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Regulation der Phytaseexpression in Bacillus amyloliquefaciens

Makarewicz, Oliwia 17 October 2006 (has links)
Viele Bacillus Stämme sekretieren Phytasen, diese katalysieren die Dephosphorylierung von myo-Inositolhexakisphosphat (phytate). Das monocystronische phyC Gen aus dem im Boden lebenden Bacillus amyloliquefaciens FZB45 konnte als Teil des, durch Phosphatmangel induzierbaren, PhoPR-Regulons identifiziert werden. Der Transkriptionsstart des SigmaA-abhängigen Promotors wurde 27 bp upstream von Translationsstart bestimmt. Der Promotor weist jedoch eine ungewöhnliche Struktur auf, da die –35 und die –10 Region durch ein 21 bp Fenster voneinander getrennt sind. Die in vitro Transkriptionsanalyse zeigte, dass PhoP-P für die Initiation der phyC-Transkription notwendig ist. Die PhoP-Bindungsstellen der meisten B. subtilis Promotoren, die durch PhoP aktiviert werden, besitzen mindestens vier TTAACA-ähnliche Sequenzmotive, welche durch 5-6 bp- Intervalle getrennt sind. Die upstream Region von phyC aus B. amyloliquefaciens FZB45 weicht von dieser Struktur ab. Hier konnten nur zwei solcher Motive, die für die Bindung eines PhoP-Dimeres zuständig sind und die Positionen -47 und -35 überlagern, identifiziert werden. Ein weiteres Motiv befindet sich zwischen -13 und –8 und überlappt um eine Base mit der –10 Region. Die Funktionen der drei Bindungsstellen konnten durch DNaseI-Footprinting ermittelt werden. Ein PhoP-Dimer besetzt die –35 Region und dirigiert dabei die RNA-Polymerase wahrscheinlich in Richtung –10 Region. Durch die Bindung von PhoP an die PhoP-Erkennungsstelle bei –10 wird die Transkription gehemmt. Diese PhoP-vermittelte duale Kontrolle des phyC-Promotors scheint bis lang einzigartig für Pho-Regulongene zu sein. Der globale Regulator AbrB konnte als weiterer Repressor des phyC identifiziert werden. Die Bindungsstelle befinden sich upstream von –147 und downsteam von +29, müssen aber in weiteren Experimenten genauer spezifiziert werden. Diese Arbeit stellt als erste die Modelle der phyC-Regulation durch PhoP und AbrB vor. / Several Bacillus strains secrete phytase, an enzyme catalysing dephosphorylation of myo-inositol hexakisphosphate (phytate). The monocistronic phyC (phytase) gene from environmental Bacillus amyloliquefaciens FZB45 was identified as a member of the phosphate-starvation inducible PhoPR regulon. The transcriptional start was determined downstream of a sigmaA-like promoter region located 27 bp upstream of the translation start codon. Inspection of the phyC promoter sequence revealed an unusual structure, since the -35 and -10 region are separated by a window of 21 bp. In vitro transcription analysis established that PhoP-P is necessary to initiate the transcription from phyC promoter. PhoP binding boxes occurring in most B. subtilis promoters activated by PhoP consist of at least four TTAACA-like sequences repeated at intervals of 5-6 bps. The upstream region of the B. amyloliquefaciens FZB45 phyC gene deviates from this general architecture in that there is only one appropriate binding site for the dimeric PhoP protein, which consists of two motives centered at -47 and -35 and separated by five base pairs. A single PhoP binding site is located at -13 to -8, nearly matching the -10 consensus. Functionality of the three PhoP binding boxes was demonstrated by DNaseI footprinting suggesting that a pair of dimeric PhoP molecules cover the -35 region directing the RNA-polymerase to the –10 region. Binding of PhoP at a single PhoP binding site covering the -10 consensus repress the transcription. It seems to be a unique feature of the phyC promoter structure and has not been reported for any other member of the PhoPR regulon, previously. Furthermore an inhibitory effect via AbrB, a global regulator, could be verified. The binding regions could be determine upstream of –147 and downstream of +29, but have to be specify in further experiments. This work presents for the first time the models for the regulation of phyC in Bacillus via PhoP and AbrB.
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Untersuchungen zur Expression und Inhibition von Orthopockenvirus-Genen

Reiche, Janine 11 February 2010 (has links)
Nicht nur die mögliche Verwendung von Variolavirus als bioterroristischer Kampfstoff sondern auch das zoonotische Potential pathogener Pockenviren wird als eine erhebliche Gefahr für das öffentliche Gesundheitswesen diskutiert. Zurzeit liegt in der Bevölkerung kein ausreichender Impfschutz vor. Mit Ausnahme der Expositionsprophylaxe steht die Vakzination als einzige Prävention zur Verfügung, von der bekannt ist, dass sie mit erheblichen Impfkomplikationen assoziiert ist. Therapeutische Ansätze sind deshalb von großem Interesse. In dieser Arbeit wurden HEp-2-Zellen mit den Orthopockenviren (OPV) VACV-LE, VACV-MVA-BN, CMLV-CP-19 und Calpoxvirus sowie die Zelllinien 293, A-549, Huh-7 und HSB-2 mit Calpoxvirus infiziert und der Replikationszyklus analysiert. Die Genexpression von Faktoren der Transkription (D7R), der DNA-Replikation (K4L) oder für Strukturproteine (D8L, A56R, A27L) wurde unabhängig vom untersuchten Virus und der Zelllinie gleich reguliert, was auf eine wichtige Rolle während der Virusreplikation hinweist. Ferner wurde ein siRNA-System zur Hemmung der OPV-Gene D7R, K4L, D8L, A56R und A27L etabliert. Die Transkription von D7R, K4L, D8L und A27L wurde in infizierten Zellen effektiv durch spezifisch eingesetzte shRNAs inhibiert und dadurch die Virusreplikation von Calpoxvirus im Vergleich zu den Kontrollzellen 24 und 48 Stunden nach der Infektion gehemmt. Die Inhibition der A27L-Genexpression wurde zusätzlich im Western Blot für Calpoxvirus- und VACV-LE-infizierte 293-Zellen nachgewiesen. A56R wurde weder für die Replikation von Calpoxvirus noch von VACV-LE in der Zellkultur benötigt. Da die Gene D7R, K4L, D8L und A27L essentiell für die Replikation von OPV in der Zellkultur waren, könnten sie potentielle Zielstrukturen für die Entwicklung von antiviralen Substanzen für die Behandlung einer OPV-Infektion darstellen. / Not only the potential use of smallpox in a bioterrorist attack but also the zoonotic potential of other poxviruses infecting animals are discussed to be a public health threat. At present, there is no sufficient protection in the human population provided by vaccination. Prophylactic vaccination was effective but has been associated with serious adverse effects. No proven drug treatment is available. Therefore, therapies and new treatment strategies are greatly needed. In this study HEp-2 cells were infected with the orthopoxviruses (OPV) VACV-LE, VACV-MVA-BN, CMLV-CP-19 and Calpoxvirus. In addition, the cell lines 293, A-549, Huh-7 and HSB-2 were infected with Calpoxvirus alone to determine the OPV replication cycle. Irrespective of the analyzed virus and cell line gene expression was regulated similarly for factors involved in transcription (D7R), DNA replication (K4L) or for structural proteins (D8R, A56R, A27L), indicating an important role in virus replication. Furthermore, a siRNA-system for the inhibition of the OPV genes D7R, K4L, D8L, A56R and A27L was established. It could be shown, that specific shRNAs effectively inhibited transcription of D7R, K4L, D8L and A27L in infected cells and repressed Calpoxvirus replication 24 and 48 hours post infection in comparison to control cells. In addition, the inhibition of A27L gene expression was shown in Western Blot analyses for Calpoxvirus- and VACV-LE-infected 293 cells. A56R is not required for virus replication of Calpoxvirus and VACV-LE in cell culture. Since D7R, K4L, D8L and A27L seem to be essential for OPV replication in cell culture, these OPV genes might serve as potential targets for the development of antiviral substances for the treatment of OPV infections.
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Kodierung verhaltensrelevanter Gesangsparameter bei Chorthippus biguttulus

Kutzki, Olaf 29 May 2012 (has links)
Heuschrecken nutzen die akustische Kommunikation zum Auffinden eines geeigneten Paarungspartners. Sie produzieren artspezifische Gesänge, die aus Silben und Pausen festgelegter Dauer bestehen. Den Weibchen dienen diese Gesänge nicht nur zur Erken-nung der Artzugehörigkeit – und somit zur Vermeidung von Hybriden -, sondern dar-über hinaus als Informationsquelle über die Qualität der Männchen. Den Männchen hilft der weibliche Antwortgesang beim Auffinden der Weibchen. Die Attraktivität verschiedener artifizieller Gesangsattrappen für Männchen und Weib-chen wurde in Verhaltensexperimenten untersucht. Es zeigte sich ein starker Zusam-menhang zwischen der Attraktivität und den gewählten Parametern, insbesondere der Pausendauer. Die Reaktionen von auditorischen Neuronen des Metathorax und des Oberschlundganglions auf diese Stimuli wurden charakterisiert. Die durch diese Neuro-ne transportierte Informationsmenge bezüglich der variierten Parameter sowie ihr zeitli-cher Verlauf wurde bestimmt. Durch die Kombination von Verhaltensversuchen und elektrophysiologischen Untersu-chungen an denselben Tieren konnte ein Zusammenhang zwischen Verhalten und Spi-keantworten bei einer aufsteigenden Zelle hergestellt werden. Für diese Zelle wird ein Modell zur Pausendauerdetektion vorgestellt. Hierbei werden mittlere Pausendauern – die für Weibchen attraktiv sind – mit höheren Spikezahlen beantwortet als kurze und lange Pausen. Dies kommt durch unterschiedliche Zeitverläufe von Adap¬tation und Rückkehr aus der Adaptation bei den exzitatorischen und inhibitorischen Eingängen der Zelle zustande. / Grasshoppers use acoustic communication to find a sexual partner. They produce species-specific songs, which consist of syllables and pauses of a fixed duration. The male songs enable the females not only to recognize conspecifics – and thus to avoid hybridization – but also to obtain information about the quality of the males. Males take advantage of the females’ response songs in localizing the female. The attractiveness of various artificial stimuli for males and females was studied in behavioral experiments. A strong correlation between the attractiveness and the chosen parameters - especially the pause duration - could be found. The responseproperties of auditory neurons in the metathoracic ganglion and the supraoesophageal ganglion have been characterized. The transmitted information and its temporal course was determined. By performing behavioral and electrophysiological experiments with the same animals, I found a correlation between behaviour and spike responses in an ascending neuron (AN3). The tuning of this cell for pause duration was modelled as the result of different time courses of adaptation of the cells excitatory and inhibitory inputs. In this model pauses of intermediate duration – which are most attractive to females – generate more action potentials than shorter or longer pauses.
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MicroRNAs in alternative and classic activation of macrophages

Bertrams, Wilhelm 19 December 2014 (has links)
Die Polarisierung von Makrophagen resultiert in einer Vielzahl von Subtypen, z.B. M1 oder M2. In dieser Studie lege ich die Makrophagen-Polarisierung im allergischen Asthma mit Fokus auf microRNA (miRNA) dar. Nach Etablierung von Subtyp–charakteristischen mRNA und miRNA Expressionsprofilen in vitro polarisierter, humaner blutstämmiger Makrophagen wurden diese Profile genutzt, um den Polarisierungsstatus isolierter Lungenmakrophagen in einem Mausmodell des Asthmas zu ermitteln. Es wurden humane blutstämmige Makrophagen in vitro durch IFNg/LPS (M1) bzw. IL4/IL13 (M2) polarisiert. M1-assoziierte Gene waren TNFa, IL6 und IL1b, während in M2 Makrophagen eine Induktion von CD209 und PPARg beobachtet wurde. Herauf-regulierte miRNAs waren z.B. hsa-miR-187-3p, hsa-miR-155-5p und hsa-miR-146a-5p (M1) bzw. hsa-miR-193b-3p und hsa-miR-511-5p (M2). Eine in silico Vorhersage von mRNA/miRNA Interaktionspartnern wurde in einem Luciferase Reportermodell überprüft, das u.a. hsa-miR-187-3p als Regulator von SH2B2 und hsa-miR-187-3p sowie hsa-miR-155-5p als kooperative Regulatoren von LAMP2 bestätigte. Unter physiologischen Bedingungen regulierte hsa-miR-187-3p die SH2B2 mRNA herunter, aber es lag kein Einfluß von hsa-miR-187-3p oder hsa-miR-155-5p auf LAMP2 mRNA oder Protein vor. Weiterhin wurden die miRNA Profile von murinen Makrophagen erhoben, die aus der bronchoalveolären Lavage und aus Lungengewebe gewonnen wurden. Diese Profile wurden in einer vergleichenden Analyse von gesunden Mäusen und Mäusen mit akuter Ovalbumin-induzierter eosinophiler Atemwegsentzündung eingesetzt. In Reaktion auf Ovalbumin regulierte miRNAs waren z.B. mmu-miR-21a-5p und mmu-miR-155-5p (heraufreguliert), sowie mmu-miR-126-3p und mmu-miR-146a-5p (herunterreguliert). Sowohl M1 als auch M2 assoziierte Muster zeigten sich vor allem in der reziproken Regulation von mmu-miR-155-5p (heraufreguliert) und mmu-miR-146a-5p (herunterreguliert). / Macrophage polarization gives rise to a plethora of macrophage subtypes, e.g. M1 or M2. In this thesis, I aim to point out some features of macrophage polarization in allergic asthma with a focus on microRNA (miRNA). The chosen approach started with the establishment of subtype-characteristic mRNA and miRNA profiles of in vitro polarized human macrophages. In a second step, the miRNA patterns were used to interpret the polarization status of isolated lung macrophages from a murine model of asthma. In vitro polarization of human blood-derived macrophages was performed by IFNgLPS (M1) and IL4/IL13 (M2), and global mRNA and miRNA profiling ensued. M1-induced genes included TNFa, IL6 and IL1b, whereas in M2 macrophages, CD209 and PPARg were induced. M1-associated miRNAs were hsa-miR-187-3p, hsa-miR-155-5p and hsa-miR-146a-5p, while hsa-miR-193b-3p and hsa-miR-511-5p were induced in M2 macrophages. In silico prediction of mRNA/miRNA interaction partners was experimentally validated in a luciferase-based reporter assay that confirmed hsa-miR-187-3p as a regulator of SH2B2 and the pair of hsa-miR-187-3p and hsa-miR-155-5p as cooperative regulators of LAMP2. Under physiologic conditions, hsa-miR-187-3p was able to down-regulate SH2B2 transcript, but there was no impact of either hsa-miR-187-3p or hsa-miR-155-5p on LAMP2 mRNA or protein. Furthermore, the miRNA profiles of murine macrophages from the bronchoalveolar lavage fluid and from lung tissue were established and compared between healthy mice and mice with acute Ovalbumin-induced eosinophilic airway inflammation. Individual miRNAs responding to Ovalbumin were e.g. mmu-miR-21a-5p and mmu-miR-155-5p (up-regulated), and mmu-miR-126-3p and mmu-miR-146a-5p (down-regulated). Characteristics of both M1- and M2-associated miRNA patterns were most evident in the concomitant reciprocal expression of mmu-miR-155-5p (up-regulated) and mmu-miR-146a-5p (down-regulated).
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A new role for LRP2 in forebrain development

Anzenberger, Uwe 01 November 2006 (has links)
LRP2 wird waehrend der fruehen Embryonalentwicklung hauptsaechlich im Dottersack und im Neuroepithel exprimiert. Der funktionelle Verlust dieses 600 kDa grossen Proteins in Maeusen fuehrt zu Fehlbildungen bei der Vorderhirnentwicklung, die als Holoprosenzephalie bezeichnet werden. LRP2 kommt daher eine wichtige Funktion waehrend der Vorderhirnentwicklung zu. Fuer diese Arbeit wurden Maeuse verwendet, bei denen lrp2 im gesamten Tier oder nur in bestimmten Geweben inaktiviert war. Die Expression von LRP2 im Neuroepithel, nicht aber im Dottersack ist wichtig fuer die korrekte Vorderhirnentwicklung. Das Fehlen des Proteins fuehrte am Tag 9.5 der Embryonalentwicklung zu einer UEberaktivierung des Bmp4 Signalweges im rostralen Telencephalon. Am Tag 10.5 war ein Verlust der shh-Expression in der anterioren entopeduncularen Zone (AEP) zu sehen. Das Fehlen von Shh in der AEP fuehrte zum Verlust von ventralen Oligodendrozyten und Interneuronen. AEhnliche Defekte wurden ebenfalls in Maeusen beschrieben, bei denen der Bmp4 Signalweg verstaerkt ist. Bmp4 bindet in vitro an LRP2. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass LRP2 an der Entwicklung des ventralen Telencephalons beteiligt ist - moeglicherweise indem es die verfuegbare Menge an Bmp4 durch Endozytose reguliert. Die Signalwege, in die LRP2 eingebunden ist, sollten im Zebrafisch weiter untersucht werden. Tiere, denen funktionelles LRP2 fehlte, wurden durch die Injektion von Morpholinos generiert. Injizierte Tiere zeigten Stoerungen bei Resorptionsvorgaengen im Pronephros, was darauf hin deutet, dass die Funktion von LRP2 im Zebrafisch Pronephros und in der Niere der Saeugetiere konserviert ist. Die Expressionsmuster von Markergenen fuer die Vorderhirnentwicklung waren allerdings normal.Vermutlich war die Stoerung der lrp2-mRNA Prozessierung nicht ausreichend, um hier einen Effekt hervorzurufen, da bereits im 1-Zell Stadium genuegend komplett prozessierte maternale lrp2-mRNA fuer die Translation von LRP2 vorhanden war. / LRP2 is mainly expressed in the yolk sac and in the neuroepithelium of the early embryo. Deficiency for this 600 kDa protein in mice results in holoprosencephaly, indicating a role for LRP2 in forebrain development. Mice with a complete or a conditional loss of lrp2 function were used to elucidate the consequences of the lack of LRP2 expression. The presence of LRP2 in the neuroepithelium but not in the yolk sac is crucial for early forebrain development. Lack of the receptor resulted in an increase of Bmp4 signaling in the rostral telencephalon at E9.5. As a consequence, shh expression at E10.5 was lost completely in a ventral region of the telencephalon termed anterior entopeduncular area (AEP). The absence of Shh activity in this area led to the loss of ventrally induced oligodendroglial and interneuronal cell populations in lrp2-deficient mice. Similar dorsalizing effects have also been observed in mice with increased Bmp4 signaling. Taking into account that Bmp4 was found to bind to LRP2 in vitro and in vivo, these results suggest a role for LRP2 in patterning the rostral ventral neural tube, possibly by acting as a clearance receptor for Bmp4. The underlying molecular mechanisms were then further analyzed in the zebrafish. LRP2-deficient animals were generated by injecting Morpholinos that interfered with the splicing of the lrp2-pre-mRNA leading to a deletion of the transmembrane-exon. Injected animals suffered from impaired renal clearance processes, demonstrating the functional conservation of LRP2 in the larval zebrafish pronephros. Brain structures were not affected in these animals and the expression patterns of marker genes for early forebrain development that were changed in the mouse were not changed. Apparently, Morpholino mediated interfering with the splicing of the lrp2-pre-mRNA did not affect the early forebrain formation because properly processed lrp2-mRNA was supplied maternally and sufficient for proper brain formation.
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Aufnahme von Fettsäuren in Spermatozoenlipide von Sus scrofa domestica und physiologische Auswirkungen

Svetlichnyy, Valentin 07 February 2013 (has links)
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den physiologischen Veränderungen porciner Spermatozoen, die durch einen metabolischen Einbau von Fettsäuren in Spermatozoenlipide hervorgerufen werden. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der metabolischen Aufnahme von Fettsäuren in die Spermatozoenlipide und die Bewertung des physiologischen Zustandes porciner Spermatozoen mit Hinblick auf die Niedrigtemperaturlagerung. Alle in den porcinen Spermatozoen vorkommenden Lipide wurden mittels GC und MALDI-TOF-MS analysiert. Hauptvertreter der polaren Lipidklassen sind Glycerophospholipide (GPC, GPE). Der Hauptvertreter der neutralen Lipidklassen ist Diacylglycerol (DAG). Die metabolische Aufnahme von Fettsäuren in die Lipide wurde durch die Supplementierung des Flüssigkonservierungsmediums mit [14C]-Octadecadiensäure radiochemisch untersucht. Anhand dieser Experimente wurde gezeigt, dass die Temperatur und die Inkubationsdauer wichtige Faktoren für die metabolische Aufnahme dieser Radiochemikalie in die Spermatozoenlipide sind. Die zugesetzten Fettsäuren werden sowohl in die neutralen (DAG) als auch in die polaren Lipide (diacyl-GPC) der Spermatozoen eingebaut. Nach Supplementierung mit 13C-markierter Octadecadiensäure wurden die Lipide mittels MALDI- und Q-TOF-MS als DAG (18:2/18:2), GPC (16:0/18:2) und GPC (18:2/18:2) charakterisiert. Die gleichen Ergebnisse wurden auch für die in den Spermatozoenlipiden vorkommenden Hexadecen-, Octadecen-, und Octadecatriensäure erhalten. Bei der Untersuchung des physiologischen Zustandes von Spermatozoen wurde gezeigt, dass insbesondere Supplementierungsvarianten mit endogen vorkommenden Fettsäuren zu einer besseren Spermatozoenvitalität und Motilität bei Niedrigtemperaturlagerung führten. Gleichzeitig wurde eine Verminderung des Auftretens von akrosomalen Schäden festgestellt. Damit stellt eine Supplementierung der Spermatozoen mit ausgewählten Fettsäuren eine effektive Maßnahme zur Lagerung von Spermatozoen bei 4 bis 6°C dar. / This study examines the metabolic incorporation of selected fatty acids into the lipids of porcine spermatozoa and evaluates the physiological state of spermatozoa subsequent to low temperature storage supplementation with selected free fatty acids. The aim was to understand the role of fatty acids in relation to the (cryo-)preservation of spermatozoa and successful reproduction in more detail. All lipids present in porcine spermatozoa were analysed using gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The main representatives of the polar lipid classes are glycerophospholipids (in particular GPC and GPE). The main representatives of the neutral lipid classes are diacylglycerols (DAG). Metabolic incorporation of fatty acids into lipids was radiochemically monitored using [14C]-octadecadienoic acid in the supplied spermatozoa-preservation medium. Temperature and incubation time were shown to be particularly important determinants. The added fatty acids were incorporated into both the spermatozoas’ neutral (DAG) and polar lipids (diacyl-GPC). The affected lipids were characterised by means of MALDI- and Q-TOF-MS subsequent to the supplementation of uniformly 13C-labelled octadecadienoic acid. DAG (18:2/18:2), GPC (16:0/18:2) and GPC (18:2/18:2) could be identified and a de-novo biosynthesis of DAG (18:2/18:2) could be proven. The same results were obtained when spermatozoa were supplemented with hexadecenoic, octadecenoic and octadecatrienoic acids. Finally, it was shown that the physiological state of the spermatozoa, especially those supplemented with endogeneously present fatty acids, led to an enhanced vitality and motility in spermatozoa subsequent to low temperature storage. It was also observed that acrosomal damage was reduced and that hexadecenoic acid significantly stabilised all the vitality parameters. In conclusion, supplementing spermatozoa with selected fatty acids is an effective solution for the storage of spermatozoa at 4 to 6°C.
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Aktivierung von Schülervorstellungen zu Modellen durch praktische Tätigkeiten der Modellbildung

Orsenne, Juliane 19 May 2016 (has links)
Das Wissenschaftsverständnis als Verständnis über die charakteristischen Grundzüge der Erkenntnisgewinnung und die Eigenschaften naturwissenschaftlichen Wissens ist in einem durch Naturwissenschaften und Technik geprägten Alltag unverzichtbar (z. B. NGSS Achieve Inc., 2013). Viele Autoren gehen davon aus, dass Schüler durch das Konstruieren, Testen und Ändern von Modellen ein Modellverständnis als Bestandteil von Wissenschaftsverständnis erlangen (z. B. Lehrer & Schauble, 2006). Doch bisher konnte keine Studie gefunden werden, die diesen Zusammenhang empirisch belegt. Daher wurde auf der theoretischen Basis des Modells der Modellbildung nach Justi und Gilbert (2002) eine standardisierte Hands-On-Aufgabenstruktur entwickelt und evaluiert. Sie regt Schülerinnen und Schüler dazu an, Tätigkeiten der Modellbildung auszuführen, um eigene Hypothesen zu untersuchen. Dabei aktivierte Schülervorstellungen wurden mit einer Methodenkombination aus Lautem Denken, Interview und Videoaufzeichnung erfasst. Zur Beurteilung der Qualität aktivierter Vorstellungen in unterschiedlich elaborierten Ausprägungen wurde das Kompetenzmodell der Modellkompetenz von Upmeier zu Belzen und Krüger (2010) herangezogen. Als grundlegendes Ergebnis zeigt sich, dass die meisten Probanden der zehnten Jahrgangsstufe trotz unterstützender und strukturierender Maßnahmen keine Vorstellungen über Modelle als Erkenntnismethoden äußerten. Doch in der Arbeit werden andere erfolgreiche Lernangebote zur Aktivierung epistemologischer Schülervorstellungen beschrieben. Eine weitere Erkenntnis der Studie ist, dass die durch Justi und Gilbert (2002) beschriebenen Schritte zur Modellbildung mit Blick auf zukünftige Interventionen um drei Aspekte erweitert werden können. Außerdem werden mit Blick auf die Anbindung in den Schulkontext Unterschiede zwischen grafischen, gegenständlichen und verbalen Modellbildungsprozessen reflektiert, die mithilfe eines qualitativen, experimentellen Untersuchungsdesigns erfasst wurden. / Various authors claim that students achieve a better understanding of the nature of science and scientific inquiry through modeling (e.g. Lehrer & Schauble, 2006). In this process, students develop models of a phenomenon, test their ideas with the model, change the models and discuss the results. Whether students do indeed achieve a better understanding of the nature of science and scientific inquiry through the process of modeling cannot be answered sufficiently by current research. That’s why, in this study the model of modeling by Justi and Gilbert (2002) was transferred into a standardized hands-on tasks. The task forces students to analyze their own questions about a biological phenomenon by building, testing and changing models. In this process, students’ conceptions were captured with a combination of interviews, thinking aloud and videography. The theoretical structure of model competence by Upmeier zu Belzen and Krüger (2010) served to assess the quality of the student statements. A fundamental result of this study is that the participants at the age of sixteen expressed mainly ideas about models as a product of science despite supportive measures. The thesis describes other offers of the hands-on tasks which enable ideas about models as inquiry methods. Another finding of the study is that the modeling steps of Justi and Gilbert (2002) can be extended to three aspects. In addition, and overlooking the school context, differences between graphic, material and verbal modeling processes are described. These were analyzed using a qualitative, experimental study design.
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Functional genome analysis of the plant-growth promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42

Koumoutsi, Alexandra 18 January 2007 (has links)
Bacillus amyloliquefaciens FZB42 ist ein im Boden weit verbreitetes Bakterium. Es kolonisiert Pflanzenwurzeln und werde als Biodünger verwendet, da sie in der Lage sind, Pflanzenwachstum zu fördern. Der domestizierte Stamm B. subtilis 168 ist eng verwand mit B. amyloliquefaciens FZB42, fördert jedoch kein Pflanzenwachstum. Als ein erster Ansatz zur Ermittlung von Gendifferenzen zwischen FZB42 und B. subtilis 168 - wobei zum damaligen Zeitpunkt nur die Genomsequenz letzteren Organismus bekannt war - wurde die Supression Subtractive Hybridisation (SSH) angewandt. Hierdurch wurden mehrere einzigartige Gene in B. amyloliquefaziens identifiziert. Unterdessen beteiligte sich unser Labor in Kollaboration mit dem GenoMik Network in Göttingen an einem Projekt, dessen Ziel die komplette Sequenzierung des Genoms von B. amyloliquefaciens war. Der Hauptanteil der Arbeit, sowie die Koordination des gesamten Projekts wurden von Xiao-Hua Chen und mir selbst durchgeführt. B. amyloliquefaciens FZB42 besitzt die srf, fen, pks1 (bae), bac und dhb Operons, welche für die Synthese von Surfactin, Fengycin, Bacillaene, Bacilysin und Bacillibactin verantwortlich sind und die ebenfalls im Genom von B. subtilis 168 enthalten sind. Das Genom von B. amyloliquefaciens FZB42, beinhaltet die bmy Gencluster, die die Synthese von Bacillomycin D kontrolliert. Ein weiteres in dieser Arbeit verfolgtes Ziel war die Identifizierung der regulatorischen Wege, die die Expression von Bacillomycin D steuern. Es wurde gezeigt, dass globale Regulatoren, wie beispielsweise DegU, DegQ und ComA, die alternativen Sigmafaktoren sigB und sigH und ein neuartiges Rap-Protein die transkriptionale Aktivität des in dieser Arbeit identifizierten Hauptpromotors des bmy-Operons beeinflussen. Es wurde gezeigt, dass DegU seine Effekte nach direkter Bindung an zwei unterschiedliche Regionen im bmy-Promotor ausübt. Es wurde außerdem gezeigt, dass DegU abgesehen von der Aktivierung des Hauptpromoters des bmy-Operons eine zusätzliche, vermutlich eine post-transkriptionale Rolle spielt. Auf ähnliche Weise erwies sich YczE, ein Membranprotein unbekannter Funktion, das neben sfp kodiert liegt, als essentiell für die Bacillomycin D-Produktion. Der Effekt wurde auf einem post-transkriptionalen Level ausgeübt und war unabhängig von DegU. / Bacillus amyloliquefaciens FZB42 is widely distributed in the soil. It colonizes the plant roots and is used as bio-fertilizer, since they can promote plant growth.The domesticated strain of B. subtilis 168 is closely related to B. amyloliquefaciens FZB42, but does not promote plant growth. As a first approach to detect gene differentiation between FZB42 and B. subtilis 168, and since only the genome sequence of the latter was known at that point, Suppression Subtractive Hybridization (SSH) was employed. Thereby, several unique genes of B. amyloliquefaciens FZB42 could be identified. Meanwhile, our laboratory became engaged in a project aiming to define the complete genome sequence of B. amyloliquefaciens FZB42, in collaboration with the GenoMik Network in Göttingen. The major part of the work and the co-ordination of the whole process were performed by Xiao-Hua Chen and myself. B. amyloliquefaciens FZB42 possesses the srf, fen, pks1 (bae), bac and dhb operons, which are also shared by B. subtilis 168. In addition, the genome of B. amyloliquefaciens FZB42 contains the bmy gene clusters, which controls the synthesis of bacillomycin D. A further issue pursued in this work was to identify the regulatory pathways that govern the expression of bacillomycin D. Global regulators, such as DegU, DegQ and ComA, the alternative sigma factors, sigB and sigH, and a novel Rap protein were found to affect the transcriptional activation of the main promoter of the bmy operon identified in this work. In particular, DegU was shown to mediate its effects, after binding directly to two sites at the bmy promoter region. DegU was shown to play an additional role on bacillomycin D production, presumably a post-transcriptional one. Similarly, YczE, a membrane protein of unknown function, encoded adjacently to sfp proved to be essential for bacillomycin D production, but dispensable for the production of the rest peptide antibiotics produced by B. amyloliquefaciens FZB42. The effect was mediated at a post-transcriptional level and was independent of DegU.
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Identification of KSRP as a novel protein regulator of the interferon-inducible RNA-dependent protein kinase (PKR) by quantitative mass spectrometry

Sänger, Sandra 16 November 2016 (has links)
Die RNA-abhängige Proteinkinase (PKR) ist eine Interferon-induzierte Proteinkinase mit einer zentralen Rolle in der antiviralen Immunantwort. Die Aktivierung von PKR wird durch Bindung viraler RNA oder spezifischer Protein-Regulatoren ausgelöst und resultiert in der Inhibierung der Translation und Induktion von Transkriptionsfaktoren für die Produktion proinflammatorischer Zytokine. Trotz intensiver Forschung ist es bisher nicht gelungen, das gesamte Spektrum von PKR-Regulatoren und Adaptorproteinen aufzudecken. In der vorliegenden Arbeit wurde mithilfe von quantitativer Massenspektrometrie eine systematische Analyse von PKR Bindungspartnern im Kontext einer Influenzavirusinfektion durchgeführt. Dabei wurden 47 Proteine identifiziert, die nach Infektion mit einem Influenza A Virus spezifisch an PKR gebunden waren. Die Interaktion von PKR und einem Teil der Proteine wurde validiert und es konnte gezeigt werden, dass einige der gefundenen Proteine die PKR-Phosphorylierung verstärkten. Hierbei wurde das KH-Typ Splicing regulatorische Protein (KSRP) als neuer Regulator von PKR identifiziert.Die Aktivierung von PKR durch KSRP wurde dabei durch direkte Interaktion der Proteine über die N-terminale Domäne von PKR vermittelt, war jedoch unabhängig von der RNA-Bindungsfunktion. Immunfluoreszenzversuche zeigten, dass die Infektion mit einer Virusmutante zur Umlagerung beider Proteine in Stress-Granula führte. Verringerte KSRP-Level beeinträchtigten die PKR-Aktivierung, was zu einer 10-fachen Verbesserung der Replikation von mutierten Influenzaviren in Zellen mit verringerter IFN-beta-Expression führte. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass KSRP die antivirale Abwehr durch direkte Bindung an PKR und die damit verbundene Steigerung der PKR-Aktivität unterstützt. Zusammenfassend unterstreichen die Ergebnisse das Vermögen quantitativer Massenspektrometrie antivirale Mechanismen systematisch aufzuklären, um potenzielle Ziele für antivirale Therapien zu finden. / The RNA-dependent protein kinase (PKR) is an interferon induced protein kinase that plays a significant role in innate antiviral immunity. Activation of PKR can be triggered by binding of viral RNA or distinct protein regulators and results in inhibition of translation and the induction of transcription factors that lead to production of proinflammatory cytokines. Over the last decades, extensive research was conducted to identify the whole network of PKR regulators and adaptor proteins, but it is most likely that still some pieces are missing to complete our understanding of PKR functions. This thesis provides a systematic analysis of PKR binding partners in the context of influenza A virus infection by using quantitative mass spectrometry. In total, 47 proteins that bound specifically to PKR after influenza A virus infection were identified. The interaction between PKR and a subset of candidates was validated and it was shown that some of the identified proteins upon overexpression induced PKR phosphorylation. Hereby, the KH-type-splicing regulatory protein (KSRP) was identified as a novel protein regulator of PKR. Activation of PKR by KSRP was mediated by direct interaction of KSRP with the N-terminal domain of PKR, but was found to be independent from dsRNA binding. Immunofluorescence experiments showed that upon infection with an influenza A mutant virus, both proteins were redistributed to cytoplasmic stress granules. Knockdown of KSRP impaired PKR activation and consequently rescued viral replication of influenza A mutant viruses by one order of magnitude in cells with reduced IFN-beta levels. It was shown for the first time that KSRP is able to support antiviral signalling by enhancing PKR activation in a process that involves direct protein-protein-interaction. Taken together, this study demonstrates the aptitude of quantitative mass spectrometry for elucidation of cellular antiviral response pathways to reveal potential new targets for antiviral therapy.
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Analysis of Chriz involved in Drosophila polytene chromosome structuring and binding

Gan, Miao 02 September 2009 (has links)
Polytäne Chromosomen von Drosophila sind in eine Abfolge von Banden und Interbanden unterschiedlichen Kompaktionsgrades gegliedert. Das Protein Z4 ist notwendig, um dieses Muster aufrecht zu erhalten (Eggert et al., 2004). Durch Koimmunpräzipitation mit Z4 wurde in unserer Arbeitsgruppe ein Chromodomänen Protein identifiziert, das von uns als Chriz bezeichnet wurde (Gortchakov et al., 2005). In meiner Arbeit testete ich die Interaktion zwischen den vollständigen Proteinen Chriz und Z4. Ich konnte dabei zeigen, dass beide Proteine in vivo direkt miteinander interagieren. Die kartierten Interaktionsdomänen am N-Terminus von Z4 und am C-Terminus von Chriz sind hinreichend für die wechselseitige Interaktion beider Proteine. Chriz ist wie Z4 in vielen Interbanden polytäner Interphasechromosomen gebunden. Die überexpression verschiedener Domänen von Chriz zeigte, dass sowohl der N- als auch der C-Terminus von Chriz für die Interbandenbindung von Chriz ausreichend sind. Der Chriz C-Terminus ist dar Über hinaus notwendig, um das überleben von Tieren mit einer Chriz Null Mutation bis in das larvale Stadium zu gewährleisten. Tiere mit induziertem Chriz RNAi knock down zeigten eine verringerte DNA Kondensation polytäner Chromosomen. Die Ähnlichkeit des chromosomalen Phänotyps von Z4 und Chriz Mutationen legt nahe, dass beide Proteine in einem gemeinsamen Komplex in Interbanden vorkommen. Unter Ausnutzung von Chriz RNAi bzw. Z4 RNAi konnte ich zeigen, dass die chromosomale Bindung von Z4 von Chriz abhängt. Weiterhin sind die Proteinkinase Jil-1 und an Serin 10 phosphoryliertes H3 (H3pS10), beides Marker für dekondensiertes Chromatin, in Chriz RNAi Tieren verringert. Aus meinen Daten schliesse ich, dass Chriz/Z4/Jil-1 in einem gemeinsamen Komplex an Interbanden gebunden sind. Chriz ist dabei fundamental wichtig für die zielgerichtete Bindung und Stabilität des Komplexes. Der Komplex selbst ist erforderlich, um die lokale Chromatinstruktur aufrecht zu erthalten. / Drosophila polytene chromosomes are compacted into a series of bands and interbands. Z4 is a protein to keep this pattern, since Z4 mutant larvae show a decompaction of chromosomes and a loss of banding pattern (Eggert et al., 2004). By coimmuno-precipitation, we identified a chromodomain protein, which we named Chriz, for chromodomain protein interacting with Z4 (Gortchakov et al., 2005). In my PhD thesis, I tested the interactions between the full length proteins and different fragments of Chriz and Z4 which showed that Chriz could directly interact with Z4 in vivo. The interaction domains were mapped and it was determined that the N terminus of Z4 and the C terminus of Chriz are sufficient for mutual interaction. GST pull down confirmed these data and more precisely localized the interaction domains. Chriz, like Z4, is present in many interbands of interphase polytene chromosomes. The overexpression of different domains of Chriz demonstrated that both the N and C terminus are sufficient for targeting of Chriz to interbands. The C terminus was shown to be sufficient for rescue of Chriz null mutations into larva stage. Chriz full length proteins, with site directed mutations within the chromodomain, could still partially rescue the null mutant. Chriz RNAi knock down resulted in a loss of structure of polytene chromosome. The similar chromosomal phenotype of Z4 and Chriz indicate that they cooperate in the formation of chromosomal structure. Using the Chriz RNAi, I showed that Z4 chromosomal binding is dependent on Chriz. However, by a similar assay I showed that Chriz binding did not depend on Z4. Finally, the decondensed interphase chromatin marker Jil-1, a H3S10 histone kinase, and H3pS10 are decreased in Chriz RNAi line. From these data, I conclude that Chriz/Z4/Jil-1 form an interband binding complex. Chriz is the fundamental factor for the chromosomal targeting and stabilitation of the complex that is required to maintain locally chromatin structure.

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