Angiogenese ist entscheidend für die meisten physiologische Prozesse und viele pathologische Umstände. Dabei wird Angiogenese durch die Interaktion zwischen der extrazellulären Matrix (ECM) und endothelialen Zellen reguliert. Während der kardiovaskulären Entwicklung im Zebrafisch fördert Klf2, ein blutstrom-sensitiver Transkriptionsfaktor, die VEGF-abhängige Angiogenese. Der Mechanismus, bei dem biophysikalische Reize die Klf2 Expression regulieren und Angiogenese kontrollieren, ist größtenteils unbekannt. In meiner Studie zeige ich, dass erhöhte klf2 mRNA Expression den molekularen und morphogenetischen kardiovaskulären Defekten in Zebrafisch ccm Mutanten zugrundeliegen. Desweiteren zeige ich, dass diese Defekte durch verstärkte egfl7-Expression und Angiogenese vermittelt werden. Meine Studie zeigt ausserdem, dass die Klf2-Expression unabhängig vom Blutstrom durch den Extrazellularmatrix-bindenden Rezeptor beta1 Integrin reguliert wird. Der CCM-Protein-Komplex, zusammen mit dem ihm verbundenden Integrin-regulierenden Protein ICAP-1 verhindert ein verstärktes Angiogenese-Signal in endothelialen Zellen, indem es die beta1 Integrin-abhängige Klf2 Expression begrenzt. Zusammenfassend zeigt meine Arbeit einen neuen beta1 Integrin-Klf2-Egfl7 Signalweg, der durch zerebrale kavernöse malformations (CCM) Proteine reguliert wird / Angiogenesis is critical to most physiological processes and many pathological conditions. This process is controlled by physical interactions between the extracellular matrix (ECM) and endothelial cells. Klf2, a blood flow–sensitive transcription factor, promotes VEGF-dependent angiogenesis during zebrafish cardiovascular development. However, the mechanism by which biophysical stimuli regulate Klf2 expression and control angiogenesis remains largely unknown. In my study, I show that elevated klf2 mRNA levels underlie the molecular and morphogenetic cardiovascular defects in zebrafish ccm mutants. Furthermore, I demonstrate that these defects are mediated by enhanced egfl7 expression and angiogenesis signaling. My study also revealed that Klf2 expression is regulated by the extracellular matrix-binding receptor beta1 integrin in the absence of blood flow. The CCM protein complex and its associated beta1 integrin-regulatory protein ICAP-1 prevents increased angiogenesis signaling in endothelial cells by limiting beta1 integrin-mediated expression of Klf2. ln sum, my work uncovered a novel beta1 integrin-Klf2-Egfl7 signaling pathway, which is regulated by the cerebral cavernous malformations (CCM) proteins.

Die antillanische Flora ist eine der artenreichsten der Erde. Trotz jahrhundertelanger floristischer Forschung zeigen jüngere Studien, daß der Archipel noch immer weiße Flecken beherbergt. Das trifft besonders auf die Familie der Orchideen zu, deren letzte Bearbeitung für Cuba mehr als ein halbes Jahrhundert zurückliegt. Die vorliegende Arbeit basiert auf der lang ausstehenden Revision der Orchideengattung Pleurothallis R. Br. für die Flora de Cuba. Mittels weiterer morphologischer, palynologischer, molekulargenetischer, phytogeographischer und ökologischer Untersuchungen auch eines Florenteils der anderen Großen Antillen wird die Genese der großantillanischen Pleurothallis-Flora rekonstruiert. Der Archipel umfaßt mehr als 70 Arten dieser Gattung, wobei die Zahlen auf den einzelnen Inseln sehr verschieden sind: Cuba besitzt 39, Jamaica 23, Hispaniola 40 und Puerto Rico 11 Spezies. Das Zentrum der Diversität liegt im montanen Dreieck Ost-Cuba - Jamaica - Hispaniola, einer Region, die 95 % der groß-antillanischen Arten beherbergt, wovon 75% endemisch auf einer der Inseln sind. Da die meisten Arten entweder endemisch oder pankaribisch verbreitet sind, bleiben die floristischen Bezüge zwischen den Inseln und zu den kontinentalen Nachbargebieten nur schwach ausgeprägt. Immerhin lassen sich einige Verbindungen unter den Inseln der Großen Antillen und besonders zu Mittelamerika erkennen. Diese Affinitäten steigen von Ost nach West. Molekulargenetische und (mikro-)morphologische Daten zeigen ein deutliches Muster der historischen Biogeographie. Danach lassen sich die antillanischen Arten hinsichtlich ihrer Genese in drei Gruppen einteilen. 25% der Arten sind pankaribisch verbreitet, wobei der Großteil der Inselpopulationen vom mittelamerikanischen Festland stammt. Ebenfalls aus dieser Region stammen weitere 25%, die jedoch auf den Inseln neue Arten gebildet haben. Die verbleibenden 50% der groß-antillanischen Sippen sind autochthon und das Ergebnis adaptiver Radiation auf den Inseln. Diese intensive Kladogenese beschränkt sich auf drei Verwandtschaftskreise innerhalb der Gattung Pleurothallis in den Untergattungen Antilla Luer und Specklinia Lindl. (2 Linien). Es stellte sich heraus, daß der überwiegende Anteil der Artbildungsprozesse allopatrischer Natur ist. Sympatrie konnte nur in einem einzigen Fall direkt belegt werden. Das Ergebnis der allopatrischen Speziation sind zwei Typen von Vikarianz, räumlich geographischer und geologischer. In Cuba sind überraschenderweise fast 80% der endemischen Arten an einen Gesteinstyp gebunden, überwiegend an Serpentin. West-Hispaniola, wo viele Schwesternarten cubanischer Sippen beheimatet sind, besteht fast ausschließlich aus Kalkstein. Geographische Vikarianz ist daher oft geologisch unterlegt, eine Bindung die für Epiphyten kaum vermutet wurde. Hinter der Geologie verbergen sich jedoch eher Bestäuberareale und weniger physiologische Anpassung als limitierender Faktor. Eine Verfrachtung in Vegetation auf anderem petrologischen Untergrund scheint damit der Hauptauslöser für Artbildungen gewesen zu sein. Ausgangspunkt waren höchstwahrscheinlich individuenarme Gründerpopulationen die den Bedingungen eines founder events ausgesetzt waren. Neben den reichen geologischen Verhältnissen im Dreieck Ost-Cuba - Jamaica - Hispaniola wird die intensive Artbildung durch weitere spezifisch lokale Bedingungen unterstützt. Karibische Wirbelstürme dürften entlang der Hauptrouten für eine häufige Verfrachtung von Samen oder Pflanzen von Mittelamerika auf die Großen Antillen sowie zwischen den Inseln selber verantwortlich sein. Ein zweiter günstiger Umstand für erfolgreiche Migration innerhalb des Dreiecks besteht in der räumlichen Nähe der Inselgebirge und deren optimalen klimatischen Bedingungen für die Besiedlung durch mikrophytische Epiphyten. Molekulargenetische Daten lieferten weiterhin wertvolle Informationen in Bezug auf die beiden aktuell diskutierten Systeme der Pleurothallidinae, einer streng morphologischen (Luer) und einer fast ausschließlich auf DNA-Sequenzen (Pridgeon & Chase) basierenden Klassifikation. DNA-Sequenzen der cubanischen Arten stützen das neue System von Pridgeon & Chase weitestgehend, zeigen aber Widersprüche bezüglich der Monophylie in einigen der neuen oder wieder errichteten Taxa. Angesicht dessen, daß die karibische Florenregion leider nicht nur durch ihre Biodiversität zu den zehn globalen hot spots zählt, sondern auch durch die großflächige Zerstörung von Primärvegetation, war es auch ein Anliegen der vorliegenden Arbeit, ein erstes detailliertes Bild von Genese und Verbreitung antillanischer Orchideen zu vermitteln. Diese Daten können direkt für die Gestaltung und das Management von karibischen Schutzgebieten eingesetzt werden, da Orchideen in der Naturschutzpolitik einen hohen Argumentationswert besitzen. / The Antillean Flora is one of the most diverse on our globe. However, despite floristic work for centuries recent studies show that there are still blank areas. This is especially the case in the family Orchidaceae, which, in the case of the Cuban Flora, has been reviewed more than half a century ago for the last time. The work presented here is based on the long pending revision of the genus Pleurothallis R. Br. for the Flora de Cuba. Adding further morphological, palynological, molecular, and ecological data this study is aimed at the reconstruction of the Greater Antillean Pleurothallis flora. The archipelago comprises more than 70 species of this genus, with a differing diversity on the particular islands; Cuba accommodates 39 taxa, Jamaica 23, Hispaniola 40 and Puerto Rico 11. The centre of diversity lies within the triangle E Cuba - Jamaica - W Hispaniola, a region that accommodates about 95% of the Greater Antillean species. 75% of the taxa are confined to just one island. Since most of the plants are either endemic or are of pan-Caribbean distribution floristic relationships among the islands and with regard to neighbouring continental areas remain rather indistinct. The strongest affinities are with Central America. Floristic relationships with that area increase from E towards W. Molecular and (micro-)morphological data show a clear pattern of historical phytogeography. Concerning their origin there are 3 groups of species. 25% of the Greater Antillean taxa are widespread in the Pan-Caribbean area, with the majority of the island populations having their origin presumably on the Central American continent. Another 25% are derived from Central American ancestors too, however, they have evolved into new species on the islands in the course of migration. The remaining 50% of the Greater Antillean taxa are autochthonous. They are the result of adaptive radiation on the archipelago. Intense cladogenesis is confined to 3 lineages within Pleurothallis. They belong to the subgenera Antilla Luer and Specklinia Lindl. (2 lineages). The majority of speciation events shows an allopatric pattern. Sympatry during speciation could be detected in a single case only. Allopatric speciation has resulted into 2 types of vicariance, spatial geographic and geological. Indeed, 80% of the Cuban endemics are associated with a single type of rock, serpentine in most cases. In contrast, W Hispanola where many sister taxa of Cuban pleurothallids live, is formed almost exclusively by limestone. In many cases, geographic vicariance is therefore geologically defined, a surprising association in epiphytic orchids. Geological vicariance, in turn, may have been brought about by pollinator distribution rather than by physiological adaptation to the geological environment. Migration to petrologically different localities seems to be the main trigger for speciation in Cuban Pleurothallis. This process was most probably started with a small number of individuals that met conditions of a founder event. Apart from the geologically rich background in the triangle E Cuba - Jamaica - Hispaniola there are other specific local conditions that are responsible for the rich diversity. Caribbean hurricanes provide a powerful means of transport along their main routes. They should be responsible for frequent migrations from the Central American mainland to the archipelago and between the islands. Moreover, the mountains within the triangle are in close spatial neighbourhood and meet favourable climatic conditions for the colonisation of small epiphytes. Molecular data from the Cuban species of Pleurothallis yielded valuable information for the current discussion concerning the morphological (Luer) and molecular classifications (Pridgeon & Chase) of the subtribe. These data support the new molecular based system to a great extent, however, they show new inconsistencies with respect to monophyly in some of the new or resurrected taxa. Considering that the Caribbean Flora belongs to the ten global hot spots, due to its diversity on the one and the loss of primal vegetation on the other side, it was a goal of the present thesis to impart a detailed picture of the genesis and distribution of Antillean orchids. Bearing in mind the political value of orchids in conservation these data can be used directly for the organisation and management of Caribbean nature reserves.

LRP2/Megalin ist ein Rezeptor der LDL-Rezeptor Genfamilie mit essentieller Funktion in der Entwicklung des Zentralnervensystems. Der Rezeptor wird im Neuroepithel des Embryos exprimiert und steuert die Ausbildung der Vorderhirnstrukturen. In weiteren Untersuchungen an LRP2-defizienten Mäusen konnte ich zeigen, dass der Verlust der Expression des Rezeptors in adulten Tieren zu einer Beeinträchtigung der Proliferation neuronaler Vorläuferzellen in der subventrikulären Zone (SVZ) des lateralen Ventrikels führt. Infolgedessen war die Anzahl der Neuroblasten reduziert, die zum olfaktorischen Bulbus wandern und dort zu Interneuronen differenzieren. Anhand immunhistologischer Untersuchungen konnte ich nachweisen, dass der Verlust von LRP2 zu einer verminderten Anzahl GFAP-positiver Zellen, die auch die neuronalen Stammzellen (Typ B Zellen) umfassen, führt. Weiterhin wiesen LRP2 Mutanten eine Reduktion in den Signalen für Nestin, DLX2, PSA-NCAM und DCX. Meine derzeitige Hypothese besagt daher, dass LRP2 ebenso wie im embryonalen Neuroepithel auch in der adulten neuronalen Stammzellnische eine Rolle bei der Regulation der BMP4 Signalwege spielt. Dies wird möglicherweise durch Endozytose-vermittelte Aufnahme mit anschließendem Abbau des Morphogens durch LRP2 vermittelt, wie es bereits in vitro gezeigt werden konnte. BMP4 hat im Wesentlichen eine anti-proliferative Wirkung. Eine exakt gesteuerte Regulation der Konzentration dieses Morphogens ist daher eine Vorraussetzung für ein Neurogenese-permissives Milieu in der adulten neurogenen Stammzellnische. Die Ergebnisse meiner Arbeit entschlüsseln eine neue Rolle von LRP2 in der adulten Neurogenese. Die Expression des Rezeptors im Ependym des lateralen Ventrikels ist essentiell für die Regulation der BMP Signalwege in der neurogenen Stammzellnische. / LRP2 (also know as megalin) is a member of the low-density lipoprotein receptor gene family that plays an important role in regulation of neurogenesis in the embryonic neural tube. During early forebrain development, LRP2 deficiency leads to an increase in bone morphogenetic protein 4 (Bmp4) expression and signalling in the dorsal neuroepithelium, and a loss of sonic hedgehog (Shh) expression in the ventral forebrain. In this thesis I demonstrate that LRP2 is expressed in ependymal cells of the lateral ventricles in the adult brain. Intriguingly, expression is restricted to the ependyma that faces the stem cell niche. Expression is not seen in ependyma elsewhere in the lateral ventricles or in the dentate gyrus, the second neurogenic zone of the adult mouse brain. I further show that lack of LRP2 expression in adult mice results in impaired proliferation of neural precursor cells in the SVZ resulting in a decreased number of neuroblasts reaching the olfactory bulb. Using immunohistological detection of marker proteins, absence of LRP2 was shown mainly to affect the GFAP-positive neuronal precursor cell population in the SVZ (B cells). Furthermore, Lrp2 mutant mice also showed a decrease in the signals for nestin, DLX2, PSA-NCAM and DCX. Reduced neurogenesis in the SVZ in LRP2-deficient mice coincides with a significant increase in BMP2/4 expression and enhanced activation of downstream mediators Phospho-SMAD1/5/8 and ID3 in the stem cell niche. My findings revealed a novel regulatory pathway whereby LRP2 down-regulates BMP signaling to modulate the instructive microenvironment of the SVZ and to enable adult neurogenesis to proceed. Thus, LRP2 plays a crucial role in regulating BMP-signaling levels in the adult SVZ, highlighting the unique role of ependymal cells in this stem cell niche. The underlying mechanism of LRP2 action in control of neurogenesis may thus be conserved between the embryonic and adult brain.

Toxoplasma gondii ist wohl der am besten an den Menschen und Tieren angepasste Parasit der Welt und eine der Hauptursachen für Abtreibungen und opportunistsiche Infektionen. Das Verständnis der Stoffwechselflexibilität dieses Parasiten ist essentiel um seine Anpassungsfähigkeit nachzuvollziehen. Lipide sind Grundbestandteile der biologischen Membranen. Doch in den letzten Jahrzehnten sind neben der Biogenese der Membranen noch weitere Funktionen entdeckt worden. Hier berichten wir zum ersten Mal über Phosphatidylthreonin (PtdThr) als Hauptphospholipid von T. gondii und zeigen seine Beziehung mit seinem archetypischen Analogon, Phosphatidylserin (PtdSer). Wir identifizieren auch ein neues Parasitenenzym (TgPTS), welches von der regulären PtdSer-Synthase-Familie abgewichen ist und dieses sonst selten vorkommende Lipid synthetisiert. Die Gendeletion von TgPTS stoppte nicht nur die Synthese von PtdThr, sondern auch stark beeinträchtigt den lytischen Zyklus von T. gondii, insbesondere beim Aus- und Eintritt in die Wirtszellen, ohne dabei die Replikation des Parasiten zu verhindern. Unsere Arbeit zeigt, dass entweder ein niedriger Ca2+-Pool oder eine verminderte Ca2+-Mobilisierung aus dem endoplasmatischen Retikulum des Parasiten eine reduzierte Motilität verursachen, welche den beobachteten Phänotypen zugrunde liegt. Darüber hinaus fehlt es den mutierten Parasiten an PtdThr (Δtgpts), sie sind avirulent und üben vollständigen Schutz gegen akute und chronische Toxoplasmose in einem Mausmodell aus. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung der Parasitenlipide als therapeutisches Ziel und von genetisch abgeschwächten Stämmen für die Entwicklung von wirksamen Impfstoffen gegen Kokzidien. / Toxoplasma gondii is arguably the most succesful parasite in Earth and a major cause of abortion and opportunistic infections in humans and livestock. Understanding the metabolic flexibility of this parasite is essential to comprehend its adaptability. Lipids are basic components of biological membranes. However, in the last decades non-customary roles for lipids beyond membrane biogenesis have been recognized. Here we report for the first time phosphatidylthreonine (PtdThr) as a major phospholipid in T. gondii and show its relationship with its archetypical analog, phosphatidylserine (PtdSer). We also identify a novel parasite enzyme (TgPTS), which diverged from the mainstream PtdSer-synthase family to produce this otherwise rare lipid. Genetic ablation of TgPTS not only abolished PtdThr synthesis, but also impaired severely the lytic cycle of T. gondii, particularly the egress but also the invasion into host cells without affecting the parasite replication. Our work indicates that, either a lower Ca2+ pool and/or a diminished Ca2+ mobilization from the parasite endoplasmic reticulum cause a reduced gliding motility, which underlies the observed phenotypes. Moreover, the mutant parasites lacking PtdThr (Δtgpts) are avirulent and exert full protection against both, acute and chronic toxoplasmosis in a murine model. These results highlight the importance of parasite lipids as therapeutic targets and of genetically-attenuated strains in the development of effective vaccines against coccidian parasites.

Selbstreproduktion ist eines der Kennzeichen aller lebenden Organismen. Der Zellzyklus dient der Selbstreproduktion in einzelligen Organismen. In mehrzelligen Organismen ist der Zellzyklus darüber hinaus für andere lebenswichtige Prozesse, einschließlich Immunreaktionen, unerlässlich. In dieser Arbeit wird eine Methode entwickelt mit der die Dauer der Zellzyklus Phasen bestimmt werden kann. Kenntnis über die Zellzyklusphasendauer ermöglicht vorherzusagen, wie schnell eine Population von proliferierenden Zellen wachsen wird, oder wie viele neue Zellen pro Stunde in einem Gewebe geboren werden. Im Kapitel 1 dieser Arbeit wird ein Zellzyklusmodell aufgestellt und mit experimentellen Bromdesoxyuridin Daten verglichen. Die Analyse zeigt, dass das Modell gut die experimentelle Kinetik beschreibt, hebt jedoch auch hervor dass einige der Parameter nicht identifiziert werden können. Dieses Problem wird in Kapitel 2 bearbeitet, wo zwei Ansätze erforscht werden, um den Informationsgehalt der Experimente zu erhöhen. In einem ersten Ansatz wird die Theorie der Versuchsplanung angewendet, um optimale Versuchspläne zu bestimmen. In einem zweiten Ansatz wird das übliche Bromdesoxyuridin Protokoll durch ein zweites Nukleosid erweitert. Beide Methoden verbessern in silico erheblich die Genauigkeit und Präzision der Abschätzungen. Im dritten Kapitel wird die Methodik in der Analyse der Keimzentrumsreaktion angewendet. Ein erheblicher Zufluss von Zellen in die dunkle Zone von Keimzentren wird vorhergesagt, und die Ansicht einer extrem schellen Zellteilung im Keimzentrum erscheint in dem Modell als ein Artefakt der Zellmigration. / Self-reproduction is one of the distinguishing marks of living organisms. The cell cycle is the underlying process by which self-reproduction is accomplished in single-celled organisms. In multi-cellular organisms, the cell cycle is in addition indispensable for other vital processes, including immune reactions. In this thesis a method is developed that allows to estimate the time it takes for a dividing cells to complete the CC phases. Knowledge of the CC phase durations allows to predict, for example, how fast a population of proliferating cells will grow in size, or how many new cells are born per hour in a given tissue. In Chapter 1 of this thesis, a cell cycle model with delays and variability in the completion times of each phase is developed. Analytical solutions are derived to describe a common experimental technique used for cell cycle analysis, namely pulse labeling with bromodeoxyuridine (BrdU). Comparison with data shows that the model reproduces closely measured cell cycle kinetics, however also reveals that some of the parameter values cannot be identified. This problem is addressed in Chapter 2. In a first approach, the framework of D-optimal experimental designs is employed, in order to choose optimal sampling schemes. In a second approach, the prevailing protocol with a single nucleoside is modified by adding a second nucleoside analog pulse. Both methods are tested and the results suggest that experimental design can significantly improve parameter estimation. In Chapter 3, the model is applied to the germinal center reaction. A substantial influx of cells into the dark zone of germinal centers is predicted. Moreover the wide-held view of rapid proliferation in germinal centers, appears, under this model, as an artifact of cell migration.

Die Verdaulichkeit langsam abbaubarer Pflanzenbestandteile (Cellulose) steigt mit zunehmender Partikelverweilzeit im Vormagen von Wiederkäuern. Die Ingestaverweilzeit im Magen-Darm-Kanal ist abhängig von der Größe der Fermentationskammern, der Nahrungsaufnahme, vom Speichelfluß und von der selektiven Retention von Futterpartikeln. Die mittlere Retentionszeit (MRT) von Flüssigkeit und Partikeln müßte sich zwischen den Tierarten unterscheiden und saisonbedingt in Abhängigkeit von der Qualitüt und des Angebotes der Nahrung verändern. Mit der Messung der Ingestapassage an Rehen als Konzentratselektierer im Vergleich zu Mufflons als Grasfresser werden Faktoren der Anpassung an das jahreszeitlich wechselnde Nahrungsangebot dieser verschiedenen Wildtierarten untersucht. Voraussetzung für die Durchführung der Versuche war die Handaufzucht von sechs Rehkitzen und fünf Mufflonlämmern. Den Tieren wurde zum dorsalen Pansensack eine Vormagenkanüle implantiert. Die Haltung der Tiere erfolgte in Gehegen mit natürlicher Vegetation. Den Rehen und Mufflons wurden über die Vormagenfistel ein Marker für Flüssigkeit (Co-EDTA) und ein Marker für Partikel (Chrom-markiertes Heu) verabreicht. Anschließend wurde 5 Tage regelmäßig alle 3 bis 4 h Kot gesammelt. Die Co-/Cr-Konzentrationen der mit Schwefelsäure aufbereiteten Proben wurden atomabsorptionsspektrometrisch gemessen. Die Berechnung der Retentionszeiten der Flüssigkeit und Partikel im Gastro-Intestinal-Trakt (GIT) und im Ruminoretikulum (RR) erfolgte nach Thielemans et al. (1978), nach Grovum und Williams (1973) und Lechner-Doll (1990). Derartige Untersuchungen wurden erstmals unter annähernd natürlichen Bedingungen vergleichend an Rehen und Mufflons durchgeführt. Die Gesamtverweildauer von Flüssigkeit und Partikeln im Gastro-Intestinal-Trakt war beim Reh (MRTFlüss.GIT = 18,1 ± 2,4 h, MRTPart.GIT = 23,6 ± 3,8 h) im gesamten Jahresverlauf kürzer als beim Mufflon (MRTFlüss.GIT = 22,5 ± 3,9 h, MRTPart.GIT = 36,0 ± 4,2 h). Die Partikelverweilzeit im Ruminoretikulum beim Reh betrug MRTPart.RR =13,9 ± 3,1 h und beim Mufflon MRTPart.RR = 24,8 ± 3,0 h. Flüssigkeit verweilte im Ruminoretikulum beim Reh MRTFlüss. RR = 8,0 ± 1,0 h und beim Mufflon MRTFlüss.RR = 11,5 ± 2,0 h. Bei beiden Tierarten waren die Retentionszeiten der Ingesta im Gastro-Intestinal-Trakt erheblichen jahreszeitlichen Schwankungen unterworfen. Sie waren im Herbst bei erhöhter Nahrungsaufnahme verkürzt und im Winter durch eine Reduzierung des Stoffwechsels und der Aufnahme von Pflanzen mit geringerer Verdaulichkeit verlängert. Rehe haben im Gegensatz zu Mufflons einen relativ kleinen Vormagen, weite Verzögerungsstrukturen und einen hohen Speichelfluß, was die kurze Ingestaverweildauer verursachen kann. Aufgrund der kurzen Verweilzeit der Partikel im Ruminoretikulum haben Rehe schlechtere Voraussetzungen für die Verwertung von cellulosehaltigen Pflanzen. Beim Mufflon hingegen schaffen lange Verweilzeiten von Nahrungspartikeln im Ruminoretikulum immer günstige Bedingungen für die Einbeziehung der Cellulose in die energetische Nutzung. Die sich saisonal verändernden Retentionszeiten der Ingesta im Gastro-Intestinal-Trakt machen die Anpassungsfähigkeit beider Tierarten an das jahreszeitlich wechselnde Nahrungsangebot deutlich. / The digestibility of slowly fermentable/digestible plant material (cellulose) increases with increasing particle retention time in the forestomach of ruminants. The retention time in the gastro-intestinal-tract depends on the size of the fermentation chambers, the food intake, the saliva flow and the selective retention of food particles. The mean retention time (MRT) of fluid and particles should differ between ruminant species and, according to differences in food quality and availability, between seasons. By measuring the ingesta passage rate of roe deer, a concentrate selector, in comparison with mouflon, a grass and roughage eater, adaptation factors of these different species to the seasonally changing forage supply were investigated. A prerequisite for the trials was the hand-rearing of six roe deer fawns and five mouflon lambs. Rumen fistulas were implanted in all adult animals leading to the dorsal ruminal chamber. The animals were kept in adequate enclosures with natural vegetation. A fluid (Co-EDTA) and a particle (Cr-mordanted fibre) marker were applied to roe deer and mouflons via the rumen fistula. After marker application, faecal samples were collected every 3 to 4 hours for 5 days. Faecal samples were prepared with sulphuric acid and the Co- and Cr-concentrations were measured by atomic absorption spectrophotometry. The retention time of fluid and particle phase in the gastro-intestinal-tract and in the ruminoreticulum were calculated according to Thielemans et al. (1978), Grovum und Williams (1973) und Lechner-Doll (1990). Such investigations were carried out for the first time under natural conditions comparing roe deer and mouflons. The total retention time of fluid and particles in the gastro-intestinal-tract was for roe deer (MRTfluid GIT = 18,1 ± 2,4 h, MRTpart.GIT = 23,6 ± 3,8 h) shorter than for mouflon (MRTfluid GIT = 22,5 ± 3,9 h, MRTpart.GIT = 36,0 ± 4,2 h ) during the whole year. The retention time of particles in the ruminoreticulum was for roe deer MRTpart.RR = 13,9 ± 3,1 h and for mouflon MRTpart.RR = 24,8 ± 3,0 h. Fluid remained in the ruminoreticulum of roe deer for MRTfluid RR = 8,0 ± 1,0 h and of mouflon for MRTfluid RR = 11,5 ± 2,0 h. For both species, the ingesta retention time in the gastro-intestinal-tract showed significant seasonal fluctuations. They were shorter during autumn, when the animals showed an increased food intake, and longer in winter due to a reduction in both metabolic rate and ingestion of forage of low digestibility. Roe deer, in contrast to mouflon, have a ruminoreticulum characterized by relatively small size and large openings. This anatomy of the ruminoreticulum and the high saliva flow may be the reasons for the short ingesta retention time in the gastro-intestinal-tract of roe deer. Due to the short retention time of particles in the ruminoreticulum roe deer are more limited in their capacity to digest cellulose-containing plants. However longer retention time of food particles in the ruminoreticulum of mouflon provides favourable conditions for cellulose fermentation in all seasons. The seasonally variable ingesta retention time in the gastro-intestinal-tract are an expression of the adaptability of both species to the seasonally fluctuating food supply.

Zusammenfassung in PDF Zielstellung: Der biologische Botenstoff N ist von signifikanter Bedeutung für die Funktionsfähigkeit des Herz-Kreislauf-Systems. Pathologische Bedingungen sind oft auf eine veränderte Verfügbarkeit von N zurückzuführen. Das Verständnis der Regulierung der N-Bildung durch Endothelzellen (EC) und die nachfolgende N-Chemie im gesunden und kranken Organismus ist deshalb essentiell, jedoch längst nicht vollständig. Das Ziel dieser Dissertation war aus diesem Grund Untersuchungen zum Schutz von N vor der Wechselwirkung mit S (durch SOD-mimetische Nitroxide), sowie zum Effekt des Membranpotentials (Em) und des Zellwachstums (Proliferation) auf die Aktivität der endothelialen N Synthase (eNOS) an Kulturen von Atrium-Endothelzellen des Rindes (BAtEC). Methoden: Zum empfindlichen und spezifischen Nachweis von N wurde die ozon-vermittelte N-Chemolumineszenz (N-CL) evaluiert, modifiziert und an verschiedene in vitro Systeme angepaßt. Die N-CL wurde auf Grundlage des durch SOD hemmbaren Abbaus von N durch S als ein neuartiger Ansatz zur Bestimmung physiologisch niedriger Konzentrationen an S vorgeschlagen. Ergebnisse: Die Nitroxide -hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl und 3-ethoxycar-bonyl-proxyl erhöhten die N-Konzentration durch ihre SOD-mimetische Wirkung in Modellsystemen von 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) und Kulturen von BAtEC. Mittels ESR-Spin-Trap Untersuchungen an Lösungen von SIN-1 wurde die Bildung von H-Addukten durch Dismutierung von S bestätigt, Peroxynitrit wurde als Quelle ausgeschlossen. Modulierung des Em (durch Veränderung der extrazellulären K + -Konzentration) beeinflußte die endotheliale N-Freisetzung; Hyperpolarisierung erhöhte, Depolarisierung verminderte die N Produktion. Inhibierung der elektrogenen Na + -K + ATPase induzierte synchrone Oszillationen der endothelialen N-Freisetzung. Die systematische Untersuchung zu EC-Wachstum/Proliferation zeigte keine Änderung der N-Produktion (in Gegenwart von SOD). Jedoch war die Menge von verfügbarem N (in der Abwesenheit von SOD) niedrig in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Die Expression der eNOS erhöhte sich mit der Kultivierungsdauer und erreichte ein Maximum bei Konfluenz. Die relative eNOS-Aktivität (N, 2-, und L-citrulline-Produktion pro eNOS-Protein) war am größten in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Schlußfolgerungen: Die Wechselwirkung mit S ist kritisch für die Halbwertszeit von N. Aus der durch diese Studie gezeigten Erhöhung von N in biologischen und chemischen Modellsystemen kann geschlußfolgert werden, daß Nitroxide unter Bedingungen einer S-bedingten Verminderung von verfügbarem N pharmakologische Wirksamkeit besitzen könn-ten. Untersuchungen ergaben den Nachweis zur Em-abhängigen Modulierung der endothelialen N-Freisetzung. Dies liefert eine Erklärung für die Em-bedingten Veränderungen des Gefäßto-nus, nachgewiesen während physiologischer Zellstimulierung, aber auch unter pathologischen Bedingungen. Untersuchungen zu EC-Wachstum/Proliferation lieferten den Beweis für die Ver-minderung von verfügbarem N in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC durch endogen gebildetes S. Die Expremierung von eNOS war proliferationsabhängig. Die spezifische eNOS-Aktivität war in proliferierenden BAtEC erhöht (wahrscheinlich durch post-translationale Verän-derungen) und in ruhenden BAtEC erniedrigt (wahrscheinlich durch Substrat- oder Kofaktormangel). / abstract in pdf Objective: The biological messenger n is of significant importance for the functionality of the cardiovascular system. Pathological conditions are often attributed to an altered availability of n. The understanding of the regulation of n formation by endothelial cells (EC) and the concomitant chemistry of n in health and disease is therefore essential but far from being complete. The objective of this dissertation was therefore to study in culture systems of bovine atrial endothelial cells (BAtEC) the protection of n from the interaction with S by SOD-mimetic nitroxides, and the effect of the membrane potential (Em) and cell growth/proliferation on the activity of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Methods: For the sensitive and specific detection of n, the ozone-mediated n chemiluminescence (n-CL) was evaluated, modified and adapted to various in vitro systems. Due to the SOD-inhibitable degradation of n by S , the n-CL was proposed as a novel approach to quantify the physiological low levels of S . Results: The nitroxides 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl, and 3-ethoxycarbonyl-proxyl increased the n concentration by their SOD-mimetic action in a model system of 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) and cultures of BAtEC. EPR spin trapping in SIN-1 solution revealed the formation of H adducts due to dismutation of S and not via decomposition of peroxynitrite. Changes in Em (by alteration of the extracellular K + concentration) affected the endothelial n release; membrane hyperpolarization increased, membrane depolarization decreased the n production. Inhibition of the electrogenic Na + -K + ATPase induced synchronous oscillations in endothelial n liberation. The systematic investigations on EC growth/proliferation showed no change in total n production (in the presence of SOD). However, the bioavailable n (in the absence of SOD) was low in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Expression of eNOS increased with culture duration with a maximum at confluence. Relative eNOS activity (n, 2, and L-citrulline production per eNOS protein) was highest in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Conclusions: The interaction of S is critical for the half-life of n. With the increase of n in biological and chemical model systems shown by this study, nitroxides might exert pharmacological potential under conditions of S -mediated diminution of bioavailable n. Experimental evidence was shown for the Em-dependent modulation of endothelial n formation. It supports an explanation for the Em-mediated changes of vascular tone, as demonstrated for physiological cell stimulation but also under pathological conditions. Investigations on the EC growth/proliferation provided evidence that BAtEC-derived S decreases bioavailable n in preconfluent, highly proliferating BAtEC, whereas expression of eNOS is proliferation-dependent. The specific eNOS activity is upregulated in proliferating BAtEC (probably via post-translational modifications) and down-regulated in quiescent BAtEC (probably via substrate or cofactor limitations).

Phagozyten entfernen apoptotische Zellen während der Entwicklung und beseitigen Pathogene im Immunsystem. Die zugrundeliegenden molekularen und zellulären Mechanismen, insbesondere die Unterschiede zwischen Makrophagen und nicht-professionellen Phagozyten wie Gliazellen, sind weitestgehend unklar. Wir haben neuartige Zellkultur-basierte Assays entwickelt, um 86 Kandidatengene zu testen, die wir aus der Literatur sowie unserem Expressions-Profiling in embryonalen Gliazellen von Drosophila melanogaster zusammengestellt haben. Die Genfunktion wurde durch RNAi herabgesenkt und die Phagozytoseeffizienz wurde mittels FACS untersucht; um die funktionelle Spezifität der Gene zu messen, haben wir nicht nur apoptotische Zellen, sondern auch Bakterien und Beads als „Essen“ angeboten. Mit Hilfe von Null-Mutanten und transgenem RNAi wurden die Ergebnis in vivo validiert. Um die Phagozytose apoptotischer Zellen testen, haben wir untersucht, wie Makrophagen und Gliazellen tote Zellen während der Embryonalentwicklung entfernen, während zur Untersuchung der bakteriellen Phagozytoze adulte Fliegen mit Bakterien infiziert wurden. Unser Screen liefert einen Querschnitt durch die verschiedenen Schritte der Phagozytose. In Bezug auf die Erkennung apoptotischer Zellen finden wir sowohl bekannte als auch neue Akteure für Makrophagen und Gliazellen. Außerdem zeigen wir, dass Vesikeltransport für die Phagozytose apoptotischer Zellen erforderlich ist. Überraschenderweise werden Rezeptoren zur Bakterienerkennung auch für apoptotische Zellen benötigt. Umgekehrt sind Apoptose- Rezeptoren auch für bakterielle Phagozytose notwendig, wodurch eine grundlegende Kreuz-Spezifität zutage tritt. Unsere Arbeit liefert die erste systematische und vergleichende Analyse der verschiedenen Phagozytosearten. Durch die Identifizierung vieler neuer Faktoren legt diese Arbeit den Grundstein für ein mechanistisches Verständnis der Phagozytose von apoptotischen Zellen und Bakterien durch Makrophagen und Gliazellen. / Phagocytes remove apoptotic cells during development and eliminate pathogens in the immune system. The underlying molecular and cellular mechanisms, particularly the differences between macrophages and non-professional phagocytes like glia, are not well understood. We used novel cell-based assays to screen phagocytic function of candidate genes assembled from literature and our genome-wide transcription profiling of Drosophila melanogaster embryonic glia. Gene function was knocked-down by RNAi and phagocytic efficiency assessed by flow cytometry; to explore functional specificity, we offered not only bacteria, but also apoptotic cells and beads as ''food''. To validate results in vivo, we analysed glial clearance of apoptotic neurons in embryonic development and immune clearance of bacteria in adult flies using both genetic mutants and transgenic RNAi. Our screen provides a cross section of the different steps of phagocytosis from recognition to engulfment and phagosomal degradation. For the recognition of apoptotic cells, we confirm the involvement of known factors, such as the chaperone Calreticulin and PS-binding Annexin, and identify new players, such as NIMA for macrophage and Megalin for glial corpse clearance. We find components associated with vesicular trafficking including the v-SNARE Synaptobrevin and the cytochrome Cyp4g15 to be required for corpse clearance. Unexpectedly, receptors known for bacterial recognition, such as PGRP-LC and TEP2, are also strongly required for apoptotic clearance. Conversely, receptors previously implicated in apoptotic cell recognition are also required in bacterial clearance (SIMU, Draper), revealing cross-specificity of the system. Our work represents the first systematic and comparative assessment of the molecular repertoire of different types of phagocytosis, and, with the identification of many new players, lays the groundwork for a mechanistic dissection of bacterial and corpse clearance by glia and macrophages.

Das Ziel dieser Studie war, die Anzahl der Mastomys-Arten und ihrer geographischen Verbreitung in Namibia und Teilen von Botswana und Angola zu bestimmen. Der methodische Ansatz umfasst Schädel-Morphometrie, Karyotypisierung und Cytochrom-b-Gen-Sequenzierung. Traditionellen Morphometrie-Studie lieferten keine klaren morphologischen, wohingegen die geometrische Morphometrie-Analyse erfolgreicher war. Hier zeigten die Ergebnisse bei drei Spezies deutliche dorsale und ventrale Unterschiede in der Schädelform. Die Resultate der zytogenetischen und molekularen Methoden ergaben drei Formen von Mastomys mit unterschiedlichen Karyotypen und mtDNA. Diese wurden M. coucha (2n = 36, aFN = 60/60), M. natalensis (2n = 32, aFN = 57/58) und M. shortridgei (2n = 36, aFN = 51/52) zugeordnet. Die mtDNA Divergenz zwischen der Art M. coucha und M. shortridgei war relativ gering (1.3%), außerdem legte die „Moleküluhr“ (molecular clock) nahe, dass M. shortridgei ein aktueller Ableger von M. coucha (0.71 Mya) ist. Man nimmt an, dass der Paläo-Makgadikgadi See, im heutigen Botswana einen Großteil des östlichen Kalahari-Beckens bedeckte. Es könnte sein, dass Ausläufer früherer Populationen von M. shortridgei in Kontakt mit dem Paläo-Makgadikgadi See kammen und während des End-Pleistozäns bis zum frühen Holozän durch das Schrumpfen des Sees isoliert wurden. Im Laufe der Zeit haben sich die frühen Populationen von M. shortridgei an die lokalen sumpfigen Umweltbedingungen angepasst. M. coucha und M. natalensis haben eine klar begrenzte geografischen Verteilung in Namibia, dies scheint durch Niederschlag beeinflusst zu sein: M. coucha tritt vor allem in den niederschlagsarmen Gebieten von Zentral-Namibia auf, M. natalensis dagegen in den niederschlagsreichen Gebieten im nördlich-zentralen und nordöstlichen Namibia und erstreckt sich bis nach Angola und in das nördliche Botswana hinein. Die M. shortridgei-Proben wurden nur in den Okavango-Sümpfen gefunden. / Study aims to summarise the patterns of morphological, cytogenetic and genetic variation of genus Mastomys across the south-west arid region of southern Africa. The methodological approach included skull morphometrics, karyotyping and cytochrome-b gene sequencing. Traditional morphometrics study did not yield clear morphological differences between the three species. Geometric morphometrics analysis was more successful with clear differences, in the shape of the skulls based on landmarks from both the dorsal and ventral views. Results obtained with cytogenetical and molecular methods revealed three forms of Mastomys with different karyotypes and mtDNA clades. These were assigned to M. coucha (2n = 36, aFN = 60/60), M. natalensis (2n = 32, aFN = 57/58) and M. shortridgei (2n = 36, aFN = 51/52). The mtDNA divergence between the species M. coucha and M. shortridgei was relatively low (1.3%), additionally the molecular clock estimated M. shortridgei to be a recent off-shoot of M. coucha (0.71 Mya). It is estimated that the lake Palaeo-Makgadikgadi, in present day Botswana, covered much of the eastern Kalahari basin. It could be that the peripheral ancestral population of M. shortridgei came in contact with the lake Palaeo-Makgadikgadi and was isolated with the shrinking lake Palaeo-Makgadikgadi during the End-Pleistocene to Early Holocene. Over time ancestral populations of M. shortridgei became adapted to the local swampy environmental conditions. M. coucha and M. natalensis have distinct geographical distribution influenced by precipitation. M. coucha mainly occurs in the low rainfall areas of central Namibia, whereas M. natalensis occurs in higher rainfall areas of north-central and north-eastern Namibia, extending into Angola and northern Botswana. The M. shortridgei specimens were only trapped along the Okavango River swamps in northern Botswana and south-eastern Angola.

Mikrogliazellen stellen die professionellen Phagozyten des zentralen Nervensystems dar und sind maßgeblich bei der Entfernung apoptotischer Neurone aus dem Gewebe beteiligt. Die Erkennungsmechanismen, die zu einer Erkennung und Phagozytose apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen führen, sind bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines Kokulturmodells die Erkennungsmechanismen zwischen primären Mikrogliazellen und apoptotischen Kleinhirnneuronen untersucht. Der apoptotische Zelltod, charakterisiert durch Schrumpfung und Fragmentation der Neuron, durch Kondensation des Chromatins, durch Fragmentation der DNA und durch Präsentation von Phosphatidylserin auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran, wurde in den Kleinhirnneuronen durch eine Behandlung mit 100 µM S-Nitrosocystein induziert. Es konnte gezeigt werden, daß apoptotische Neurone keine löslichen Substanzen sekretierten, die chemotaktisch auf Mikrogliazellen wirken. Dies zeigt, daß die Erkennung apoptotischer Neurone über Zell-Zell-Kontakte erfolgt. Zur Untersuchung der beteiligten Erkennungsmechanismen wurden Mikrogliazellen zwei Stunden nach der Induktion des apoptotischen Zelltods zu den Neuronen gegeben und für sechs Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von Liganden kultiviert, die mögliche Rezeptoren zur Erkennung von apoptotischen Neuronen inhibieren. Die Bindung/Phagozytose der apoptotischen Kleinhirnneurone durch Mikrogliazellen wurde mit einer kombinierten DAPI/Propidiumjodid (für apoptotische/nekrotische Zellen) und einer Lektin Färbung (für Mikrogliazellen) durch Auszählung bestimmt. Die Aufnahme apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen wurde durch Galaktose und N-Acetylglukosamin reduziert, was auf eine Erkennung apoptotischer Zellen durch Lektine hindeutet. Weiterhin weist der inhibitorische Effekt von RGDS-Peptiden auf die Bindung/Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen auf eine Erkennung durch ein Vitronektinrezeptor hin. Da Mikrogliazellen spezifisch Lipidvesikel, die mit Phosphatidylserin angereichert waren, binden und O-Phospho-L-Serin die Aufnahme von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen deutlich inhibierte, erfolgte die Erkennung apoptotischer Neurone hauptsächlich durch einen Phosphatidylserin Rezeptor. Die Expression des PS-Rezeptors auf Mikrogliazellen ist unabhängig vom Aktivierungszustand der Mikrogliazellen in vitro. Die Bindung von PS ist mit einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in der Mikrogliazelle verbunden und führt nicht zu einer sekretorischen Aktivierung der Mikrogliazelle. Da Astrozyten ebenfalls einen PS-Rezeptor exprimieren, könnten sie als semiprofessionelle Phagozyten ebenfalls eine Bedeutung bei der Aufnahme apoptotischer Neurone einnehmen. Diese Ergebnisse zeigen, daß apoptotische Neurone ein komplexes Oberflächenmuster exprimieren, welches durch unterschiedliche Rezeptorsysteme der Mikrogliazelle erkannt werden kann. Die Erkennung von PS auf apoptotischen Neuronen durch Mikroglia scheint bei diesen untersuchten Rezeptorsystemen die wichtigste Rolle zu spielen. / Microglia are the professional phagocytes of the central nervous system and play a crucial role in removal of apoptotic neurons out offrom the tissue. The recognition mechanisms leading to the recognition and phagocytosis of these apoptotic neurons by microglia are not yet characterized. Here IIn the present work established a co-culture model was established to examine the receptor systems involved in the recognition of apoptotic cerebellar neurons by primary microglia. Treatment with 100 µM S-nitrosocysteine induced apoptosis of cerebellar neurons as indicated by condensation and fragmentation of the neurons, condensation of the chromatin, fragmentation of the DNA and phosphatidylserine exposure to the exoplasmic leaflet of the plasma membrane. It was shown that apoptotic neurons do not release soluble signals that serve to attract microglia. Consequently, contact-dependent interaction between the microglial cell and the apoptotic neuron is required for recognition. For the examination of the receptor systems involved in recognition, microglial cells were added to neurons 2 h after induction of apoptosis induction and co-cultured for 6 h in the presence of ligands that inhibit recognition by binding to their respective receptors. Binding/phagocytosis was determined after combined DAPI/propidium iodide (for apoptotic/necrotic neurons) and lectin staining (for microglia). Uptake of neurons was reduced by galactose or N-acetylglucosamine, suggesting that recognition involves lectins. Furthermore, the inhibition of microglial binding/uptake of apoptotic neurons by RGDS peptide suggesteds a rolethe involvement of a microglial vitronectin receptor. The selective Binding of phosphatidylserine-enriched lipid vesicles on microglial cells and the strong interference of O-phospho-L-serine with the uptake of apoptotic neurons was indicative of an important role for the phosphatidylserine receptor (PS-receptor)As microglia selectively bind lipid vesicles enriches in phosphatidylserine and O-phospho-L-serine interfered in a strong way with the uptake of apoptotic neurons, the recognition of apoptotic neurons is manly dependent on a phosphatidylserine receptor. The expression of the PS-receptor is independent of the activation state of the microglial cell in vitro. The bindigbinding of PS induces an elevation of the intracellular calcium concentration in the microglia but doesid not induce an activationsectretion of (Liste der getesteten Zytokine einsetzen) of the microglial cell in an secretory way. Because of the expression of a PS-receptor, Astrocytes could also play a role in the uptake of apoptotic neurons as semiprofessional phagocytes. In summaryCollectively, these results suggest that apoptotic neurons generate a complex surface signal recognized by different receptor systems on microglia. The recognition of PS on the surface of apoptotic neurons by microglial cells seems to play a major role in the recognition of these apoptotic neuronscells..