Die Invasion von Leukozyten in das zentrale Nervensystem (ZNS) ist ein wesentlicher Bestandteil bei der Pathogenese von Hirnverletzungen sowie akuten und chronischen Entzündungsvorgängen im Gehirn. Mikrogliazellen, die überwiegende Population immunkompetenter Zellen des ZNS, stellen die erste Verteidigungslinie im Hinblick auf Verletzungen und Erkrankungen des Gehirns dar. Im Rahmen vieler neurodegenerativer Erkrankungen wird die Zerstörung von Neuronen, aber auch die kollaterale Gewebsschädigung auf die Aktivierung der Mikrogliazellen zurückgeführt. Die vorliegende Arbeit beschreibt erstmalig einen regulatorischen Aktivierungszustand der Mikroglia (CD40dimCD86dimIL-10high), der zur Induktion regulatorischer Foxp3+ T-Zellen (Treg) führt. Die Stabilität und funktionelle Aktivität Mikroglia-induzierter Treg konnte sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden. In vitro inhibierten sie die Proliferation antigen-spezifischer Effektorzellen, in vivo führte ein adoptiver Transfer der regulatorischen T-Zellen zur Abmilderung des Krankheitsverlaufes experimentell induzierter, autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE). Mikrogliazellen unterstützten sowohl die Proliferation bereits ausgebildeter regulatorischer T-Zellen als auch deren Differenzierung aus naiven T-Zellen. Die Induktion regulatorischer T-Zellen durch Mikroglia war Major Histocompatibility Complex (MHC)-II-abhängig und antigenspezifisch. Für Untersuchungen zur in vivo Relevanz wurden MHC-II-chimäre Mäuse generiert und eine Läsion im entorhinalen Kortex gesetzt. Fehlte MHC-II in ZNS-residenten Zellen, wurden weniger regulatorische T-Zellen pro Leukozyt in die lädierten Hemispheren rekrutiert. Zusammenfassend demonstrieren diese Ergebnisse das Modulationspotential von Mikrogliazellen auf die CD4+ T-Zellantwort. Die Mikroglia-induzierte Differenzierung und Proliferation von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen ist ein möglicher Mechanismus der Regulation von Entzündungsvorgängen im ZNS durch Mikrogliazellen. / The invasion of leukocytes into the central nervous system (CNS) is a key event in the pathogenesis of CNS injury and acute or chronic inflammatory neurological diseases. However, regulatory mechanisms of local innate immune responses that limit CNS inflammation are only poorly understood. Microglia are the predominant innate immune cells of the brain and present the first line of defence in CNS injury or disease. In the context of neurodegenerative disease, microglia activation accounts for collateral tissue damage and neurodestruction. This thesis for the first time describes a regulatory microglia phenotype (MHCII+CD40dimCD86dimIL-10high) that induced a strong Foxp3+ regulatory T cell (Treg) response. Microglia-induced Treg cells were stable and functionally active in vitro by inhibiting antigen-specific proliferation of effector T cells and in vivo, by attenuating experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) disease course after adoptive transfer. The data also suggested that regulatory microglia can mediate both, proliferation of Foxp3+ Treg cells and de novo differentiation from naive CD4+ T cells. Microglia-mediated Treg induction was proven to be MHCII and antigen-dependent. Using entorhinal cortex lesion (ECL) as a brain injury mouse model, diminished Foxp3+ Treg cell recruitment per infiltrated leukocyte in chimeric mice lacking MHCII specifically in the CNS was demonstrated, indicating in vivo relevance of antigen presentation by brain resident cells. Taken together, these findings demonstrate that microglial cells can directly modulate CD4+ T cell responses by regulating molecule levels for efficient antigen presentation and levels of secreted cytokines and chemokines. Microglia-mediated differentiation and proliferation of Foxp3+ Treg cells can be one of the mechanisms how microglia contribute to local immune homeostasis and limit CNS inflammation.

Schicht 2 des mediale entorhinale Kortex (MEK) beinhaltet die größte Anzahl von Gitterzellen, welche durch ein hexagonales Aktivitätsmuster während räumlicher Exploration gekennzeichnet sind. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass spezielle Pyramidenzellen, die das Protein Calbindin exprimieren, in einem hexagonalen Gitter im Gehirn der Ratte angeordnet sind und cholinerg innerviert werden. Es ist bekannt, dass die cholinerge Innervation wichtig für die Aktivität von Gitterzellen ist. Weiterhin ergaben neuronale Ableitungen und Methoden zur Identifikaktion einzelner Neurone in frei verhaltenden Ratten, dass Calbindin-positive Pyramidenzellen (Calbindin+) eine große Anzahl von Gitterzellen beinhalten. Reelin-positive Sternzellen (Reelin+) im MEK, zeigten keine anatomische Periodizität und ihre Aktivität orientierte sich an den Begrenzungen der Umgebung. Eine weitere Studie untersucht die Architektur des MEK in verschiedenen Säugetieren, die von der Etrusker Spitzmaus, bis hin zum Menschen ~100 Millionen Jahre evolutionäre Vielfalt und ~20,000 fache Variation der Gehirngröße umfassen. Alle Arten zeigten jeweils eine periodische Anhäufung der Calbindin+ Zellen, was deren evolutive Bedeutung unterstreicht. Eine Studie zur Ontogenese der Calbindin Anhäufungen ergab, dass die periodische Struktur der Calbindin+ Zellen, sowie die verstreute Anordnung der Reelin+ Sternzellen schon zum Zeitpunkt der Geburt erkennbar war. Weitere Ergebnisse zeigen, dass Calbindin+ Zellen strukturell später ausreifen als Reelin+ Sternzellen - passend zu der Erkenntnis, dass Gitterzellen funktionell später reifen als Grenzzellen. Eine Untersuchung des Parasubiculums ergab, dass Verbindungen zum MEK präferiert in die Calbindin Anhäufungen in Schicht 2 projizieren. Zusammenfassend beschreibt diese Doktorarbeit eine Dichotomie von Struktur und Funktion in Schicht 2 des MEK, welche fundamental für das Verständnis von Gedächtnisbildung und deren zugrundeliegenden Mikroschaltkreisen ist. / The medial entorhinal cortex (MEC) is an important hub in the memory circuit in the brain. This thesis comprises of a group of studies which explores the architecture and microcircuits of the MEC. Layer 2 of MEC is home to grid cells, neurons which exhibit a hexagonal firing pattern during exploration of an open environment. The first study found that a group of pyramidal cells in layer 2 of the MEC, expressing the protein calbindin, were clustered in the rat brain. These patches were physically arranged in a hexagonal grid in the MEC and received preferential cholinergic-inputs which are known to be important for grid-cell activity. A combination of identified single-cell and extracellular recordings in freely behaving rats revealed that grid cells were mostly calbindin-positive pyramidal cells. Reelin-positive stellate cells in MEC were scattered throughout layer 2 and contributed mainly to the border cell population– neurons which fire at the borders of an environment. The next study explored the architecture of the MEC across evolution. Five mammalian species, spanning ~100 million years of evolutionary diversity and ~20,000 fold variation in brain size exhibited a conserved periodic layout of calbindin-patches in the MEC, underscoring their importance. An investigation of the ontogeny of the MEC in rats revealed that the periodic structure of the calbindin-patches and scattered layout of reelin-positive stellate cells was present around birth. Further, calbindin-positive pyramidal cells matured later in comparison to reelin-positive stellate cells mirroring the difference in functional maturation profiles of grid and border cells respectively. Inputs from the parasubiculum, selectively targeted calbindin-patches in the MEC indicating its role in shaping grid-cell function. In summary, the thesis uncovered a structure-function dichotomy of neurons in layer 2 of the MEC which is a fundamental aspect of understanding the microcircuits involved in memory formation.

Embryonen von Höheren Krebsen (Malacostraca) zeigen ein stereotypes Zellteilungsmuster im Ektoderm des Rumpfes, im Verlaufe dessen paarige seitliche Reihen von Zellen und eine unpaare mittlere Reihe von Zellen gebildet werden. Das Muster der seitlichen Zellen ist von Dohle (1970, 1976) und Mitarbeitern geklärt worden. Die vorliegende Arbeit untersucht die cell lineage und Zelldifferenzierung der Mittellinienzellen im Thorax. Diese Zellen sind von besonderem Interesse, weil sie bei Insekten bereits intensiv erforscht wurden. (i) Die DiI Markierungen von Mittellinienzellen von Orchestia cavimana zeigen: Die Bildung der Mittellinie beginnt mit einer Zelle, die sich zweimal in Längsrichtung teilt. Die resultierenden vier Zellen werden mit a0, b0, c0 und d0 bezeichtet. Aus den Zellen a0, b0 und c0 gehen Paare von Gliazellen hervor. Die Tochterzellen von a0 und c0 umhüllen die Kommissuren. Die Zelle d0 ist ein medianer Neuroblast, aus dem mehrere Neurone hervorgehen, unter anderem ein unpaares Neuron im medianen Fasertrakt, interneurone und ein Motoneuron. (ii)BrdU Markierungen von Porcellio scaber zeigen: In den Ganglienanlagen liegt in der Mittellinie je eine Zelle, die größer ist als die benachbarten, schneller proliferiert und deshalb vermutlich ein medianer Neuroblast ist. (iii) Die Expression von engrailed setzt bei Orchestia und Porcellio ein in der Zelle a0 und wird in den zwei Tochterzellen fortgesetzt. Für Orchestia wird gezeigt, daß diese Expression zurückgeht und die Tochterzellen der Zelle d0 de novo mit einer Expression von engrailed beginnen.Aus den Ergebnissen kann abgeleitet werden, daß der gemeinsame Vorfahr von Insekten und Höheren Krebsen eine Mittellinie differenziert, die Vorläufer für Glia der Kommissuren und einen medianen Neuroblasten umfaßt und eine Expression von engrailed in den Tochterzellen des Neuroblasten zeigt. / Embryos of higher crustaceans (Malacostraca) show a highly stereotypic cell division pattern in the ectoderm of the trunk region while forming paired rows of lateral cells and an unpaired median row of midline cells. By using nuclear dyes, the pattern of the lateral cells has been determined by Dohle (1970, 1976) an co-workers. This study addresses the cell lineage and cell differentiation of the midline cells in the thorax. These kind of cells are of particular interest as they have been investigated extensively in insects. (i) The DiI labelling of midline cells in Orchestia cavimana reveals: Formation of the midline starts with a single midline cell that divides twice in longitudinal direction. The resulting four cells are termed a0, b0, c0, and d0. The cells a0, b0, and c0 give rise to pairs of glial cells. The progeny of a0 and c0 enwrap the commissures. The cell d0 is a median neuroblast that gives rise to several neurons, among them an unpaired neuron in the median fibre tract, interneurons and probably a single motoneuron. (ii) BrdU labelling in Porcellio scaber shows: there is a single larger and faster dividing cell in the midline in each segmental ganglion anlage that is a putative median neuroblast. (iii)The expression of engrailed starts in Orchestia and Porcellio the cell a0 and continues in the two daughter cells during segmentation. In Orchestia it can be shown that this expression ceases and progenies of the cell d0 start de novo with the expression of engrailed. From the results can be concluded that the common ancestor of insects and higher crustaceans differentiated an unpaired midline comprising precursors for glial cells enwrapping the commissures and a single median neuroblast whose derivatives express engrailed.

Das Kolonkarzinom ist eine der häufigsten Tumorerkrankungen weltweit. Etwa 50 % der Patienten entwickeln Fernmetastasen. Diese haben eine sehr schlechte Überlebensprognose. Deshalb fokussiert die Forschung auf die Identifizierung neuer, molekularer Marker für eine verbesserte Metastasierungsvorhersage. Identifizierte Hochrisiko-Patienten könnten somit rechtzeitig eine individualisierte, intensivere Therapie erhalten. MACC1 (Metastasis-associated in colon cancer 1) ist ein neu identifiziertes Gen, das in Kolonkarzinomen und deren Fernmetastasen überexprimiert wird. Die Domänenstruktur von MACC1 ist kennzeichnend für Proteine der Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalwege. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der zellulären Funktion von MACC1 und seiner Rolle in der Tumorprogression sowie die Evaluierung von MACC1 als molekularer Metastasierungsmarker. MACC1-überexprimierende Tumorzellen zeigten in Abhängigkeit von der Domänenstruktur in in vitro Assays ein erhöhtes migratorisches, invasives und proliferatives Potential. Der Einfluss von MACC1 auf die Metastasierungskapazität von Tumorzellen konnte auch im Tiermodell belegt werden. Der Hepatocyte-growth-factor (HGF) induziert die epitheliale-mesenchymale Transition MACC1-exprimierender Zellen und die nukleäre Translokation von MACC1. Die Expression des HGF-Rezeptors Met war in diesen Zellen stark erhöht. Reportergen-Studien bestätigten die transkriptionelle Regulation von Met durch MACC1. Die Analyse humaner Kolonkarzinome ergab eine signifikant höhere MACC1 Expression in Primärtumoren mit metachroner Fernmetastasierung. MACC1 ist ein neu identifizierter Regulator des HGF/Met-Signalweges und trägt somit entscheidend zur Determinierung des metastatischen Potentials von Tumorzellen bei. MACC1 hat großes Potential als neuer, prognostischer Marker für die Metastasierung des Kolonkarzinoms und ist ein Kandidatengen als Ziel effektiver, molekularer Interventionsstrategien zur Metastasierungs-Prävention. / Colon cancer is one of the most frequent malignant diseases worldwide. About 50% of the patients develop distant metastasis. These patients have only few therapy options and very poor survival rates. Therefore cancer research focuses on the identification of novel molecular markers to provide a better prognosis of the metastatic risk. Identified high-risk patients would get access to an early, individualized therapy. MACC1 (metastasis associated in colon cancer 1) is a newly identified gene that is overexpressed in colon carcinomas and their distant metastases. The MACC1 domain structure is characteristic for proteins of the receptor tyrosine kinase signalling pathways. Aim of this study was the analysis of the cellular function of MACC1, its role in tumor progression and its evaluation as a molecular, prognostic marker for metastasis. MACC1 overexpressing tumor cells revealed higher migratory, invasive, and proliferative potential in in vitro assays. The impact of MACC1 on the metastatic potential of tumors was also shown in mouse models. The hepatocyte growth factor (HGF) induced epithelial-mesenchymal-transition in MACC1 positive cells and MACC1´s nuclear translocation. Expression of the HGF receptor Met was strongly elevated in these cells. Reporter gene experiments confirmed the transcriptional regulation of Met by MACC1. Analyses in human colon carcinomas showed a significantly higher MACC1 expression in tumors that developed distant metastases. MACC1 is a newly identified regulator of the HGF/Met signalling pathway. It contributes decisively to the metastatic capacity of tumor cells. MACC1 has great potential as new prognostic marker for colon cancer metastasis and is a promising candidate as target for effective, molecular intervention strategies for metastasis prevention.

Die molekularbiologische Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Pathogenen und ihren Wirtszellen ist ein wertvoller Ansatz zur Erschließung bakterieller Pathogenitätsmechanismen und hilft, unser ständig wachsendes Wissen über fundamentale Prozesse in eukaryotischen Zellen zu erweitern. Das Gram-negative Bakterium Salmonella Typhimurium ist ein gängiger Modellorganismus, um den intrazellulären Lebensstil bakterieller Pathogene und deren Einfluss auf Wirtszellprozesse zu erforschen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein FACS-basierter Hochdurchsatz RNA Interferenz Screen etabliert und durchgeführt, um Wirtszellfaktoren zu entschlüsseln, welche in die intrazelluläre Replikation von Salmonella Typhimurium in humanen Epithelzellen involviert sind. Ein Salmonellen-Stamm, der zwei fluoreszierende Reporterproteine exprimiert, wurde konstruiert, um die bakterielle Replikation und die metabolische Aktivität in infizierten Wirtszellen zu detektieren. Der Einsatz einer humanen Kinase-Bibliothek lieferte 48 potentielle Kandidatengene, von denen 15 in einer anschließenden Validierung als relevante Faktoren identifiziert werden konnten. Die Mitogen-aktivierte Protein Kinase MKK7, deren Depletion eine verminderte bakterielle Replikation zur Folge hatte, wurde für eine weitergehende funktionelle Charakterisierung ausgewählt. Es zeigte sich, dass reduzierte MKK7 Proteinmengen eine Verringerung des Proteins zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) durch eine transkriptionelle Regulation zur Folge hatten. Die Bedeutung von cPLA2 für die bakterielle Infektion wurde durch die Salmonellen-induzierte, dauerhafte Phosphorylierung des Faktors deutlich und konnte durch Replikationsvergleiche in cPLA2-depletierten und nicht-depletierten Zellen bestätigt werden. Mikroskopische Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Phospholipase für den fehlerfreien Aufbau von Salmonellen-induzierten Filamenten notwendig ist, welche unerlässlich für die Salmonellenreplikation in Epithelzellen sind. / The study of pathogen-host cell interactions on the molecular level is a valuable tool to reveal bacterial pathogenicity mechanisms and, moreover, contributes to our increasing knowledge of fundamental cellular processes of eukaryotic cells. The Gram negative bacterium Salmonella Typhimurium is a well established model organism to investigate the intracellular lifestyle of bacterial pathogens and their modulation of host cell processes. In this work, a FACS-based high-throughput RNA interference screen was established and performed to elucidate host cell factors involved in the intracellular replication of Salmonella Typhimurium. A Salmonella strain expressing two fluorescent reporter constructs was generated which allowed for monitoring the bacterial replication and metabolic activity within infected cells. A human kinome-wide siRNA library was screened and 48 candidates were chosen for further validation. Among these, 15 host cell genes were identified to influence Salmonella intracellular replication. The mitogen activated protein kinase MKK7, whose depletion caused a decrease in bacterial replication, was selected for a more profound functional characterization. It could be demonstrated that the knock down of MKK7 caused a decrease in phospholipase A2 (cPLA2) protein levels due to a transcriptional regulation. A role for cPLA2 during the bacterial intracellular lifestyle was implicated by the finding that Salmonella induced a permanent phosphorylation of the phospholipase. The necessity of cPLA2 was confirmed with replication assays in cPLA2 depleted cells using siRNA and shRNA mediated knock down strategies. Microscopic experiments indicated that the phospholipase A2 is involved in the accurate generation of Salmonella-induced filaments, structures that were reported to be indispensable for replication.

Auf Adenoviren (Ads) basierende Vektoren wurden als ein gezielter Anti-Krebs-Wirkstoff entwickelt, der erfolgversprechende Resultate in prä-klinischen Studien erzielen konnte. Solche onkolytischen Ads sind zwar in klinischen Studien generell als sicher eingestuft worden, konnten jedoch die therapeutischen Erwartungen nicht erfüllen. In dieser Doktorarbeit konnte, unter Verwendung der Genexpressionsprofile von Ovarialkarzinom-Zellen, der epitheliale Phänotyp als Hindernis für allgemein verwendete onkolytische Ads, die auf den Coxsackie- und Adenovirusrezeptor (CAR) oder CD46 ausgerichtet sind, identifiziert werden. Der Zugang zu den Virus-Rezeptoren war zwingend an Zelldepolarisation und den Verlust der epithelialen Zonulae occludens und adherens gekoppelt, was Merkmale der Epithelial-zu-Mesenchymal-Transition (EMT) darstellt. Bedeutsam ist in diesem Zusammenhang, dass Tumore in situ als auch Xenograft-Tumore zum größten Teil aus Epithelzellen oder epithelial/mesenchymalen (E/M) Hybrid-Zellen bestehen. Diese E/M Hybrid-Zellen sind die einzigen Zellen, welche an Zellkulturbedingungen adaptieren, wo sie durch EMT während weiterem Passagieren in Mesenchymzellen differenzieren. Bemerkenswert ist hierbei die Tatsache, dass nur Mesenchymzellen und E/M Hybrid-Zellen, die sich im EMT-Prozess befanden, sensitiv zu viraler Onkolyse waren. In Versuchen, die festgestellte Resistenz zu überwinden, wurde herausgefunden, dass bisher nur wenig erforschte Adenovirus-Serotypen (Ad3, Ad7, Ad11 und Ad14), welche einen anderen Rezeptor als CAR oder CD46 auf Zellen benutzen, besser geeignet sind, um polarisierte Epithelzellgewebe zu infizieren. Diese Ads induzierten EMT-ähnliche Prozesse in Ovarialkarzinom-Kulturen mit epithelialem Phänotyp, was zu deren effizienter Onkolyse führte. Die vorliegende Arbeit trägt somit zur Aufklärung der Diskrepanz zwischen der Virustherapie-Effizienz in vivo und in vitro bei und bietet Anhaltspunkte für die Konstruktion von zukünftigen onkolytischen Ads. / Vectors based on adenoviruses have been designed as targeted anti-cancer therapeutics that showed promising results in pre-clinical applications. In clinical trials, these oncolytic adenoviruses have generally been proved safe in patients, but have fallen short of their expected therapeutic value. In this thesis the susceptibility of primary ovarian cancer cells to oncolytic adenoviruses was studied in order to identify cellular mechanisms that confer resistance to virotherapy. Using gene expression profiling of cancer cells either resistant or susceptible to viral oncolysis, it was discovered that the epithelial phenotype of ovarian cancer represents a barrier to infection by commonly used oncolytic adenoviruses targeted to coxsackie- and adenovirus receptor (CAR) or CD46. Accessibility to viral receptors was critically linked to depolarization and the loss of tight and adherens junctions, both hallmarks of epithelial-mesenchymal transition (EMT). Importantly, tumors in situ as well as xenograft tumors derived from primary ovarian cancer cells mostly contained epithelial cells and cells that are in an epithelial/mesenchymal (E/M) hybrid stage. These E/M cells are the only xenograft-derived cells that can be cultured and with passaging undergo EMT to differentiate into mesenchymal cells. Notably, only mesenchymal cells and E/M cells in the process of EMT were susceptible to viral oncolysis. In attempts to overcome the observed resistance, it was found that thus far little explored adenovirus serotypes (Ad3, Ad7, Ad11, and Ad14), which use cellular receptor(s) other than CAR and CD46, have superior oncolytic abilities on polarized epithelial tissue. This study therefore contributes to the clarification of observed discrepancies between virotherapy performances in vitro and in vivo and gives a rationale for the construction of future oncolytic adenoviruses.

Einleitung: Die im Genom der Schweine integrierten porzinen endogenen Retroviren (PERV) gehören zu den potentiellen humanpathogenen Erregern, die eines der Risiken bei der Xenotransplantation darstellen. Für die Abschätzung des Infektionsrisikos von PERV sind drei Verfahrensweisen von Bedeutung: Erstens die Evaluierung der PERV-Freisetzung aus porzinen Zellen und Geweben; Zweitens die Etablierung eines In vivo-Infektionsmodells und Drittens ein retrospektives Screenen von Patienten. Methoden: Die PERV-Expression in Inselzellen von Schweinen der Deutschen Landrasse wurde in vitro und in vivo evaluiert. Anschließend wurde PERV auf nicht-humanen Primatenzellen passagiert. In einem zweiten Modellversuch wurde murinen Zellen in vitro und SCID-Mäusen in vivo zellfreies PERV appliziert. Schließlich wurden Seren von Patienten analysiert. Ergebnisse: Die untersuchten Inselzellen setzten keine Viruspartikel frei und konnten somit weder humane Zellen noch BALB/c-Mäuse infizieren. Die verwendeten Affenzellen produzierten infektiöses PERV mit geringer Replikation. Weder in den murinen Modellversuchen noch in den untersuchten Patienten wurde eine Übertragung von PERV beobachtet. Schlussfolgerung: Schweine der Deutschen Landrasse könnten als Ausgangsbasis für die Zucht sicherer Schweine für die Xenotransplantation dienen. Da keine Infektion verschiedener muriner Zellen mit PERV beobachtet wurde, muss angenommen werden, dass Publikationen anderer Arbeitsgruppen, die eine PERV-Infektion in SCID-Mäusen diagnostizierten, ein falsch-positives Ergebnis aufgrund von Mikrochimärismus oder aufgrund von Pseudotypisierungen mit murinen endogenen Retroviren wiedergeben. Unsere Befunde werden dadurch erhärtet, dass der Rezeptor für PERV-A auf murinen Zellen nicht exprimiert wird und diese auch in vitro nicht infiziert werden konnten. In Übereinstimmung mit den weltweit etwa 200 behandelten Patienten konnte auch in den beiden neuen Studien keine Übertragung von PERV festgestellt werden. / Objective: Porcine endogenous retroviruses (PERVs) are integrated in the porcine genome and are able to infect human cells in vitro. Therefore, PERVs are one of the possible pathogens which poses a risk for xenotransplantations. In this study three significant methods were used to evaluate the infectious risk of PERV: The release of PERV particles from porcine cells and tissues, the formation of an in vivo infection model and a retrospective screening of patients. Methods: Islet cells from german landrace pigs were co-cultivated with human cells in vitro and were transplanted in BALB/c mice in vivo. Serial passaging experiments were performed with nonhuman primate cells. Murine cells were incubated in vitro and SCID mice in vivo with PERV. Sera of patients who were treated ex vivo with porcine liver cells and who had received islet cells were investigated for antibodies against PERV. Results: No virus release were observed in german landrace islet cells, thus they were neither able to infect human cells nor BALB/c mice. The used nonhuman primate cells released low replicating PERVs. None of the murine cells could be infected by PERV and no provirus integration was observed in different SCID mice organs. PERV-specific antibodies were found in none of the investigated patients. Conclusion: German landrace pigs could be used as a source for breeding safe genetically modified pigs suitable for xenotransplantation. Since there were no detectable PERV infection of different murine cells and SCID mice, it have to be supposed, that previously reported PERV transmissions to SCID mice might be due to microchimerism or to pseudotyping of murine endogenous retroviruses. Our results were confirmed by the fact, that the receptor for PERV-A is not expressed on murine cells and that these cells could not be infected in vitro. The absence of a PERV transmission in the investigated patients, correspond to the results obtained from approximately twohundred treated patients worldwide.

Se ist ein essentielles Spurenelement, das seine biologische Aktivität als Selenocystein in den katalytischen Untereinheiten von Selenoproteinen entfaltet. Es wird als Supplement in der Prävention und Therapie einiger Volkskrankheiten wie Autoimmunerkrankungen und Krebs eingesetzt. Die verfügbaren Ergebnisse der klinischen Studien deuten auf geschlechtsspezifische Unterschiede in der Wirksamkeit von Se. Aus diesem Grunde sollte in der vorliegenden Arbeit die Biosynthese von Selenoproteinen in männlichen und weiblichen Mäusen als Modellorganismus für höhere Säugetiere analysiert und verglichen werden. Die gewonnenen Ergebnisse belegen eindeutig, dass die mRNA Konzentrationen von Selenoprotein P, der 5''-Iodothyronin-Deiodase Typ 1 und der extrazellulären Glutathion-Peroxidase 3 geschlechtsspezifische Unterschiede aufweisen. Dieser Dimorphismus ist jedoch nicht konstant, sondern variiert von Gewebe zu Gewebe und zeigt überdies auch eine Abhängigkeit vom Se-Status der Tiere und dem untersuchten Mausstamm. Überraschenderweise korrelieren die resultierenden Proteinmengen nicht linear mit den Unterschieden der mRNA Konzentrationen. Besonders die 5''-Iodothyronin-Deiodase Typ 1 zeigt ausgeprägte Unterschiede in Leber und Niere, wobei sich die Geschlechtsdimorphismen auf mRNA- und Protein-Ebene unterschiedlich stark ausprägen und vom Se-Status beeinflusst werden. Zusammengenommen zeigt diese Arbeit, dass die Expression von Selenoproteinen auf zwei Kontrollebenen geschlechtsspezifisch reguliert wird: über steroidabhängige Gentranskription werden unterschiedliche mRNA Konzentrationen abhängig vom Mausstamm, Alter und Se-Status in den Geweben exprimiert, und über noch nicht eindeutig identifizierte Mechanismen wird die Effektivität, mit der diese Transkripte in die entsprechenden Selenoproteine übersetzt werden, geschlechtsspezifisch kontrolliert. Diese Se-abhängige Regulation der Biosyntheserate, die vermutlich über eine veränderte Translationseffizienz erfolgt, stellt ein sehr überraschendes Ergebnis dar. Sollte es sich in menschlichen Proben bestätigen, so könnten diese Ergebnisse helfen, die geschlechtsspezifischen Befunde in den klinischen Supplementationsstudien zu verstehen und entsprechend abgestimmte Empfehlungen für eine unterschiedliche Supplementation von Mann und Frau zu erarbeiten. / Selenium is an essential trace element and acts as Selenocystein in the catalytic entity of selenoproteins. It is currently in use as supplement in the prevention and therapy of a variety of diseases including autoimmune diseases and cancer. The epidemiological and clinical data indicate that the effectiveness of Se supplementations is sex-specific. Therefore, this thesis was initiated to analyse and compare the expression of selenoproteins in male and female mice as a suitable model organism for higher mammals. The experimental data clearly indicate that selenoprotein P, type I 5'' iodothyronine deiodinase and the secreted glutathione peroxidase 3 display sex-specific differences in mRNA concentrations. The sexual dimorphic expression patterns of these selenoproteins are not constant but depend on the tissue, the Se-status of the animals and the specific mouse strain analysed. Surprisingly, no direct correlation is observed when mRNA levels and expressed protein concentrations are compared. This becomes very obvious in the case of type I 5'' iodothyronine deiodinase in liver and kidney. Both mRNA and protein levels differ between the sexes in a discordant and Se-dependent manner. Taken together, this thesis indicates that selenoprotein expression is regulated in a sex-specific manner by two different mechanisms. First of all, steroid-dependent gene transcription gives rise to sexually dimorphic mRNA levels in the different tissues. Mouse strain, age and Se-status influence this process. Secondly, the sexes differ profoundly with respect to the efficiency of selenoprotein biosynthesis from a given number of transcripts. Presumably, this process involves Se-dependent translational control mechanisms that have not been described before. Under the assumption that these results can be verified with human samples, it is conceivable that this new mechanism might help to explain some of the enigmatic sex-specific effects observed in human supplementary studies and that sex-specific supplementation regimen need to be worked out in the long run.

In dieser Arbeit wurde die Systematik und Evolution der Viviparidae (Mollusca, Gastropoda, Caenogastropoda) mit einem Fokus auf den asiatischen Gattungen untersucht. Es wurde die erste umfassende gattungsübergreifende Phylogenie der Gruppe mit Vertretern von mehr als 70% der bekannten Viviparidengattungen durch die Analyse eines molekularen Datensatzes aus mitochondrialen wie auch nukleären Sequenzen rekonstruiert. Die Einteilung in die aufgrund von anatomischen Merkmalen beschriebenen Unterfamilien konnte durch die genetischen Untersuchungen bestätigt werden. Neben der molekularen Systematik stand auch die Aufklärung der historischen Biogeographie der Viviparidae im Fokus. Mithilfe von Fossilbelegen und der Anwendung einer molekularen Uhr wurde die Diversifikation dieser Familie in Raum und Zeit untersucht. Abschätzungen über das Alter der Abspaltungen der wichtigsten Abstammungslinien innerhalb der Viviparidae mittels der molekularen Uhr lassen sowohl Vikarianz- als auch Dispersal-Ereignisse am Zustandekommen heutiger Verbreitungsmuster erkennen. Die bisherige systematische Gliederung der Viviparidae ist ausschließlich durch einen conchologischen Ansatz geprägt. Bei der Untersuchung zur Evolution der Schale, unter Berücksichtigung der molekularen Ergebnisse, zeigt sich jedoch, dass eine klare Ordnung innerhalb der Vivipariden, bezogen auf die Entstehung von Farbbändern oder Skulpturierungen auf der Schalenoberfläche, nicht zu erkennen ist. Scheinbar komplexe Schalenmerkmale entstanden mehrfach unabhängig in unterschiedlichen Linien. Es konnte hier aber auch gezeigt werden, dass die Untersuchung von anatomischen Merkmalen im Vergleich zur Schale wesentlich besser geeignet ist, natürliche Verwandtschaftsbeziehungen zu erkennen. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse schaffen die Grundlage für eine in Zukunft nötige Revision der Familie Viviparidae auf Gattungsebene. / This thesis focusses on the systematics and evolution of Viviparidae (Mollusca, Gastropoda, Caenogastropoda), a large and putatively ancient group of ovoviviparous freshwater gastropods with an almost worldwide distribution. With more than 200 described species with highly disparate shells, Asia and Australia have the highest viviparid diversity. Three genetic markers where used to calculate the first molecular phylogeny comprising more than 70% of all extant viviparid genera which provides new insights into the systematics and biogeography of this diverse group of freshwater snails. The traditional division into three subfamilies (Lioplacinae Gill, 1863, Viviparinae Gray, 1847 and Bellamyinae Rohrbach, 1937), based on anatomical data, is supported by the molecular phylogeny. The taxonomy of the Asian taxa is still largely based on shell morphology and rather inconsistent, though, making it difficult to gain deeper insights into their evolution and biogeography at present. The molecular phylogeny presented here indicates that the current shell morphology-based viviparid taxonomy does not reflect the phylogenetic relationships of species and clades. In addition to the focus on molecular systematics, a major part of this thesis is devoted to elucidating the historical biogeography of viviparids. A molecular clock analysis based on a calibration scheme using fossils of varying age and taxonomic affinity was used to yield divergence time estimates for the major viviparid lineages. Ancestral areas were inferred by parsimony and likelihood analyses. Viviparid distribution patterns have been shaped by both dispersal and vicariance events. The study of anatomical features turned out to be considerably better approach for establishing phylogenetic relationships of viviparids, manifested in good support of genera established by molecular data. The results obtained in this work provide the basis for a much needed revision of the Viviparidae at the generic level.

In der vorliegenden Arbeit wurde der spezifische Einfluss verschiedener kernkodierter phagentypischer RNA Polymerasen auf die organelläre Genexpression in Physcomitrella und die mitochondrial Genexpression in Arabidopsis untersucht. Während das Fehlen von AtRpoTm in Arabidopsis und PpRpoTmp1 in P. patens lethal ist, wurden Insertionsmutanten für PpRpoTmp2 und AtRpoTmp einer detailierten Untersuchung unterzogen. Sowohl PprpoTmp2, als auch AtrpoTmp Pflanzen zeigten Abweichungen im Phänotyp charakteristisch für mitochondriale Dysfunktion. Identifizierte organelläre Promotoren in P. patens wurden zum Nachweis der Transkriptionsaktivität von PpRpoTmp1 und PpRpoTmp2 in vitro herangezogen. Beide Proteine besitzen die inhärente Fähigkeit zur Promotorerkennung ohne zusätzliche Kofaktoren. Die hier vorgestellten Studien unterstreichen die essentielle Bedeutung von AtRpoTm und PpRpoTmp1 für die Transkription mitochondrialer bzw organellärer Gene in Arabidopsis und P. patens. Im Gegensatz dazu können die Funktionen von AtRpoTmp und PpRpoTmp2 partiell durch andere organelläre RNAPs ersetzt werden. Phänotypische Abweichungen belegen jedoch, das AtRpoTmp und PpRpoTmp2 für die normale Entwicklung von Arabidosis bzw. P. patens essentiell sind. Veränderte Transkriptmengen in AtrpoTmp Pflanzen korrelierten mit genspezifischen Änderungen in der mitochondrialen Transkription. AtRpoTmp muss daher als essentiel für die normale Expression eines spezifischen Sets mitochondrialer Gene angesehen werden. Jedoch konnten für diese mitochondrialer Gene keine AtRpoTmp spezifischen Promotormotive mit reduzierter Aktivität identifiziert werden. Initiationsraten an allen Promotoren stromaufwärts von mitochondrialen Genen mit geringeren Transkriptmengen sind jedoch reduziert. Es erscheint daher wahrscheinlich, daß für einen Teil der mitochondrialen Gene genspezifische Elemente existieren, welche die Transkription durch AtRpoTmp dirigieren. / This study aimed to elucidate how the different transcriptional activities are facilitated in mitochondria of Arabidopsis thaliana and in both organelles of Physcomitrella patens. Insertional mutants for PprpoTmp2 and AtrpoTmp were analysed in detail. As for Arabidopsis RpoTm, knock-out of Physcomitrella RpoTmp1 was found to be lethal. Null mutant plants PprpoTmp2 and AtrpoTmp show surprisingly similar but clearly convergent phenotypical aberrations reminiscent of phenotypes reported for other mitochondrial mutants. Evidence is provided that PpRpoTmp1 and PpRpoTmp2 are functional RNA polymerases, which both posses the inherent ability to recognize organellar promoters in a minimal in vitro transcription system without the aid of additional cofactors. The data suggest that coding for two RpoT proteins one representing an enzyme with a high portion of non-specific transcriptional activity, as seen for AtRpoTmp and PpRpoTmp1 and one that can act as a single-polypeptide enzyme and recognize numerous mitochondrial promoters in vitro as AtRpoTm and PpRpoTmp2 echo convergent inventions but reflect complementing roles of these RNA polymerases in plant mitochondrial transcription. Phenotypical aberrations of rpoTmp2 plants suggest RpoTmp2 is important for normal growth and development. Altered transcript levels in AtrpoTmp were found to result from gene-specific transcriptional changes, establishing that AtRpoTmp functions in distinct transcriptional processes within mitochondria. Decreased transcription of a specific set of mitochondrial genes in AtrpoTmp was not associated with changes in the utilisation of specific promoters. Therefore AtRpoTmp function is not promoter-specific but gene-specific. This indicates that additional gene-specific elements direct the transcription of a subset of mitochondrial genes by RpoTmp.