales como celulares, que intervienen en el transporte intra e intercelular del virus. Como paso previo y necesario, en el Capítulo 1 de la presente Tesis, se ha obtenido un clon infeccioso del MNSV, denominado pMNSV(Al), a partir del cual se pueden generar transcritos in vitro capaces de reproducir la misma sintomatología que el virus tras la inoculación mecánica sobre el huésped natural (melón). Este clon infeccioso constituye una herramienta molecular indispensable que ha permitido realizar un análisis funcional de los genes virales. Así, mediante técnicas de mutagénesis dirigida sobre el clon pMNSV(Al), se ha obtenido una colección de mutantes que impiden la expresión de cada una de las ORFs del genoma del virus. Además, las mismas modificaciones se han efectuado sobre un clon quimérico, pMNSV(Al)- cp-GFP, en el que se ha sustituido la ORF que codifica la CP viral por el gen testigo de la proteína de fluorescencia verde (GFP). Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las proteínas 29 y 89 estarían implicadas en la replicación del genoma. Por otro lado, la p7A y la p7B participarían en el movimiento célula a célula del virus. Por último, p42 ó CP, además de su papel estructural, es necesaria para la invasión sistémica del virus, siendo capaz / Genovés Martínez, A. (2008). Análisis funcional y localización subcelular de las proteínas implicadas en el movimiento intra e intercelular del virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2401